Name: الأشكال الركض الجذعية الجنينية البشرية خلية خطوط مع التربسين (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-10-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: تعلم تقنية التمرير الروتينية لخطوط خلايا الجذع الجنينية البشرية HuES باستخدام التربسين. يحافظ هذا البروتوكول على ثقافات صحية وغير متمايزة وطبيعية الكاريوتيب للأبحاث والتطبيقات العلاجية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

عام نوصي ذوبان لا يزيد عن عينة واحدة في وقت معين لضمان سهولة التعامل. ينبغي للمعالج الحرص على عدم ترك الثقافات في درجة حرارة الغرفة وCO2 منخفضة لفترات طويلة من الزمن. ويتم ذلك عن الطرد المركزي من الخلايا الحية على 500-600 XG لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. MEFs (خلايا الفأر الجنينية الطاعم) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل وسائل الاعلام الحارة MEF إلى 37 درجة مئوية. إزالة MEF قنينة من -80 درجة مئوية ، وعلى الفور يغرق في النصف السفلي من الأنبوب في حمام مائي 37 ° C. وينبغي أن يستغرق حوالي 30-45 ثانية قبل الخلايا هي 80 ٪ إذابة (جزء صغير مجمدة اليسار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب بسرعة الأنبوب إلى تدفق الصفحي هود ، الرذاذ أسفل مع الكحول 70 ٪ ، ونقل الخلايا إلى ما قبل تحسنت وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل الجيلاتين من لوحات أعدت في وقت سابق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 2 مل من محلول MEF في انخفاض الطريقة الحكيمة في كل من الآبار الست. لا شك أن توزع بالتساوي MEFs حول البئر. تاريخ لوحة MEF ، ووضع في الحاضنة 37 درجة مئوية خلال الليل للسماح لMEFs نعلق على طبق من ذهب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد 6 ساعات ترفق MEFs إلى اللوحة. فمن الأفضل لاستخدام لوحات MEF 24-48 بعد ساعات من الطلاء. لا تستخدم لوحة MEF أن أكثر من 4 أيام من العمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل وسائل الإعلام والأشكال الدافئة 0.05 ٪ التربسين / EDTA إلى 37 درجة مئوية تحت غطاء السيارة ، prelabel one العقيمة أنبوب 50 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية ليكون تقسيم وسائل الاعلام الأشكال من الثقافة. يغسل بلطف مع آبار 2mL حل الفوسفات مخزنة 1X (PBS) لكل بئر. نضح في برنامج تلفزيوني. إضافة 0.75 مل 0.05 ٪ التربسين / EDTA إلى البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الغطاء ، ومراقبة الخلايا تحت التكبير 4X. يجب على المستعمرات المحيطة MEFs الأشكال تبدأ في التراجع. عندما يتم تقريب MEFs بما فيه الكفاية وحدود المستعمرات هي الأشكال الخام ، وعودة إلى لوحة غطاء محرك السيارة. وينبغي أن تستغرق هذه العملية حوالي 5 دقائق ، قطعا لا أطول من 10 دقيقة أو خلايا الخاص بك لن تنمو من جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بلطف صعودا ونزولا ، وغسل قاع البئر ، حتى المونولاير MEF ومنفصلة تماما (أحادي الطبقة هي لزجة ، وربما يبقى في قطعة واحدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق نقل الخلية إلى أنبوب an المخروطية التي تحتوي على 50 مل إضافية الأشكال وسائل الإعلام. تدور في أنبوب من الخلايا لمدة 5 دقائق 500xg ، نضح إيقاف وسائل الإعلام ، يجب الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة على لوحة جديدة من MEFs ، إضافة تحديد حجم مناسب من الخلايا إلى وسائل الإعلام الأشكال إضافية ، وماصة الحل 5-7 مرات مع ماصة الآلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام MEF من لوحة جديدة من MEFs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة انخفاض حل الاشكال من الحكمة أن كل بئر ، والتأكد من أن توزع بالتساوي قطرات حول البئر. دون أن تهتز لوحة ، وعودة بعناية الخلايا إلى الحاضنة 37 درجة مئوية خلال الليل للسماح الأشكال المستعمرات البذور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن الأشكال الخلايا التي تخرج من انقسام تتصرف على نحو مماثل لتلك التي تخرج من ذوبان الجليد. </li></ol>

<ol><li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals%3A+a+three-year+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li>
<li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li>
<li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li>
<li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Iberoam.+Micol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li>
<li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li>
<li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li>
<li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans%3A+Development%2C+architecture%2C+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li>
<li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+biofilms+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li>
<li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+activity+of+amphotericin+B%2C+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li>
</ol>

في هذا الفيديو كيف أننا أثبتنا الأشكال مرور روتينية الإنسان خطوط الخلايا الجذعية الجنينية في المختبر لدينا. تقسيم فعالة ومنتظمة والركض أمر ضروري للحفاظ على صحة الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية الخط. التربسين مرور توسط هو ميزة كبيرة من خطوط الخلايا الأشكال ، ومع ذلك ، فمن المهم أن لا يعرض للتريبسين عبر الثقافات أو الحصول على نسبة كبيرة من الخلايا واحدة خلال إعادة platting.

الأشكال وسائل الاعلام 651.5 مل KO - DMEM 500 مل 6.5 مل PenStrep GlutaMAXTM 6.5 مل 6.5 مل NEAA 2 - المركابتويثانول 0.5ul استبدال المصل KO 65 مل 65 مل Plasmanate bFGF2 (10 نانوغرام / مل النهائي) 0.65 مل

الأشكال الركض الجذعية الجنينية البشرية خلية خطوط مع التربسين

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

في هذا الفيديو كيف نظهر مختبرنا الممرات بشكل روتيني الأشكال البشرية خطوط الخلايا الجذعية الجنينية مع التربسين. الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والفنية للثقافة الخلية ، وتميل الى اكتساب شذوذ karyotypic الأضعاف مع الكثافة السكانية العالية. الركض السليم أمر ضروري للحفاظ على ، غير متمايزة صحية ، والأشكال الطبيعية karyotypically الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الثقافة. أولا ، يتم غسلها ثقافة التوسع في برنامج تلفزيوني وسائل الإعلام لإزالة بقايا وحطام الخلايا ، ثم يتم مضافين الخلايا مع الحد الأدنى من حجم 0.05 ٪ دافئة التربسين - EDTA. ترك التربسين على الخلايا لمدة تصل إلى خمس دقائق ، ثم يتم فكها بلطف مع خلايا ماصة a 2mL المصلية. يتم جمع نظام التعليق الخلية ومختلطة مع كمية كبيرة من الاشكال وسائل الإعلام ، ثم يتم جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي لطيف. تتم إزالة المعطل خليط سائل الإعلام التربسين ، وخلايا معلق في وسائل الاعلام الأشكال السابقة للحرارة. ويتم احتساب نسبة تقسيم المناسب (1:10 عموما 1:20) ، وخلايا إعادة مطلي على طبق من العمر 1-2 اليوم تحتوي على أحادي الطبقة من الماوس الجنينية الخلايا المغذية المشع الليفية. تبقى الثقافة الأشكال المصنفة حديثا لوحة دون عائق لمدة 48 ساعة ، ثم يتم تغيير وسائل الاعلام كل يوم بعد ذلك. فمن المهم عدم trpsinize الى تعليق خلية واحدة ، لأن ذلك يزيد من مخاطر إدخال karyotypic شذوذ.

في هذا الفيديو كيف نظهر مختبرنا الممرات بشكل روتيني الأشكال البشرية خطوط الخلايا الجذعية الجنينية مع التربسين.

نوضح في هذا الفيديو كيف يقوم مختبرنا بشكل روتيني بنقل مزارع خطوط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية HuES باستخدام التريبسين. تُعد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية نتاجات...

هذا هو ، أين قمت بتشغيل التقنيات؟ أوه ، أين علمتك؟ Belcher.نعم.في المرة الأولى التي علمتك فيها بيل ، قضيت الصيف في T.Yeah الخاص بي.وكان ذلك مثل ، لقد أحببنا أشياء الغضاريف هناك. وهكذا أحببت الثقافة الاجتماعية هناك. ثم في هوبكنز في سنتي الأخيرة عملت مع مختلف ، لذلك أنا ، مثل الشيء الهندسي ، كان الأمر يتعلق أكثر بكثير بالمحاولة ، نحن نصمم ثلاثي الأبعاد ذلك.

passaging-hues-human-embryonic-stem-cell-lines-with-trypsin

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا الفيديو يوضح كيفية زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) على الخلايا الجنينية الماوس الليفية التغذية (MEF). جزء 1 من 3.

من MEFs لMatrigel الأول : hESCs الركض في وجود MEFs

التفريق بين ESC يتزامن مع خلية من نوع تغييرات معينة في بنية وتركيبة لونين. الكشف عن هذه التغييرات يقدم أفكارا قيمة حول الآليات التي تحدد stemcellness وتمايز الخلايا. مناعي لونين (CHIP) يمثل قيمة لأسلوب تشريح الآليات الجزيئية الكامنة وراء تمايز الخلايا الجذعية.

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

هذا الفيديو يوضح كيفية الحفاظ على نمو خلايا المنشأ الجنينية البشرية (hESCs) في ظروف خالية من الخلايا المغذية وكيفية hESCs مرور مستمرة في تغذية الخلايا خالية من الشروط. تأكيد hESC تعدد القدرات التي تزرع في تغذية الخلايا خالية من الشروط التي المجهري المناعي ويتجلى أيضا. الجزء 3 من 3.

من MEFs لMatrigel 3 : hESCs من الركض على Matrigel Matrigel

Karyotyping هي تقنية بسيطة ومفيدة تستخدم على نطاق واسع للكشف عن تغيرات جينية. نحن هنا وصف خطوة خطوة لإعداد بروتوكول نشر كروموسوم من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لرصد حالة الكروموسومات من هذه الخلايا في الحفاظ على الثقافة.

الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

وصفنا جزيء صغيرة مقرها بروتوكول للتمايز الخلايا الجذعية الجنينية لتصبح خلايا السلائف oligodendrocyte (OPCs). يولد هذا البروتوكول Olig2 + + NG2 OPCs ذات كفاءة عالية في موعد أقصاه 30 يوما من التمايز. نحن تصف أيضا طريقة لتوليد "التشويك" OPCs النار التي يمكن أن إمكانات العمل.

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في السلائف Oligodendrocyte

وقد ولدت من تمايز موجهة الى خلايا محددة hESCs الكثير من الاهتمام في مجال الطب التجديدي. ونحن نقدم موجزة ، وخطوة بخطوة لتحديد...

رسم مصير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال تكوين ورم مسخي

الجزئي تشريح تقنية explants هو أسلوب قوي وموثوق بها من أجل عزل التكاثري خلايا عضلات الهيكل العظمي من العضلات ، والأحداث أو البالغين الجنينية كمصدر للخلايا الجذعية العظمية العضلية. فريد ، كانت هذه الخلايا المشتقة clonally الهيكل العظمي لإنتاج خطوط الخلايا الجذعية العضلية تستخدم لزرع في الجسم الحي.

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لنشر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) باستخدام الوسائط المكيفة فقط المشتقة من المشيمة البشرية في طبق مغطى بالجيلاتين دون مكملات خارجية إضافية أو طبقات أساسية اصطناعية خاصة ب hPSC.

ثقافة نموذج رواية لالمحفزة الإنسان الجذعية نشر خلية على الجيلاتين في وسائل الإعلام مكيفة المشيمة-

يمكن استخدام هذه الطريقة لفحص تقصير الساركومير باستخدام خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات مع بروتينات الساركومير الموسومة بالفلورسنت.

Sarcomere تقصير متعدد القدرات خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية باستخدام الفلورسنت الموسومة بروتينات ساركومير.

لتجنب القيود المرتبطة بالمرور الأنزيمي أو الميكانيكي للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) المزروعة على الخلايا المغذية ، أنشأنا طريقة سريعة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة وعالية الغلة لحصاد مستعمرات hESC أو hiPSC التي يتم الاحتفاظ بها على طبقة الخلايا المغذية من الخلايا الليفية القلفة البشرية باستخدام عدم الالتصاق بوساطة EDTA.

تمرير سريع وفعال من حيث التكلفة وخالي من الإنزيم للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات على الخلايا المغذية عن طريق إزالة الالتصاق بوساطة حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك

يعرض هذا البروتوكول تمايز الخلايا الآكلة للعظم البشري عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ويصف طرق توصيف الخلايا الآكلة للعظم وسلائف ناقضة العظم.

تمايز وتوصيف الخلايا الآكلة للعظم من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

تعلم تقنية التمرير الروتينية لخطوط خلايا الجذع الجنينية البشرية HuES باستخدام التربسين. يحافظ هذا البروتوكول على ثقافات صحية وغير متمايزة وطبيعية الكاريوتيب للأبحاث والتطبيقات العلاجية.

الأشكال الركض الجذعية الجنينية البشرية خلية خطوط مع التربسين

استكشف المزيد من الفيديوهات