دراسة الحمض النووي حاجز الضرر باستخدام

الهدف العام من هذا الإجراء هو استقصاء نقطة تفتيش تلف الحمض النووي DNA باستخدام مستخلصات بويضات xip كنظام نموذجي. أولاً، يتم تحضير مستخلص منخفض السرعة من بويضات xip. ثم يتم تحضير كروماتين حيوانات منوية تالف باستخدام طرق إتلاف الحمض النووي DNA مثل MMS والأشعة فوق البنفسجية UV light.

قم أيضاً بتحضير البنية التي تحاكي تلف DNA. يتم استخدام a T 70 لتحفيز نقطة تفتيش تلف DNA في LSE باستخدام كروماتين الحيوانات المنوية التالف أو a T 70. وفي النهاية، يمكن لنتائج لطخات البروتين (blots) أن توفر رؤى حول نقطة تفتيش تلف DNA التي يتوسطها a TR check one في مستخلص بيض Xenopus.

أهلاً بكم. معكم CH Y من قسم الأحياء في جامعة UNC Charlotte. سنعرض لكم اليوم كيفية استخدام مستخلص الصديد كنظام نموذجي لدراسة مسارات إشارات تلف نقطة التقنية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال عدم الاستقرار الديناميكي، مثل كيفية تنشيط نقطة تفتيش تلف DNA. هذا البروتوكول مخصص لتحضير كل من مستخلص بويضات opus والكواشف المحفزة لنقطة تفتيش تلف DNA، وتحليل نقطة تفتيش تلف DNA و xap. وتعد هذه التقنيات قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من طرق إحداث تلف DNA، بما في ذلك four NQO و etoposide.

لبدء دراسة نقطة تفتيش تلف الحمض النووي DNA، دعونا نبدأ. لتحفيز وضع البيض لدى إناث الضفادع، يتم حقن الأكياس اللمفاوية الظهرية بـ 100 وحدة من PMSG تحت الجلد. بعد الانتظار لمدة يومين على الأقل من التحفيز الأولي، يتم تحفيز وضع البيض عن طريق حقن كل ضفدعة محفزة بـ 500 وحدة من هرمون gonadotropin المشيمي البشري تحت الجلد في الأكياس اللمفاوية الظهرية، ثم تُحضن الضفادع المحقونة لمدة تتراوح من 14 إلى 20 ساعة في دلاء منفصلة تحتوي على لترين من محلول Marx modified ringer.

أخرج الضفادع من الدلاء وسكب محلول MMR حتى يتبقى حوالي 100 milliliters. ثم انقل البيض من الدلاء إلى دورق سعة 250 milliliter، وقم بإزالة الهلام عن البيض بإضافة 100 milliliters من 2%cysteine بـ pH 7.8 كل 30 ثانية تقريباً. حرك البيض بلطف باستخدام ماصة باستور زجاجية مقلوبة بقطر 0.7 centimeters، ثم قم بتصريف السائل واستبداله بـ cysteine جديد مرتين.

ستكتمل عملية إزالة الغلاف في غضون خمس إلى 15 دقيقة تقريباً. وعندما تشكل البويضات طبقة أكثر تكثيفاً في قاع البيكر، يتم التخلص من محلول السيستين، ثم تُغسل البويضات ثلاث مرات بمحلول 0.25 XMMR. تُحرك البويضات باستخدام ماصة زجاجية، وتُفحص للتأكد من خلوها من البويضات التالفة ذات اللون الأبيض والمنتفخة التي تميل للتجمع في مركز البيكر.

قم بإزالة البيوض التالفة باستخدام ماصة الرعي (pasture pipette). بعد ذلك، اغسل البيوض ثلاث مرات باستخدام محلول منظم لتحلل البيوض (egg lysis buffer). قم بإزالة أي بيوض تالفة إضافية، ثم صب البيوض في أنبوب فالكون سعة 14 milliliter.

قم بتجميع البيض عن طريق الطرد المركزي لمدة 55 ثانية عند 188 ×g. باستخدام جهاز طرد مركزي مختبري سطحي مزود بدوار ذي دلاء متأرجحة، قم بإزالة محلول التخزين الزائد الموجود فوق طبقة البيض. الآن، لكل ملليلتر من البيض المجمع، أضف 0.5 µL من 10 mg/mL من aprotinin أو leptin أو AL، و 0.5 µL من 5 mg/mL من cytokine B أو cyto B. قم بطرد البيض مركزياً عند 16,500 ×g لمدة 15 دقيقة عند 4 °C. باستخدام جهاز الطرد المركزي Sarva RC six plus super speed مع دوار HB six ذي الدلاء المتأرجحة، يتم تقسيم البيض بعد الطرد المركزي إلى ثلاث طبقات في الأنبوب: مستخلص الدهون وصبغة المح، من الأعلى إلى الأسفل على التوالي. قم بثقب جانب أنبوب فالكون في الجزء السفلي من طبقة المستخلص الوسطى باستخدام إبرة عيار 21.

قم بإزالة الإبرة بعناية حيث قد تكون إبرة الثقب مسدودة بالبلاستيك. أدخل إبرة جديدة قياس 21 gauge متصلة بمحقنة سعة 1 ml في موقع الثقب لجمع المستخلص.

قم بسحب المستخلص ببطء، مع تجنب تكون فقاعات هوائية أو التلوث بطبقات الدهون وصباغ الصفار. انقل المستخلصات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter مبرد. لكل 1 milliliter من مستخلص البيض، أضف 10 µL من تركيز 10 mg/mL.

سيكلوهكسيميد 1 µL بتركيز 10 mg/mL. وبرونين لبتين 1 µL بتركيز 5 mg/mL، وسيتوكين B مقدار 1 µL من 1 M DTT و0.33 µL بتركيز 10 mg/mL. تُخلط جميعها عن طريق قلب مستخلص البيض بلطف 10 مرات على الأقل، ويجب استخدام المستخلص منخفض السرعة في غضون أربع ساعات لأن جودة LSE تتأثر.

بعد مرور أربع ساعات أو الإذابة الحرة، أذب قليل النوكليوتيدات الاصطناعيين في الماء بتركيز 2 µg/µL. أضف 100 µL من كل قليل نوكليوتيد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL، ثم حضنهما لمدة خمس دقائق في حمام مائي جاف (heat block) عند درجة حرارة 95 °C. أخرج أنبوب خليط قليل النوكليوتيدات من الحمام المائي الجاف واتركه ليبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم وزع الخليط في حصص سعة 10 µL للتخزين عند درجة حرارة -20 °C.

أصبحت عينة AL الآن عبارة عن ازدواج A T 70 بتركيز نهائي قدره 2 µg/µL. قم بتحضير كروماتين الحيوانات المنوية الطبيعية كما وصف Tudor وWalter للحصول على 0.5 mL من الكروماتين. أضف 5.5 µL من MMS بتركيز 9.1 M.

ضع أنبوب العينة على جهاز تدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة باستخدام جهاز الطرد المركزي السريري IE CCL two المزود بدوار ذو سلال متأرجحة ومهايئات للأنابيب. قم بتدوير العينة عند 686 ×g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من الطافي واغسل الراسب في 0.5 milliliters من buffer X الذي يحتوي على B-S-A-D-T-T-A proin وleptin.

كرر هذه العملية ثلاث مرات وأعد تعليق الراسب في 0.5 milliliters من Buffer x. حدد تركيز كروماتين الحيوانات المنوية باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer).

بعد ذلك، يتم تخفيف العينة لتصل إلى 100,000 حيوان منوي لكل µL وتُخزن أجزاء مقدار 5 µL عند درجة حرارة -80 °C. أضف الكمية المطلوبة من كروماتين الحيوانات المنوية الطبيعية على سطح قطعة من البارافين وضع العينة في جهاز الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية (UV crosslinker). اضبط معامل الطاقة المطلوب وابدأ في إتلاف كروماتين الحيوانات المنوية عبر الأشعة فوق البنفسجية (UV light).

استخدم كروماتين الحيوانات المنوية المعالج بالأشعة فوق البنفسجية (UV) فوراً لتحفيز نقطة تفتيش تلف DNA في المستخلص منخفض السرعة (LSE) المُحضّر. اخلط 50 µL من LSE مع 1 µL من مزيج الطاقة و 2 µL من كروماتين الحيوانات المنوية التالف. حضّن التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة، مع الحرص على نقر الأنبوب كل 10 دقائق بعد مرور 30 دقيقة على الأقل.

أثناء التحضين، يتم توزيع 1 µL من خليط التفاعل على شريحة مجهرية وإضافة 1 µL من محلول nuclear dice. توضع شريحة غطاء ويتم التحقق من تشكل النوى باستخدام المجهر الفلوري. عادةً ما تتشكل نوى مستديرة بعد 30 دقيقة من التحضين، مما يشير إلى بدء تضاعف DNA.

علاوة على ذلك، قم بتقييم 10 µL من خليط التفاعل عن طريق اللطخة المناعية باستخدام أجسام مضادة لـ check one. اخلط 50 µL من LSE، و1 µL من خليط الطاقة، و1.6 µL من مخزون toto mycin في أنبوب طرد مركزي دقيق. ثم أضف 1.25 µL إما من T 70 DNA duplex بتركيز 2 µg/µL، أو الماء كعينة ضابطة سلبية.

قم بحضن التفاعلات في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة مع هز أنابيب التفاعل كل 10 دقائق. والآن، أضف 10 µL من خليط التفاعل إلى 90 µL من منظم العينات (sample buffer) لإجراء تحليل western blood لبروتين check one. إن كروماتين الحيوانات المنوية التالف أو البنية التي تحاكي تلف DNA تحفز بفعالية نقطة تفتيش تلف DNA بوساطة TR check one في نظام مستخلص بويضة xop مقارنة بما يحفزه MMS في مجموعة الضبط.

افحص فسفرة check one عند Syrian 3 44، والتي تعد مؤشراً على تنشيط TR kinase. وبالمثل، فإن T 70، كبنية تحاكي تلف الحمض النووي DNA، تحفز أيضاً فسفرة check one. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام تحضير LSE في غضون ساعة واحدة تقريباً.

بما أن جودة المستخلص تتناقص بعد مرور أربع ساعات تقريبًا، فإن السرعة والكفاءة أمران ضروريان. ويمكن دمج هذه الطرق مع نهج أخرى للإجابة على أسئلة هامة تتعلق بإشارات نقاط تفتيش تلف DNA. على سبيل المثال، يمكن إجراء عملية استنزاف مناعي لاختبار ما إذا كان البروتين المستهدف مطلوبًا في نقطة تفتيش تلف DNA.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة نقطة تفتيش تلف D باستخدام مستخلص pus كنظام نموذجي. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لك بالتوفيق في تجربتك.