الحصين حقن مكروي الأنسولين و

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس عملية التمثيل الغذائي في الحصين أثناء الاختبار السلوكي. يتم تحقيق ذلك من خلال التحضير الجراحي لحيوان تم تدريبه جيداً عبر زرع قنية توجيه للتدفق الدقيق (microdialysis guide cannula). وفي يوم الاختبار، يتم إدخال مسبار التدفق الدقيق في القنية والتأكد من تدفق سائل التروية (PERFUSE).

بعد ذلك، يُترك المسبار ليصل إلى حالة التوازن بينما يتواجد الحيوان في غرفة تحكم. وفي النهاية، تُستخدم طرق تحليلية مناسبة، على سبيل المثال، تفاعل glucose oxidase و NADP و N-A-D-P-H والتحليل الفلوري. فإذا استُخدم قياس الجلوكوز لإظهار مستوى التمثيل الغذائي و/أو الإفراز الكيميائي العصبي طوال فترة الاختبار، فإن أحد أصعب جوانب هذه التقنية هو العناية المطلوبة في التعامل مع أنابيب الديلزة المجهرية، حيث غالبًا ما يقوم الحيوان بمضغها أو تشبيك الخطوط إذا لم يتم توخي الحذر.

لقد كانت المرة الأولى التي استخدمت فيها تقنية الديلزة الغشائية الدقيقة في الحصين أثناء الاختبارات السلوكية خلال عملي في مرحلة الدراسات العليا، حيث أردنا التحقق مما إذا كانت النماذج الحالية لإمدادات الجلوكوز متوافقة بالفعل مع البيانات النفسية المعروفة فيما يتعلق بتحسين الذاكرة بواسطة الجلوكوز. وقد أتاحت لنا هذه المنهجية إثبات أن النماذج الحالية للجلوكوز المطبق على الدماغ كانت خاطئة تماماً في الواقع.

وفقاً للإجراءات الجراحية القياسية، قم بتحضير الحيوان، وكشف الجمجمة وحفر الثقوب اللازمة لوضع القنية. أدخل القنية في الإحداثيات المحددة مسبقاً ثم اخفضها ببطء حتى تصل إلى العمق المستهدف. وبمجرد وضعها بشكل صحيح، قم بتثبيت القنية في مكانها باستخدام الأسمنت السني.

استخدم غرزة جراحية معقمة لإغلاق الجرح إذا لزم الأمر. وأخيراً، يتم استخدام سلك توجيه (style) للحفاظ على نفاذية القنية. بعد ذلك، قم بتجهيز جهاز PERFUSE eight لاستخدامه في عملية الديلزة الدقيقة (microdialysis).

تجدر الإشارة إلى أن دقة تركيب السائل أمر ضروري لتحقيق النتائج المثلى. وفي يوم الاختبار، يجب إضافة bovine serum albumin BSA وإذابته تماماً. وبعد التحضير، يجب ترشيح PERFUSE eight باستخدام مرشح بمسامية 0.2 micron.

بعد ذلك، قم بتحضير العلاج الذي سيتم إعطاؤه للدماغ، إن وجد، باستخدام جزء من A ECF المُحضّر. في هذه التجربة، يتم تحضير الأنسولين لتقديمه إلى الحصين. يجب تحضير مسبار وخط الديلزة الغشائية الدقيقة الجديدين في اليوم السابق للاختبار.

قم بإنشاء خطين منفصلين للتدفق الداخلي والخارجي. استخدم أنابيب PE 50 لتوصيل قطعتين من أنابيب FEP بطول متر واحد لكل منهما، مع التأكد من تقليل المساحة الميتة بين الخطوط إلى أدنى حد. يجب قص الأنابيب كما هو موضح لإنشاء نهايات مائلة لتسهيل عملية الإدخال في وصلات PE 50.

قم بتوصيل أنبوب التدفق الداخل بمحقنة Hamilton سعة 1 مل مملوءة بماء منزوع الأيونات ومعقم مصفى، وقم بتثبيت المسبار في الطرف الآخر للسماح للحيوان بالتحرك بحرية أثناء أخذ القياسات. قم بتوصيل خطوط التدفق الداخل والخارج بدوار ثنائي القنوات. بعد ذلك، قم بتوصيل أنبوب التدفق الخارج بالمضخة وقم بتشغيلها بمعدل 1.5 µL في الدقيقة حتى تلاحظ خروج الماء منزوع الأيونات من أنبوب التدفق الخارج الموجود في المسبار.

أوقف تشغيل المضخة وقم بتوصيل الخط الآخر بين أنبوب التدفق وأنبوب تجميع العينات. مرر 5 mL عبر الأنبوب وضع المسبار في قارورة تحتوي على ماء منزوع الأيونات معقم طوال الليل، مع التأكد من بقاء طرف المسبار رطباً باستمرار. قبل 24 ساعة من الاختبار، قم بتهيئة موضوع الاختبار عن طريق إزالة المِرسال الوهمي وإدخال مسبار الديلزة الدقيقة المخصص لهذا الغرض فقط.

بعد ذلك، قم بإزالة المسبار الوهمي لمدة 10 دقائق وأعد الجرذ إلى قفصه. أو بدلاً من ذلك، استخدم مسباراً جديداً في هذه المرحلة واتركه في مكانه دون إزالة حتى يتم أخذ القياسات في اليوم التالي.

في يوم إجراء عملية الديلزة الدقيقة (Microdialysis)، املأ محقنة Hamilton وقارورة الوميض (scintillation vial) بسائل ECF المفلتر من المجموعة A، واترك المضخة لتصل إلى حالة التوازن لمدة ساعة واحدة. إذا لزم الأمر، املأ محقنة Hamilton ثانية بالعلاج المُحضّر وضعها في مضخة المحاقن. إن مفتاح النجاح في هذا الإجراء هو الحفاظ على الهدوء والتعامل مع الحيوان بعناية فائقة.

لذا، حافظ على هدوئك، وتحرك ببطء ودقة، وقبل كل شيء تدرب جيداً. عند اكتمال عملية التوازن، قم بإزالة المسبار الوهمي وأدخل مسبار الديلزة الدقيقة المتوازن برفق في دماغ الجرذ عبر القنية. ضع الجرذ في صندوق بلاستيكي شفاف يحتوي على جزء من فرشة سكن الجرذ.

تأكد من موازنة الأنابيب. قم بتثبيت أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.6 milliliter مملوء بالماء في الأنابيب خارج القفص بحيث تحافظ الجاذبية على خطوط الديلزة الدقيقة دون التواء ولكن دون أن تكون مشدودة. اترك المسبار والجرذ للتكيف لمدة ساعتين.

في بداية هذه الفترة، تأكد من أن تدفق جهاز Perfuse eight غير مسدود. وللقيام بذلك، اجمع المخرجات من جهاز PERFUSE eight على مدى فترة زمنية محددة، وقم بوزن العينة للتأكد من أن الحجم المتوقع يخرج من النظام قبل البدء في جمع العينات. تأكد من حساب الارتباط بين دياليز العينة وجمعها بدقة.

لدينا هنا حجم قدره 30 µL بين المسبار ونقطة التجميع بمعدل 1.5 µL في الدقيقة. يوجد وقت تأخير مدته 20 دقيقة من لحظة خروج العينة من الدماغ حتى يتم تجميعها. بعد فترة التوازن، يتم تجميع ثلاث عينات على الأقل بينما يكون الجرذ في حالة راحة داخل غرفة الإيواء.

لإنشاء خط أساس مستقر للقياسات قبل الاختبار السلوكي، خطط بدقة لتوقيت إيصال العلاج إلى الدماغ. لذا، في هذا الإعداد حيث يوجد حجم 30 µL بين طرف المحقنة والمسبار الذي يدخل إلى دماغ الحيوان، نقوم بتغيير محقنة العلاج إلى محلول علاج profuse eight قبل 20 دقيقة من الموعد المحدد. نرغب في وصول ذلك العلاج إلى الحصين عند تغيير المحاقن.

قم ببساطة بفصل خط التدفق الوارد من محقنة PERFUSE eight الخاصة بالمجموعة الضابطة وربطه بسرعة بمحقنة PERFUSE eight الخاصة بمجموعة العلاج. يجب ألا تستغرق هذه العملية أكثر من خمس ثوانٍ لتجنب انقطاع تدفق PERFUSE eight. احرص على عدم إدخال فقاعات هوائية قد تقلل من الكفاءة في الفترة الزمنية المناسبة.

بعد تقديم العلاج، انقل الجرذ برفق إلى جهاز الاختبار السلوكي المختار. هنا، يتم قياس التناوب التلقائي في متاهة على شكل علامة زائد (+). اترك الحيوان يستكشف المتاهة بحرية لمدة 20 دقيقة.

سجل تسلسل وتوقيت الذراع Aries إما باستخدام تسجيل فيديو أو يدويًا لجمع العينات. خلال هذه الفترة، انقل أنبوب التدفق إلى أنبوب تجميع جديد. كل خمس دقائق، أمسك الأنبوب بحيث يتحرك بحرية.

يجب ألا يعيق ذلك حركة الجرذ أو يتحرك أمام الحيوان ويشتت انتباهه، بل يجب البقاء ساكناً لضمان عدم تأثير تحركاتك على سلوك الجرذ. بعد انتهاء الاختبار، أخرج الجرذ بلطف من المتاهة وأعده إلى غرفة التحكم. استمر في جمع عينات الديلزة الغشائية المجهرية (microdialysis) لمدة أربع عينات على الأقل لتغطية فترة التعافي من أداء المهمة.

بعد جمع العينات المطلوبة، قم بإزالة المسبار برفق من رأس الحيوان وضعه في أنبوب تخزين. أعد الحيوان إلى قفصه الأصلي وراقبه عن كثب لرصد أي تغيير في الصحة أو السلوك بعد التجربة. وأخيراً، قم بغسل الأنابيب عن طريق التبديل إلى سرنجة تحتوي على محلول catho لمنع نمو الميكروبات.

يوضح هذا المثال انخفاضاً في مستويات الجلوكوز في السائل خارج الخلوي (ECF) في منطقة الحصين مرتبطاً بمهمة معينة. يمثل المربع الرمادي الوقت الذي قضاه الحيوان في المتاهة. يمثل الخط الأرجواني مستويات الجلوكوز في الحصين لدى الحيوانات التي لم تخضع لاختبار المتاهة، بينما يمثل الخط الأحمر الحيوانات التي تؤدي مهمة التناوب التلقائي للساعد.

يوضح الخط البرتقالي القياسات في الحيوانات التي تؤدي النسخة الأسهل من هذه المهمة المكونة من ثلاثة أذرع. وتظهر هنا التغيرات في الحصين والجلوكوز واللاكتات بعد إعطاء الأنسولين. لاحظ أن هذه التغيرات تظهر دون أي اختبار سلوكي، وبالتالي فهي تعكس تأثير الأنسولين وحده في ظروف خط الأساس.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم جداً الحفاظ على الهدوء؛ إذ يمكن للجرذان أن تشعر بتوتر التجربة مما يجعلها مضطربة، وهو الأمر الذي قد يزيد من صعوبة العملية ويؤدي على الأرجح إلى تضارب نتائجك. لقد أتاح هذا المزيج من التقنيات إجراء استقصاء كيميائي عصبي دقيق للعمليات السلوكية.

تُستخدم تقنيات مماثلة الآن أيضاً لدى المرضى البشر. فعلى سبيل المثال، المرضى المصابون بالصرع الذين لديهم أقطاب كهربائية مزروعة لتحديد موقع بؤرة النوبات قد يتم لديهم أيضاً زرع قنيات الديلزة الدقيقة للسماح بإجراء القياسات الأيضية.