صور متتابعة تبيض لتحديد خلايا شوان واحدة عند تقاطع الاعصاب

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد خلايا شوان مفردة عند التقاطع العصبي العضلي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. يستخدم هذا البروتوكول الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP في خلايا شوان الطرفية والمحورية. الخطوة الأولى هي تشريح عضلة الأعصاب.

يتم إجراء التبييض المتسلسل التالي لجميع خلايا شوان باستثناء واحدة عند تقاطع عصبي عضلي معين ، مما يكشف عن مورفولوجيا الخلية الواحدة. أخيرا ، يتم إنشاء خريطة منخفضة الطاقة. يتم إصلاح الأنسجة واستخدامها في الكيمياء المناعية لتصور أي علامة مرغوبة فيما يتعلق بخلية شوان غير المبيضة المتبقية.

تظهر النتائج مورفولوجيا الخلية المفردة وإذا رغبت في ذلك ، فإن الفحص المجهري بفاصل زمني أو تحليل التحديد الكيميائي المناعي في الأنسجة الثابتة بناء على التصوير متحد البؤر. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمورفولوجيا وأراضي خلايا البجعة المفردة عند التقاطع العصبي العضلي. يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل خطوط الخلايا أو شرائح الدماغ الحية أو حتى الأنواع الأخرى مثل الزرد.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الأمر يتطلب بعض الخبرة لتحديد تقاطع عصبي عضلي سطحي بما فيه الكفاية وعدم إضاعة الوقت في الهياكل التي لا تستحق الجهد قبل بدء الجراحة ، قم بتزويد محلول الرنين بالأكسجين وتبريده لمدة 15 دقيقة على الأقل. ضع طبق زراعة الأنسجة بطول 15 سم مع الثلج تحت المجهر. قم بتغطيته بلوحة معدنية.

ضع طبق زراعة الأنسجة الذي يبلغ طوله 10 سم مملوءا بمحلول جرس على الصفيحة المعدنية. ضع حجر الأكسجين في المحلول. الخطوة التالية هي تحديد ماوس يحتوي على خلايا البجعة والمحاور المسماة بألوان مختلفة.

بعد القتل الرحيم للفأر ، رشه بالإيثانول لمنع تلوث الفراء ، استخدم مقصا كبيرا لعمل شق في خط الوسط فوق القص وشقين موازيين للحافة السفلية للقفص الصدري. قم بإزالة الجلد وافتح البطن وتشريح عضلات الصدر بشقوق قريبة من إدخال العضلات في القص. استخدم الملقط للتمسك بالغضروف الخنجري وقطع الحجاب الحاجز أسفل الغضروف الخنجري مباشرة.

قم بتشريح الحجاب الحاجز على طول إدخالاته الساحلية. بلل الأنسجة من حين لآخر بمحلول رنين لمنع الجفاف باستخدام ملقط لتثبيت القفص الصدري من خلال عملية الخنجري. ابدأ في قطع الأضلاع من العمود الفقري في أقرب وقت ممكن من إدخالها.

يجب أن تتقارب القطع اليمنى واليسرى فوق القلب باتجاه عين المؤخرة. حاول تجنب قطع الأوعية الدموية الرئيسية ، وخاصة الأوردة تحت الترقوة. لتحسين الرؤية.

ارفع المستحضر برفق مع التمسك بعملية الخنجري بالملقط. الآن قم بعمل قطع عرضي أسفل عين مؤخرة المانوبريوم مباشرة لإزالة الصدر ونقل X explan إلى طبق 10 سم مع محلول الرنين المجهز. ضع الطبق على الصفيحة المعدنية والطبق المملوء بالثلج تحت المجهر تحت المجهر.

باستخدام مقص زنبركي صغير ، قم بإزالة بقايا الغدة الصعترية وغشاء الجنب والحجاب الحاجز والعضلات الصدرية. باستخدام مقص زنبركي صغير ، قم بتشريح جميع الأضلاع التي لا يتم إدخالها في عظم القص. قطع الأنسجة بين الضلوع.

هذا يسمح ل X explan بالتناسب مع طبق مطلي بواقي SIL بطول 3.5 سم. الآن باستخدام ثمانية إلى 10 دبابيس minuchin مختصرة ، قم بتثبيت X explan ، وتجنب عضلة العين الصارمة المثلثة المشار إليها هنا. يجب أن يمر دبابيس عبر الأجزاء الغضروفية من القص ، ويجب أن يمر دبابيس عبر الأجزاء الغضروفية الأكثر نعومة بين الأضلاع.

تجنب ثقب الأضلاع تحت العضلة المثلثة أو بالقرب منها. استمر في التثبيت حتى تنتشر الضلوع إلى حد ما. تثبيت العضلات في وضع ممتد قليلا.

انقل الطبق المطلي بواقي العتبة بطول 3.5 سم إلى مجهر متحد البؤر مزود بأهداف ليزر Argonne والغمر في الماء. للحصول على فحص مجهري بفاصل زمني ، أدخل الطبق المطلي بواقي العتبة بطول 3.5 سم في حلقة التسخين. قم بتركيب نظام الصهار الفائق وتركيب مسبار درجة الحرارة.

تأكد من عدم ملامسة أي شيء للتخطيط أو حافة الطبق أو طلاء السيجار. للفحص المجهري بفاصل زمني ، قم بتسخين X explan ، ولكن بالنسبة لخلية شوان ، تكون درجة حرارة غرفة التبييض أفضل. الآن مع هدف جوي فوركس ، راقب نمط التعصيب لعضلة العين الخلفية المثلثة وابحث عن شريط لوحة نهاية العين المؤخرة المثلث.

قم بالتبديل إلى هدف مخروط الغمس 20 × وابدأ في البحث عن مناطق سطحية داخل مناطق نطاق nplate. تعتبر المناطق المرشحة الجيدة التي تغطى الأضلاع وبالقرب من الأعصاب الوربية. قم بالتبديل إلى هدف مخروط الغمس 100 × أو 60 × للتحقق من الفرد و mjs.

من الناحية المثالية ، حدد موقع NMJ المغطى بالعديد من خلايا شوان التي تقع بشكل سطحي للغاية ، من الأهمية بمكان لنجاح هذا البروتوكول العثور على تقاطعها العصبي العضلي السطحي والمسطح. نظرا لأن الوصلة العصبية العضلية تبتكر ألياف عضلية أسطوانية ، فإنها تميل إلى أن تكون ملفوفة حول الألياف وغالبا ما لا تحتوي اليدين على الزاوية المثالية للتصوير. حدد فقط التقاطعات العصبية العضلية السطحية المسطحة وعلى السطح الآن باستخدام هدف فتحة عددية 100 × 1.0.

مع تكبير 2.5 ، احصل على صورة متحد البؤر ل NMJ. توفر هذه الإعدادات حجم بكسل يبلغ حوالي 0.1 ميكرومتر ، مما يضمن أخذ العينات المكانية المناسبة وفقا لمعيار nyquist. الآن قم بتبييض خلية شوان عن طريق إيقاف شعاع الليزر 488 نانومتر مركزيا على النواة باستخدام الطاقة القصوى لمدة خمس ثوان.

بعد ذلك ، أعد التركيز على الخلية واحكم على نتيجة التبييض. إذا لزم الأمر ، كرر خطوة التبييض مرة أخرى حتى تنخفض مستويات GFP إلى مستويات قريبة من الخلفية ، ثم احصل على صورة أخرى. من الأهمية بمكان التأكد من أن المنطقة المبيضة خارج أي تداخل بين خليتين.

إذا كان هناك تداخل ، فسيكون التبييض في الخلية الثانية واضحا. عند القيام به بشكل صحيح ، ينتج عن هذا النهج خلايا نهائية مكشوفة بوضوح ، غالبا مع مورفولوجيا مدهشة للغاية لا يمكن للمرء أن يخمنها قبل بدء الإجراء. كرر عملية التبييض حتى يتم تبييض جميع خلايا شوان باستثناء واحدة.

آخر خلية شوان غير مبيضة مناسبة للفحص المجهري بفاصل زمني متحد البؤر. بعد الانتهاء من التصوير بفاصل زمني ، قم بعمل خريطة لهذه njs عن طريق التقاط صورة بمعدل 100 x بدون تكبير ، ثم صور للمنطقة باستخدام الهدف 20 × وكرر العملية باستخدام الهدف أربعة x. هذه الخريطة ضرورية للعثور على njs التي تتبع الكيمياء المناعية للعضلة الثابتة.

بعد التصوير والتبييض ، قم بفك الخطة ونقله إلى أنبوب سعة 50 مليلتر مع 15 مل على الأقل من 4٪ PFA. ثم ضع الأنبوب على الجليد لمدة ساعة بعد تبريد الأنسجة لمدة ساعة ، واشطفه ب 0.1 مولار جلايسين في PBS لمدة 10 دقائق على الأقل. ثم انقل الخطة الثابتة إلى طبق زراعة الأنسجة المطلي بواقي الحرير بطول خمسة سنتيمترات مملوء ب 0.01 مولار PBS واستعد لمزيد من تشريح التخطيط.

أولا ، قم بقص شكل شبه منحرف مع جانب واحد مواز لعظم القص والآخر من خلال العظم إلى انتقالات الغضروف. يحتوي هذا على عضلة مثلثة على سطحها. بعد ذلك ، قم بإزالة الأضلاع السفلية بقطع أفقي أو عبر القص بحيث يمكن الوصول بحرية إلى نهاية التدليل للعضلة المثلثة.

الآن أدخل إبرة تحت الجلد كدبوس في الجزء العلوي من شبه المنحرف. بعد ذلك ، قم بإزالة عضلة الثلاث. أولا ، استخدم الملقط لتثبيت زاوية العضلات برفق.

وثانيا ، استخدم حقنة وإبرة مثل مشرط صغير للقطع بالتوازي مع مستوى جدار الصدر. بمجرد تحرير الجزء المدلل من العضلة ، أدخل إبرة أخرى أسفل العضلة من خلال جدار الصدر لشل حركة المستحضر. أثناء قطع إدخال النسيج الضام ، قم بتقشير العضلات من الصدر بسحب لطيف من الملقط.

أخيرا ، قم بإزالة الدهون وبقايا الأوعية الدموية باستخدام الملقط. احرص على عدم تمزيق الأعصاب. العضلة المثلثة جاهزة الآن للكيمياء المناعية.

إعداد مخطط للعين الصارمة المثلثة باستخدام الفئران التي تعبر عن GFP تحت محفز PLP للتصور خارج الجسم الحي لخلايا شوان. يمكن تصور المحاور في وقت واحد عن طريق عبور P-L-P-G-F-P إلى فخذ واحد OFP ثلاثة فئران. باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم الكشف عن مورفولوجيا خلايا شوان الطرفية المفردة بتفاصيل عالية بشكل مدهش عن طريق تبييض المحطتين المجاورتين وتعيش خلايا شوان المحورية الأولى.

تم تتبع التقاطعات العصبية العضلية المصورة باستخدام الخريطة التي تم إنشاؤها مسبقا ومسحها ضوئيا بدقة عالية في الأنسجة الثابتة بعد الفحص المجهري متحد البؤر الحي ، وتم إصلاح مؤخرة المؤخرة المثلثة وتلطيخها. تظهر هنا مستقبلات الأسيتيل كولين المسماة ب toin bungalow إلى جانب Alexa 6 47 في حويصلات حمراء ومشبكية تحمل علامة على جسم مضاد مضاد للسينابتوفيسين باللون الأبيض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور مورفولوجيا الخلايا المفردة ، والتي تم تصنيفها جميعا في البداية بنفس البروتين الفلوري ومعبأة بكثافة كبيرة بحيث لا يمكن حلها بشكل فردي.

يوضح مثالنا الوصلة العصبية العضلية ، ولكن هناك العديد من التطبيقات المحتملة الأخرى.