الألياف الضوئية للزراعة تحفيز Optogenetic المزمن من أنسجة المخ

الهدف من التجربة التالية هو تنشيط ودراسة الدوائر العصبية على المدى الطويل في الفئران المستيقظة التي تتصرف هذه الطريقة مقتبسة من المفهوم الموصوف في الأصل في Sparta etal. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجميع سلك مزدوج من الألياف البصرية أولا ، والذي يربط المفصل الدوار البصري بغرسة الألياف البصرية.

بعد ذلك ، يتم زرع الألياف البصرية فوق أنسجة المخ ذات الأهمية لإنشاء ممر للضوء للانتقال مباشرة إلى القناة التي تعبر عن الخلايا العصبية. أخيرا ، يتم توصيل مصدر الضوء بالمفصل الدوار البصري من أجل إنشاء مسار متصل بشكل متسلسل من مصدر الضوء إلى أنسجة الدماغ. في النهاية ، يمكن تقييم إطلاق النار الناجم عن الضوء لقناة redsin التي تعبر عن الخلايا العصبية بناء على الدراسات في الجسم الحي والفيزيولوجيا الكهربية والدراسات السلوكية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل قنيات التوجيه هي أنها تقلل من الضرر الذي يلحق بأنسجة المخ الناجم عن الإدخال المتكرر وإزالة الألياف الضوئية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لوظيفة الدائرة العصبية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى لفهم أفضل للآليات المعتمدة على المشبك والدائرة التي تكمن وراء أنواع معينة من الاضطرابات العصبية. العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية.

نظرا لأنه يصعب إتقان خطوات الزرع ، فإن كل خطوة تبدو بسيطة تساهم بشكل كبير في الاستقرار العام وموثوقية الطريقة. ابدأ بقطع 35 ملم من الألياف البصرية بقطر 125 ميكرون مع نواة 100 ميكرون عن طريق وضع كاتب كربيد طرف إسفين عموديا على الألياف البصرية وتسجيل الألياف في حركة واحدة أحادية الاتجاه متبوعة بالسحب للخارج مباشرة. الآن ، أدخل وحشية من السيراميك LC بقطر 127 ميكرون في جانب محدب موجه إلى أسفل في الرذيلة ثم أدخل قطعة الألياف البصرية في الوحشية.

يجب أن تنزلق الألياف البصرية بسلاسة وتبرز بشكل هامشي خارج الطرف المحدب للوحشي. بعد ذلك ، ضع قطرة واحدة من الألياف البصرية القابلة للعلاج بالحرارة الطازجة على الطرف المسطح من الوحشي ، ثم ضع مسدسا حراريا على الإيبوكسي. يجب أن يملأ الإيبوكسي الوحشي أثناء تسخينه ويتم معالجته عندما يتحول إلى اللون الأسود.

بعد المعالجة ، قم بتنظيف أي إيبوكسي من جوانب الوحشي ، ثم باستخدام قرص تلميع الألياف البصرية LC يجعل أنماط الدوران الدائرية لتلميع الطرف المحدب للوحشي على صفائح تلميع أكسيد الألومنيوم على وسادة تلميع على أربع درجات متناقصة. ثم قم بقص الألياف الضوئية في النهاية المسطحة إلى الطول المناسب لاستهداف منطقة الاهتمام. لاختبار الألياف البصرية المصقولة ، أدخل الطرف المصقول للغرسة في غلاف قارنة التوصيل.

حتى يتم الشعور بالاتصال المباشر مع الوحشي المعارض ، سيكون للغرسة السيئة نقطة محورية ضعيفة بالقرب من طرف الألياف البصرية ، في حين أن الغرسة الجيدة ستنقل دائرة ناعمة متحدة المركز من الضوء بدون إخراج. تعمل قوى تصل إلى 10 مللي واط على تخزين الغرسات النهائية في الرغوة حتى الاستخدام. ابدأ هذه الخطوة بقياس ثم تسجيل ألياف بصرية قطرها 220 ميكرون مع نواة 200 ميكرون للسماح للفأر بالتحرك بحرية ولكن لا تسمح للفأر بمضغ الألياف.

ثم أدخل الألياف البصرية في قطعة من أنابيب الفراء بقطر داخلي أكبر قليلا وطول أقصر قليلا من تلك الموجودة في الألياف البصرية. الآن ، قم بتجريد حوالي 25 ملم من أحد طرفي الألياف البصرية وأدخلها في الطرف المعدني لمجموعة وحشية FC MM متعددة الأوضاع. مع تجويف قطره 230 ميكرون حتى يتوقف ، يجب أن تبرز الألياف الضوئية من خلال الطرف الوحشي.

بعد ذلك ، قم بتأمين الاتصال باستخدام cyanoacrylate في الطرف المعدني وقم بتغطية الوصلة بموصل تمهيد الطرف الوحشي بقرص تلميع FC كما هو موضح للتو. بعد تجريد الطرف الآخر من الألياف البصرية ، أدخله في وحشية من السيراميك LC مع الطرف المحدب البعيد فقط. ثم ضع قطرة من الايبوكسي على الطرف المسطح وسخنها حتى تشفى كما هو موضح للتو.

بعد تلميع الطرف المحدب للوحشي كما هو موضح للتو ، حرك الأكمام الوحشية LC فوق الطرف المحدب من الوحشي حتى يصل الوحشي إلى منتصف الأكمام. ثم ضع أنبوبا يتقلص الحرارة فوق الأنبوب والأكمام وقم بتسخين أنبوب الانكماش الحراري لآمن وحماية الاتصال. أخيرا ، قم بتوصيل الوحشي بمصدر الليزر ثم اختبره عن طريق قياس ناتج الضوء من خلال قارنة التوصيل باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، ويجب ألا يتجاوز فقدان الضوء بين إخراج الليزر وإخراج المقرنة المقاس 30٪ قبل بدء الجراحة.

تطهير المنطقة الجراحية بالكحول الجانبي isop متبوعا بمحلول الكلورهيكسيدين. بعد ذلك ، ضع الماوس في جهاز التجسيم وقم بتأمين الرأس مع التأكد من أن الجمجمة مستوية. ضع مرهم العين على عيون لمنع الجفاف وألم ما بعد الجراحة.

الآن قم بعمل شق عبر خط الوسط لفروة الرأس لفضح الجمجمة من مدارات العين إلى خياطة لامدا. استخدم مشابك السيرافين لكبح الجلد والحفاظ على الوصول إلى الجمجمة. ثم استخدم عود أسنان لحفر نمط متقلب في جميع أنحاء سطح الجمجمة.

اغسل الحطام الناتج بمحلول ملحي معقم. بعد التجفيف جيدا ، استخدم قطعة قطن لتطبيق 3٪ بيروكسيد الهيدروجين على الجمجمة المكشوفة من حوالي ثانيتين إلى ثلاث ثوان لإنشاء مسام دقيقة. ثم اغسل الجمجمة عدة مرات بمحلول ملحي معقم وجففها جيدا.

بعد حفر نمط رقعة الشطرنج وغسله وتجفيفه في الجمجمة ، مرة أخرى ، أدخل غرسة الألياف البصرية الوحشية في حامل المسبار ثم قم بتوصيلها بالذراع التجسيمي. حدد موقع ثقب البر باستخدام أطلس تجسيمي تمت معايرته إلى bgma و lambda. ثم استخدم مثقاب أسنان دوار لعمل حج قحف صغير يقل قطره عن ملليمتر واحد فوق منطقة الاهتمام ، مع الحرص على عدم كسر الجافية أو إتلاف أي أنسجة.

باستخدام الذراع التجسيمية ، ضع الغرسة في مكانها فوق منطقة الاهتمام مباشرة ، يجب أن تستقر الوحشية على أنسجة الجمجمة المحيطة. استخدم الآن عود أسنان معقم لتطبيق طبقة رقيقة متساوية من أسمنت الأسنان المحضر حديثا عبر الجمجمة وعلى الجزء السفلي من الغرسة. مع الحرص على عدم ملامسة جلد ، يجب أن تغطي الطبقة الأساسية من أسمنت الأسنان أكبر مساحة سطح ممكنة على الجمجمة.

أصعب جانب في هذا الإجراء هو تطبيق الأسمنت السني دون أن يلمس الجلد الشامل. لضمان النجاح ، ضع كميات صغيرة من الأسمنت في كل مرة في طبقات رقيقة وانتظر حتى تجف كل طبقة تماما قبل إضافة الطبقة التالية. ضع طبقات متساوية من أسمنت الأسنان لتشكيل كومة صغيرة فوق الجمجمة وحول الغرسة.

اترك ثلاثة إلى خمسة ملليمترات من الطرف المحدب للأسمنت الوحشي نظيفا للسماح باتصال سلس دون عائق. ثم قم بخياطة فروة الرأس فوق كومة من الأسمنت السني وحول الزرع يمكن استخدام لاصق السندات البيطرية للربط الإضافي بعد الخياطة. أخيرا ، ضع المسكنات الموضعية والمضادات الحيوية على جلد الخياطة وحول قاعدة الغرسة ، ثم ضع الفأر في قفص للتعافي بعد الجراحة.

التجميع الصحيح لغرسة الألياف البصرية والمقرنة إلى الحد الأدنى من فقدان الفوتون بين مصدر الضوء ونهاية الألياف البصرية في المنطقة ذات الاهتمام. في حين أن الألياف البصرية المصقولة يجب أن تنقل الضوء في دائرة متحدة المركز موحدة مماثلة للدائرة الموضحة هنا كما يتضح من هذه الصورة مع الزرع والخياطة الدقيقة ، فإن الغرسة لا تسبب أي تهيج مرئي للفأر ويمكن أن تظل في مكانها للدراسات طويلة المدى دون أي تدهور كبير للألياف البصرية أو لكمية الضوء المنقولة تظهر المقايسات السلوكية الوظيفية في الفأر المستيقظ استجابة مباشرة من التحفيز من خلال الألياف البصرية المزروعة فوق القشرة الحركية كما يتضح من بيانات فيديو الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي التي تظهر تنشيط الخلايا العصبية المستهدفة من خلال الزرع والاستجابة السلوكية للحيوان أثناء تحفيز الدماغ. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التحفيز الضوئي لمناطق الدماغ المستهدفة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما هي أنماط اتصال الدائرة المرتبطة بالخلايا المستهدفة؟

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع غرسات الألياف الضوئية وأسلاك المقرنة ، وكيفية زرعها على أنسجة المخ التي تعبر عن الحمالين البصريين الوراثيين.