Name: الألياف الضوئية للزراعة تحفيز Optogenetic المزمن من أنسجة المخ (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: اكتشف طريقة تحفيز الضوئي مزمن لدوائر عصبية محددة وراثياً باستخدام الألياف الضوئية في الفئران. تقلل هذه التقنية من تلف أنسجة المخ مقارنة بالطرق التقليدية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نعترف بأن وصفت أصلا هذه التقنية من قبل سبارتا وآخرون، 2012 و قد تم تكييفه بسهولة لاستخدامها في المختبر.

* يتم سرد جميع المواد المصنعة منها جنبا إلى جنب مع و / أو البائعين تحت البروتوكول. 1. جمعية زرع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط من الايبوكسي للحرارة قابل للشفاء الألياف البصرية عن طريق إضافة 100 ملغ من تصليب إلى 1 غرام من الراتنج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس وقطع حوالي 35 مم من الألياف البصرية مع ميكرومتر 125 ميكرون الأساسية 100 من سجل ذلك مع الكاتب كربيد تلميح إسفين. وضع عمودي الكاتب إلى الألياف البصرية ونقاط في حركة واحدة أحادي الاتجاه. قطع الألياف سيضر تماما جوهر الألياف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأشار الجانب المحدب إدراج السيراميك LC الطويق 127 ميكرومتر مع تحمل في الرذيلة، إلى أسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الألياف البصرية في الطويق. يجب أن تنزلق في الألياف البصرية بسلاسة وتبرز قليلا إلى ما بعد نهاية محدبة من الطويق (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق قطرة واحدة من الألياف الايبوكسي للحرارة قابل للشفاء البصرية إلى نهاية مسطحة والحرارة مع بندقية الحرارة حتى الايبوكسي سوداء. ينبغي للالايبوكسيملء الطويق وتسخينها وعلاج من قبل. ينبغي أن الايبوكسي علاج داخل حد أدنى 1 ~ من تطبيق الحرارة ثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اي نظيفة من الايبوكسي على طول جانبي الطويق، لأنها سوف تعيق التواصل مع مقرنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلميع نهاية محدبة من الطويق باستخدام الألياف البصرية LC قرص تلميع (FOPD) على أوراق أكسيد الألومنيوم على منصة تلميع تلميع (1B الشكل). جعل أنماط دوران دائري والبولندية أربع درجات في الترتيب التالي: 5، 3، 1 ميكرومتر حصى 0.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الألياف البصرية في نهاية شقة لطول مناسب بحيث تستهدف المنطقة من الفائدة. يمكن تحديد طول باستخدام أطلس التجسيمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار عملية الزرع من خلال توصيله إلى الليزر عبر سلك وصلة الربط هو موضح أدناه. يتم إدراج نهاية مصقول من زرع في كم من مقرنة، وينبغي اجراء اتصالات مباشرة مع الطويق معارضة. يجب أن تكون قادرة على زرع الاحتفاظ ب 10 ميغاواط من ناتج الضوء، ويقاس على الحافة من اله زرع الألياف. وسوف يكون سيئا زرع نقطة ضعف التنسيق بالقرب من غيض من الألياف البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين يزرع النهائية (الشكل 1C) في رغوة حتى الاستخدام. </li></ol> 2. جمعية الألياف البصرية الحبل المقرنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط من الايبوكسي للحرارة قابل للشفاء الألياف البصرية على النحو الوارد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس وقطع بطول مناسب من الألياف البصرية مع ميكرومتر 220 ميكرون الأساسية 200 بواسطة يحرز ذلك مع الكاتب كربيد تلميح إسفين. وينبغي أن طول الألياف تسمح الماوس على التحرك بحرية في جميع أنحاء السكن ولكن لا يسمح الماوس لمضغه من خلال الألياف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الألياف البصرية في طول أنابيب منفرق أطول قليلا من طول الألياف البصرية. ينبغي أن يكون لها أنابيب قطرها الداخلي أكبر قليلا من الألياف البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ~ 25mm في قطاع احدة من نهاية الألياف البصرية وأدخله في نهاية معدنيه MM FC المتعدد الطويق الجمعية مع 230 ميكرومتر تحمل حتى تتوقف. ينبغي أن يلتزم بها الألياف البصرية من خلال ferruجنيه نهاية (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين الاتصال مع CYANOACRYLATE (سوبر الغراء) في نهاية المعادن. تغطية يتصل الحذاء رابط وتلميع نهاية الطويق مع FOPD FC. جعل أنماط دوران دائري والبولندية على أربعة درجات في الترتيب التالي: 5، 3، 1، 0.3 ميكرومتر الحصباء (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجريد وإدراج الطرف الآخر من الألياف البصرية إلى الطويق السيراميك LC (230 ميكرومتر معرف تتحمل) مع نهاية محدبة البعيدة. تطبيق قطرة من الايبوكسي إلى نهاية مسطحة والحرارة حتى يشفى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلميع نهاية محدبة من الطويق باستخدام FOPD FC على رقائق الألمونيوم تلميع أكسيد كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حرك كم والطويق LC عن نهاية محدبة من الطويق حتى منتصف الكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان انكماش الأنابيب خلال أنابيب منفرق والأكمام والحرارة لتأمين وحماية الاتصال (الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار وصلة الربط من خلال توصيله إلى مصدر الليزر وقياس الضوء outpالتحرير من خلال مقرنة مع الطيف. ينبغي أن فقدان ضوء الليزر الناتج بين والإخراج مقرنة قياس لا تتجاوز 30٪. </li></ol> 3. زراعة الجراحية * هذا الإجراء نصائح فقط. أدوات معقمة قفازات ولكن لا تحتاج إلى أن تكون بسبب التلاعب المستمر بين أجهزة وأدوات ومعدات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس مع خليط داخل الصفاق الكيتامين / زيلازين حقن 100 و 10 مغ / كغ على التوالي باستخدام إبرة قياس 30-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق فروة الرأس مع كليبرز. مسح فروة الرأس مع الكحول 70٪ الآيزوبروبيل تليها Betasept مسح (4٪ محلول كلورهكسيدين) لمدة دقيقة، وتكرار مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس في تلاعب sterotaxic وتأمين الرأس، وضمان أن الجمجمة هي المستوى. تطبيق مرهم للعين للعيون لمنع جفاف والألم بعد الجراحة. الحفاظ على التخدير باستخدام volatized isoflurane (1-3٪ المخفف مع الأكسجين تبعا للحالة الفسيولوجية للمذكرة التفاهمحد ذاتها، التي ينبغي رصد مستمر من قبل ردا على قرصة الذيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من خلال إجراء شق خط الوسط من فروة الرأس، ويعرض الجمجمة من مدارات العين لامدا. دفع جانبا النسيج الضام عند الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المشابك سيرافين لابعاد الجلد والحفاظ على الوصول إلى الجمجمة (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر نمط متقلب في جميع أنحاء سطح الجمجمة مع اختيار الأسنان. غسل الحطام بعيدا مع ملحي معقم. يجف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق بيروكسيد الهيدروجين (3٪) إلى الجمجمة تعرض مع مسحة القطن لثانية 2-3 ~ لخلق micropores. يغسل عدة مرات ويجف تماما. وبدلا من ذلك، يمكن مشدود المراسي في الجمجمة، كما هو موضح في سبارتا وآخرون. (2012). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى، وجود نمط متقلب حفر في جميع أنحاء الجمجمة مع اختيار الأسنان ويغسل بمحلول ملحي الحطام. يجف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أداة دوارة، وجعل ثقب صغير لدغ حج القحف (&lt;1 مم في القطر) مع قمة الحفر العقيمة(تعقيمها) فوق المنطقة ذات الاهتمام، والتي تحددها الأطلس التجسيمي لمعايرة bregma وامدا. يجب الحرص على عدم كسر أو تلف أي الجافية الأنسجة. يغسل الحطام ويجف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الطويق الألياف البصرية (زرع) في ماسك التحقيق والاتصال الذراع التجسيمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الزرع في المكان مباشرة فوق المنطقة ذات الاهتمام باستخدام ذراع التجسيمي (الشكل 3B). إذا إدخال الألياف البصرية في أنسجة المخ، ينبغي تقدمت ببطء الألياف بمعدل 2 مم ~ / دقيقة. ينبغي أن يقوم على الطويق الجمجمة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط من الاسمنت الأسنان. يجب أن يكون الخليط اللزوجة منخفضة بما فيه الكفاية لتطبيق بسهولة عبر الجمجمة. وسوف تكون قابلة للاستخدام خليط لمدة 2-4 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مسواك العقيمة، وتطبيق طبقة رقيقة من الاسمنت حتى الأسنان عبر الجمجمة وعلى الجزء السفلي من عملية الزرع. ينبغي للقاعدة طبقة من الاسمنت الأسنان تغطية أكبر قدر مساحة على الجمجمة كماممكن. لا تدع الاسمنت الأسنان تتلامس مع الجلد من الفأرة. وهذا يؤدي إلى صعوبة في زيادة خياطة وكذلك تهيج في الماوس. إذا كان الأسمنت الأسنان لا تأتي في اتصال مع الجلد، واتركه حتى يجف جزئيا بحيث يمكن مقشر طبقة من الاسمنت قبالة كامل قبل الإعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتركه حتى يجف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق طبقات من الاسمنت حتى الأسنان لتشكيل التلة الصغيرة أكثر من الجمجمة وحول زرع، مما يسمح كل طبقة لتجف تماما (الشكل 3C). ~ ترك 3-5 ملم من نهاية محدبة من الطويق من الاسمنت نظيفة للسماح للاتصال، على نحو سلس دون عائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خياطة فروة الرأس على كومة من الاسمنت الأسنان وحول زرع باستخدام العقيمة، خيوط الحرير تستخدم مرة واحدة مضفر (6-0) مع إبرة C22. إزالة بعد 7 أيام. اختياري: استخدام بوند البيطرية للربط إضافية بعد خياطة. تأكد من استخدام الحد الأدنى من التعليم والتدريب المهني بوند. يمكن أن يؤدي إلى زيادة شديدة تلف الجلد بسبب الخدش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فوراذ بعد الجراحة، ينبغي حقن تحت الجلد مع الماوس Ketprophen (5 ملغ / كغ) لتقليل الألم بعد الجراحة. وينبغي تكرار هذا 24 ساعة في وقت لاحق. تطبيق المسكنات الموضعية (Bupivicaine) والمضادات الحيوية (Neosporin) على الجلد وخياطة حول قاعدة عملية الزرع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس في قفص على بطانية التدفئة للتعافي من التخدير. ضع الماوس في العقيمة، قفص الانتعاش بعد العملية الجراحية. يجب القفص الانتعاش لا يحتوي على أية الفراش من أجل الحفاظ على درجة الحرارة وتجنب الاختناق. يمكن إرجاع الماوس إلى قفص أو قفص الأصلي جديد مستيقظا مرة واحدة. </li></ol> جمعية زرع السليم الألياف البصرية مقرنة والنتائج في فقدان الحد الأدنى من الفوتون بين مصدر الضوء ونهاية الألياف البصرية في منطقة الفائدة. يجب الألياف البصرية جيدا مصقول نقل الضوء في موحدة، متحدة المركز الدائرة (الشكل 2D). مع الحذر وغرس خياطة، ويسبب أي تهيج زرع مرئية للالماوس، ويمكن أن تبقى في مكانها لفترة طويلة الأجل دراسات (الشكل 3D،&gt; 1 شهر، الملاحظات غير منشورة) دون أي تدهور كبير من الألياف البصرية أو كمية الضوء المنقولة. يمكن زرع غير لائق أو خياطة يسبب تهيج ويمكن أن تؤدي إلى خدش من خلال الماوس فروة الرأس به، ويعرض الاسمنت الأسنان، أو الكسر من الطويق من الاسمنت الأسنان بسبب التلاعب المستمر. ويمكن الاطلاع على الرسم التخطيطي للنظام تجميعها في الشكل 4. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" /> الشكل 1. جمعية الألياف البصرية القابلة للزرع. (أ) يتم إدراج الألياف البصرية في الطويق، جاحظ طفيف بعد نهاية محدبة دلت عليه رأس السهم. (ب) غير مصقول نهاية محدبة من الطويق باستخدام FOPD على درجات أدق تدريجيا من أوراق تلميع. (ج) الانتهاء من اختيار الألياف القابلة للزرعجيم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" /> الشكل 2. جمعية مقرنة الألياف البصرية المستخدمة في حبل الألياف البصرية مفصل دوار لعملية الزرع. (أ) الخلاف الألياف الضوئية من خلال الجمعية الطويق. (ب) يتم إدراج الجانب الطويق للجمعية في درجات FOPD ومصقول باستخدام أدق تدريجيا من الورق تلميع. (ج) تم تجهيز كم الطويق على الطويق والمضمون مع أنابيب الحرارة يتقلص. (د) ينبغي أن مقرنة الألياف البصرية الانتهاء إنتاج الضوء متحدة المركز مع فقدان الحد الأدنى من الفوتون. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" /> الشكل 3. زرع الجراحية والألياف البصرية. (أ) كامل سطح craniuتتعرض م ويتم مسح النسيج الضام. (ب) عقد زرع الألياف البصرية في موقف مع الذراع التجسيمي. (ج) يتم تطبيق إصلاح الأسنان الاسمنت الألياف البصرية إلى زرع الجمجمة. (د)&gt; 1 بعد شهر الزرع، وتلتئم الجلد حول زرع وليس هناك أي علامات الاحمرار. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" /> الشكل 4. رسم تخطيطي لنظام وظيفي

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li>
<li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li>
<li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li>
<li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li>
<li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li>
</ol>

Optogenetics هي تقنية جديدة تسمح قوية غير مسبوقة خلال مراقبة الخلايا العصبية فرعية محددة. يمكن استغلال هذا لتعديل الدوائر العصبية التشريحية بدقة والزمنية، مع تجنب العشوائية من نوع الخلية والآثار الغازية من خلال التحفيز الكهربائي الكهربائي. غرس الألياف البصرية يسمح للتحفيز، بما يتفق المزمنة من الدوائر العصبية أكثر من جلسات متعددة في اليقظة، يتصرف الفئران بأقل ضرر للأنسجة. هذا النظام، رائدة الأصلية كتبت بواسطة سبارتا وآخرون 8 و تعديلها لتناسب اغراضنا، يخطو خطوة أ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف أو معدات </td><td> شركة </td><td> كتالوج # </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> LC الطويق كم </td><td> منتجات الألياف الدقيقة (PFP) </td><td> SM-CS125S </td><td> 1.25 مم ID </td></tr><tr><td> FC MM ما قبل تجميعها رابط </td><td> PFP </td><td> MM-CON2004-2300 </td><td> 230 ميكرومتر الطويق </td></tr><tr><td> ميلر FOPD-LC القرص </td><td> PFP </td><td> M1-80754 </td><td> لLC الحلقات </td></tr><tr><td> منفرق أنابيب </td><td> PFP </td><td> FF9-250 </td><td> 900 ميكرومتر التطوير التنظيمي، 250 ميكرومتر معرف </td></tr><tr><td> MM LC عصا الطويق 1.25 مم </td><td> PFP </td><td> MM-1270-FER2007C </td><td> التجويف 127 ميكرومتر ID </td></tr><tr><td> MM LC عصا الطويق 1.25 مم </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-2300 </td><td> 230 ميكرومترالتجويف ID </td></tr><tr><td> للحرارة قابل للشفاء الايبوكسي، وتصليب الراتنج </td><td> PFP </td><td> ET-353ND-16OZ </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC وSC / PC رابط القرص تلميع </td><td> ThorLabs </td><td> D50-FC </td><td> لFC الحلقات </td></tr><tr><td> السلطة البصرية الرقمية والطاقة متر </td><td> ThorLabs </td><td> PM100D </td><td> الطيف </td></tr><tr><td> تلميع الوسادة </td><td> ThorLabs </td><td> NRS913 </td><td> 9 &quot;× 13&quot; 50 Durometer و </td></tr><tr><td> أكسيد الألومنيوم اللف (تلميع) ورقة: 0.3، 1، 3، 5 ميكرومتر فريك </td><td> ThorLabs </td><td> LFG03P، LFG1P، LFG3P، LFG5P </td><td></td></tr><tr><td> معيار الألياف تكسية الصلب المتعدد </td><td> ThorLabs </td><td> BFL37-200 </td><td> انخفاض OH، 200 ميكرون الأساسية، 0.37 NA </td></tr><tr><td> تجريد أداة الألياف </td><td> ThorLabs </td><td> T10S13 </td><td> يرتدون / شركةفي: 200 ميكرومتر / 300 ميكرومتر </td></tr><tr><td> السيليكا / السيليكا الألياف البصرية </td><td> Polymicro تكنولوجيا </td><td> FVP100110125 </td><td> عالية OH، UV المحسن، 0.22 NA </td></tr><tr><td> 1X1 مفصل دوار الالياف البصرية </td><td> دوريسي العدسات </td><td> FRJ_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> الالياف البصرية أحادية Patchcord </td><td> دوريسي العدسات </td><td> MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> أنبوب الانكماش الحراري، 1/8 بوصة </td><td> الحليفة للإلكترونيات </td><td> 689-0267 </td><td></td></tr><tr><td> الحرارة بندقية </td><td> الحليفة للإلكترونيات </td><td> 972-6966 </td><td> 250 واط؛ 750-800 ° F </td></tr><tr><td> يميل القطن تطبيقها </td><td> البروتستانتي الطبية منتجات الشركة </td><td> 806-WC </td><td></td></tr><tr><td> VetBond الأنسجة لاصقة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 19-027136 </td><td></td></tr><tr><td> فلاش الاكريليك أسنان قاعدة </td><td> ييتس Motloid </td><td> ColdPourPowder + Liq </td><td></td></tr><tr><td> BONN مصغرة إيريس مقص </td><td> INTEGRA Miltex </td><td> 18-1392 </td><td> 3-1/2 &quot;(8.9cm)، على التوالي، 15 مم شفرات </td></tr><tr><td> جونز هوبكنز بلدغ المشبك </td><td> INTEGRA Miltex </td><td> 7-290 </td><td> 1-1/2 &quot;(3.8 سم)، ومنحني </td></tr><tr><td> MEGA-عزم الدوران الكهربائية مختبر للسيارات </td><td> ناقلات </td><td> EL-S </td><td></td></tr><tr><td> النمر الأزيز الكرة رقم 1 </td><td> كلاركسون مختبر </td><td> 77،1006 </td><td></td></tr><tr><td> البنفسجي الأزرق ليزر نظام </td><td> CrystaLaser </td><td> CK473-050-O </td><td> الطول الموجي: 473 نانومتر </td></tr><tr><td> الليزر التيار الكهربائي </td><td> CrystaLaser </td><td> CL-2005 </td><td></td></tr><tr><td> دومون # 2 الملقط الثقب </td><td> Fالمعهد الوطني للإحصاء أدوات العلوم </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> مسبار </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 10140-02 </td><td></td></tr><tr><td> 5 &quot;المرقأة مستقيم </td><td> Excelta </td><td> 35-PH </td><td></td></tr><tr><td> ملزمة مع الأساس المرجح </td><td> ALTEX إلكترونيات </td><td> PAN381 </td><td></td></tr></tbody></table>

الألياف الضوئية للزراعة تحفيز optogenetic المزمن من أنسجة المخ

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

وكانت أنماط توضيح من اتصالات الخلايا العصبية تحديا لعلم الأعصاب على حد سواء الأساسية والسريرية. وكان معيار الذهب الكهربية لتحليل أنماط الاتصال متشابك، ولكن التسجيلات الكهربية يمكن أن تكون مقترنة مرهقة والحد تجريبيا. وقد أدخلت تطوير optogenetics طريقة لتحفيز الخلايا العصبية أنيقة ودوائر، سواء في المختبر 1 و 2،3 في الجسم الحي. من خلال استغلال خلية من نوع النشاط المروج محددة لدفع السكان في التعبير أوبسين العصبية منفصلة، ​​يمكن للمرء أن تحفز الخلايا العصبية بدقة فرعية محددة وراثيا في دوائر متميزة 4-6. الأساليب المذكورة لتحفيز الخلايا العصبية بشكل جيد، بما في ذلك التحفيز الكهربائي و / أو التلاعب الدوائية، وغالبا ما تكون الخلايا من نوع العشوائي، الغازية، ويمكن أن تلحق الضرر الأنسجة المحيطة بها. يمكن تغيير وظيفة هذه القيود متشابك العادية و / أو السلوك الدائرة. وبالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلكلطبيعة التلاعب، والأساليب المتبعة حاليا في كثير من الأحيان حادة والمحطة الطرفية. Optogenetics يتيح القدرة على تحفيز الخلايا العصبية بطريقة غير ضارة نسبيا، وتستهدف في الخلايا العصبية وراثيا. معظم الدراسات التي تنطوي على استخدام الجسم الحي في optogenetics حاليا الألياف البصرية من خلال الاسترشاد قنية مزروع 6،7، ولكن القيود المفروضة على هذه الطريقة تشمل تلف أنسجة المخ مع تكرار الإدراج من الألياف البصرية، والكسر المحتمل للألياف داخل قنية. نظرا لحقل يزدهر optogenetics، وهي طريقة أكثر موثوقية من التحفيز المزمن هو ضروري لتسهيل الدراسات طويلة الأجل مع الحد الأدنى من ضمانات تلف الأنسجة. هنا نقدم بروتوكول لدينا تعديل في مادة الفيديو لاستكمال أسلوب فعال وأنيق وصفها في سبارتا وآخرون 8 لتصنيع الألياف البصرية على زرع وتثبيت الدائم على الجمجمة من الفئران تخدير، وكذلك جمعية ليفمقرنة البصرية يربط زرع لمصدر الضوء. عملية الزرع، مرتبطة مع الألياف البصرية إلى ليزر الحالة الصلبة، ويسمح لوسيلة فعالة لphotostimulate مزمنة الدوائر العصبية الوظيفية مع أقل تلف الأنسجة 9 باستخدام، للانفصال الصغيرة، الحبال. تثبيت الدائم للزراعة وتوفر الألياف البصرية متسقة، على المدى الطويل في الدراسات المجراة optogenetic الدوائر العصبية في الفئران، مستيقظا يتصرف 10 مع الحد الأدنى من تلف الأنسجة.

تطوير optogenetics يوفر الآن وسيلة لتحفيز الخلايا العصبية بدقة تعريف وراثيا ودوائر، سواء<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;. نحن هنا وصف للجمعية وزرع من الألياف البصرية لضوئي مزمن في أنسجة المخ.

الألياف الضوئية للزراعة تحفيز Optogenetic المزمن من أنسجة المخ

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

الهدف من التجربة التالية هو تنشيط ودراسة الدوائر العصبية على المدى الطويل في الفئران المستيقظة التي تتصرف هذه الطريقة مقتبسة من المفهوم الموصوف في الأصل في Sparta etal. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجميع سلك مزدوج من الألياف البصرية أولا ، والذي يربط المفصل الدوار البصري بغرسة الألياف البصرية.بعد ذلك ، يتم زرع الألياف البصرية فوق أنسجة المخ ذات الأهمية لإنشاء ممر للضوء للانتقال مباشرة إلى القناة التي تعبر عن الخلايا العصبية. أخيرا ، يتم توصيل مصدر الضوء بالمفصل الدوار البصري من أجل إنشاء مسار متصل بشكل متسلسل من مصدر الضوء إلى أنسجة الدماغ. في النهاية ، يمكن تقييم إطلاق النار الناجم عن الضوء لقناة redsin التي تعبر عن الخلايا العصبية بناء على الدراسات في الجسم الحي والفيزيولوجيا الكهربية والدراسات السلوكية.الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل قنيات التوجيه هي أنها تقلل من الضرر الذي يلحق بأنسجة المخ الناجم عن الإدخال المتكرر وإزالة الألياف الضوئية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لوظيفة الدائرة العصبية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى لفهم أفضل للآليات المعتمدة على المشبك والدائرة التي تكمن وراء أنواع معينة من الاضطرابات العصبية. العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية.نظرا لأنه يصعب إتقان خطوات الزرع ، فإن كل خطوة تبدو بسيطة تساهم بشكل كبير في الاستقرار العام وموثوقية الطريقة. ابدأ بقطع 35 ملم من الألياف البصرية بقطر 125 ميكرون مع نواة 100 ميكرون عن طريق وضع كاتب كربيد طرف إسفين عموديا على الألياف البصرية وتسجيل الألياف في حركة واحدة أحادية الاتجاه متبوعة بالسحب للخارج مباشرة. الآن ، أدخل وحشية من السيراميك LC بقطر 127 ميكرون في جانب محدب موجه إلى أسفل في الرذيلة ثم أدخل قطعة الألياف البصرية في الوحشية.يجب أن تنزلق الألياف البصرية بسلاسة وتبرز بشكل هامشي خارج الطرف المحدب للوحشي. بعد ذلك ، ضع قطرة واحدة من الألياف البصرية القابلة للعلاج بالحرارة الطازجة على الطرف المسطح من الوحشي ، ثم ضع مسدسا حراريا على الإيبوكسي. يجب أن يملأ الإيبوكسي الوحشي أثناء تسخينه ويتم معالجته عندما يتحول إلى اللون الأسود.بعد المعالجة ، قم بتنظيف أي إيبوكسي من جوانب الوحشي ، ثم باستخدام قرص تلميع الألياف البصرية LC يجعل أنماط الدوران الدائرية لتلميع الطرف المحدب للوحشي على صفائح تلميع أكسيد الألومنيوم على وسادة تلميع على أربع درجات متناقصة. ثم قم بقص الألياف الضوئية في النهاية المسطحة إلى الطول المناسب لاستهداف منطقة الاهتمام. لاختبار الألياف البصرية المصقولة ، أدخل الطرف المصقول للغرسة في غلاف قارنة التوصيل.حتى يتم الشعور بالاتصال المباشر مع الوحشي المعارض ، سيكون للغرسة السيئة نقطة محورية ضعيفة بالقرب من طرف الألياف البصرية ، في حين أن الغرسة الجيدة ستنقل دائرة ناعمة متحدة المركز من الضوء بدون إخراج. تعمل قوى تصل إلى 10 مللي واط على تخزين الغرسات النهائية في الرغوة حتى الاستخدام. ابدأ هذه الخطوة بقياس ثم تسجيل ألياف بصرية قطرها 220 ميكرون مع نواة 200 ميكرون للسماح للفأر بالتحرك بحرية ولكن لا تسمح للفأر بمضغ الألياف.ثم أدخل الألياف البصرية في قطعة من أنابيب الفراء بقطر داخلي أكبر قليلا وطول أقصر قليلا من تلك الموجودة في الألياف البصرية. الآن ، قم بتجريد حوالي 25 ملم من أحد طرفي الألياف البصرية وأدخلها في الطرف المعدني لمجموعة وحشية FC MM متعددة الأوضاع. مع تجويف قطره 230 ميكرون حتى يتوقف ، يجب أن تبرز الألياف الضوئية من خلال الطرف الوحشي.بعد ذلك ، قم بتأمين الاتصال باستخدام cyanoacrylate في الطرف المعدني وقم بتغطية الوصلة بموصل تمهيد الطرف الوحشي بقرص تلميع FC كما هو موضح للتو. بعد تجريد الطرف الآخر من الألياف البصرية ، أدخله في وحشية من السيراميك LC مع الطرف المحدب البعيد فقط. ثم ضع قطرة من الايبوكسي على الطرف المسطح وسخنها حتى تشفى كما هو موضح للتو.بعد تلميع الطرف المحدب للوحشي كما هو موضح للتو ، حرك الأكمام الوحشية LC فوق الطرف المحدب من الوحشي حتى يصل الوحشي إلى منتصف الأكمام. ثم ضع أنبوبا يتقلص الحرارة فوق الأنبوب والأكمام وقم بتسخين أنبوب الانكماش الحراري لآمن وحماية الاتصال. أخيرا ، قم بتوصيل الوحشي بمصدر الليزر ثم اختبره عن طريق قياس ناتج الضوء من خلال قارنة التوصيل باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، ويجب ألا يتجاوز فقدان الضوء بين إخراج الليزر وإخراج المقرنة المقاس 30٪ قبل بدء الجراحة.تطهير المنطقة الجراحية بالكحول الجانبي isop متبوعا بمحلول الكلورهيكسيدين. بعد ذلك ، ضع الماوس في جهاز التجسيم وقم بتأمين الرأس مع التأكد من أن الجمجمة مستوية. ضع مرهم العين على عيون لمنع الجفاف وألم ما بعد الجراحة.الآن قم بعمل شق عبر خط الوسط لفروة الرأس لفضح الجمجمة من مدارات العين إلى خياطة لامدا. استخدم مشابك السيرافين لكبح الجلد والحفاظ على الوصول إلى الجمجمة. ثم استخدم عود أسنان لحفر نمط متقلب في جميع أنحاء سطح الجمجمة.اغسل الحطام الناتج بمحلول ملحي معقم. بعد التجفيف جيدا ، استخدم قطعة قطن لتطبيق 3٪ بيروكسيد الهيدروجين على الجمجمة المكشوفة من حوالي ثانيتين إلى ثلاث ثوان لإنشاء مسام دقيقة. ثم اغسل الجمجمة عدة مرات بمحلول ملحي معقم وجففها جيدا.بعد حفر نمط رقعة الشطرنج وغسله وتجفيفه في الجمجمة ، مرة أخرى ، أدخل غرسة الألياف البصرية الوحشية في حامل المسبار ثم قم بتوصيلها بالذراع التجسيمي. حدد موقع ثقب البر باستخدام أطلس تجسيمي تمت معايرته إلى bgma و lambda. ثم استخدم مثقاب أسنان دوار لعمل حج قحف صغير يقل قطره عن ملليمتر واحد فوق منطقة الاهتمام ، مع الحرص على عدم كسر الجافية أو إتلاف أي أنسجة.باستخدام الذراع التجسيمية ، ضع الغرسة في مكانها فوق منطقة الاهتمام مباشرة ، يجب أن تستقر الوحشية على أنسجة الجمجمة المحيطة. استخدم الآن عود أسنان معقم لتطبيق طبقة رقيقة متساوية من أسمنت الأسنان المحضر حديثا عبر الجمجمة وعلى الجزء السفلي من الغرسة. مع الحرص على عدم ملامسة جلد ، يجب أن تغطي الطبقة الأساسية من أسمنت الأسنان أكبر مساحة سطح ممكنة على الجمجمة.أصعب جانب في هذا الإجراء هو تطبيق الأسمنت السني دون أن يلمس الجلد الشامل. لضمان النجاح ، ضع كميات صغيرة من الأسمنت في كل مرة في طبقات رقيقة وانتظر حتى تجف كل طبقة تماما قبل إضافة الطبقة التالية. ضع طبقات متساوية من أسمنت الأسنان لتشكيل كومة صغيرة فوق الجمجمة وحول الغرسة.اترك ثلاثة إلى خمسة ملليمترات من الطرف المحدب للأسمنت الوحشي نظيفا للسماح باتصال سلس دون عائق. ثم قم بخياطة فروة الرأس فوق كومة من الأسمنت السني وحول الزرع يمكن استخدام لاصق السندات البيطرية للربط الإضافي بعد الخياطة. أخيرا ، ضع المسكنات الموضعية والمضادات الحيوية على جلد الخياطة وحول قاعدة الغرسة ، ثم ضع الفأر في قفص للتعافي بعد الجراحة.يؤدي التجميع الصحيح لغرسة الألياف البصرية والمقرنة إلى الحد الأدنى من فقدان الفوتون بين مصدر الضوء ونهاية الألياف البصرية في المنطقة ذات الاهتمام. في حين أن الألياف البصرية المصقولة يجب أن تنقل الضوء في دائرة متحدة المركز موحدة مماثلة للدائرة الموضحة هنا كما يتضح من هذه الصورة مع الزرع والخياطة الدقيقة ، فإن الغرسة لا تسبب أي تهيج مرئي للفأر ويمكن أن تظل في مكانها للدراسات طويلة المدى دون أي تدهور كبير للألياف البصرية أو لكمية الضوء المنقولة تظهر المقايسات السلوكية الوظيفية في الفأر المستيقظ استجابة مباشرة من التحفيز من خلال الألياف البصرية المزروعة فوق القشرة الحركية كما يتضح من بيانات فيديو الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي التي تظهر تنشيط الخلايا العصبية المستهدفة من خلال الزرع والاستجابة السلوكية للحيوان أثناء تحفيز الدماغ. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التحفيز الضوئي لمناطق الدماغ المستهدفة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما هي أنماط اتصال الدائرة المرتبطة بالخلايا المستهدفة؟بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع غرسات الألياف الضوئية وأسلاك المقرنة ، وكيفية زرعها على أنسجة المخ التي تعبر عن الحمالين البصريين الوراثيين.

fiber-optic-implantation-for-chronic-optogenetic-stimulation-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يمكن أن الخلايا العصبية البالغين المولودين في البصلة الشمية تسيطر optogenetically Channelrhodopsin2 باستخدام الحقن ، معربا عن lentiviral في تيار الهجرة منقاري وضوئي المزمنة مع مصغرة زرع الصمام.

الفيروسية تنبيغ الانتقائي للبالغين المولودين في الخلايا العصبية الشمية لالمزمنة في الجسم الحي تحفيز Optogenetic

التطور الأخير من الأدوات التي تجمع بين علم الأعصاب وعلم الوراثة وعلم البصريات، ووصف "optogenetics"، وتمكن من السيطرة على النشاط الدوائر العصبية مع مستوى غير مسبوق من القرار المكانية والزمانية. هنا نقدم بروتوكول للدمج في تسجيل المجراة مع التلاعب optogenetic من مجموعات فرعية محددة وراثيا من الخلايا العصبية الهرمية الفص الجبهي القشرية ومرفدي.

وهناك طريقة للتحكم عالي الدقة Optogenetic من الخلايا العصبية الفردية الهرمية<em&gt; في الجسم الحي</em

أصبحت  البصريات الوراثية أداة قوية للاستخدام في تجارب علم الأعصاب السلوكي. يقدم هذا البروتوكول دليلا تفصيليا لتصميم وإعداد أنظمة الليزر ، ويوفر بروتوكولا كاملا لتنفيذ العديد والمتزامنة في الجسم الحي من التحفيز البصري الوراثي المتوافق مع معظم نماذج الاختبار السلوكي للقوارض.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

يصف هذا البروتوكول الخطوات وتحليل البيانات المطلوبة لإجراء التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي البصري الوراثي (ofMRI) بنجاح. OFMRI هي تقنية جديدة تجمع بين قراءة الرنين المغناطيسي الوظيفي عالي المجال والتحفيز البصري الوراثي ، مما يسمح برسم خرائط خاصة بنوع الخلية للدوائر العصبية الوظيفية وديناميكياتها عبر الدماغ الحي بأكمله.

التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي علم البصريات الوراثي

وهنا نقدم طريقة لإيصال النواقل الفيروسية التعبير في الدماغ باستخدام الأفلام fibroin الحرير. هذا الأسلوب يسمح التنفيذ الهادف لناقلات التعبير باستخدام الألياف البصرية المغلفة بالحرير/إف ومدبب من الألياف الضوئية ونوافذ الجمجمة.

في فيفو التعبير المستهدفة من البروتينات أوبتوجينيتيك باستخدام الأفلام الحرير/إف

مع التلاعب optogenetic من مجموعات عصبية محددة أو مناطق الدماغ، يمكن تعديل السلوك مع ارتفاع دقة الزمان والمكانية في الحيوانات تتحرك بحرية. باستخدام أدوات optogenetic مختلفة في تركيبة مع الألياف البصرية المزروعة بشكل مزمن، يمكن تنفيذ مجموعة متنوعة من التشكيلات العصبية والاختبار السلوكي.

Optogenetic التلاعب بالنشاط العصبي لتعديل السلوك في الفئران تتحرك بحرية

هنا ، نقدم طريقة تصنيع نظام optrode مع ألياف بصرية لتوصيل الضوء ومجموعة قطب كهربائي للتسجيل العصبي. في الجسم الحي ، تظهر التجارب مع الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن قناة رودوبسين-2 جدوى النظام للتحفيز البصري الوراثي المتزامن والتسجيل الكهروفسيولوجي.

مصفوفة Optrode للتعديل البصري الوراثي المتزامن والتسجيل العصبي الكهربائي

يفصل هذا البروتوكول إجراء جراحيا لإجراء جراحة الحبل الشوكي ولزرع وتأمين ساق بصرية فوق الحبل الشوكي في القوارض.

زرع الأجهزة الإلكترونية الضوئية في الحبل الشوكي للقوارض

لقد طورنا نهجا مبسطا وفعالا من حيث التكلفة لتصنيع الأقطاب الكهربائية وأجرينا تسجيلات للإشارات عبر مناطق متعددة في الفئران التي تتحرك بحرية. مكن استخدام علم البصريات الوراثي ، جنبا إلى جنب مع الفيزيولوجيا الكهربية متعددة المناطق وتسجيل إشارة الكالسيوم ، من الكشف عن الأنشطة العصبية عبر المناطق في نموذج إشعال النوبات.

طريقة متكاملة لصياغة Optrodes الفيزيولوجية الكهربية المرنة والمريحة للتسجيل متعدد المناطق في الجسم الحي

يوفر هذا البروتوكول طريقة متكاملة تشمل توصيل الفيروس، وزرع الأوبترود، والتحفيز الضوئي الخثري، وتسجيل النشاط النجمي والنشاط العصبي في نفس الوقت، والتحفيز البصري للخلايا النجمية. تهدف هذه الطريقة المتكاملة إلى تقديم دراسة متزامنة لعلاقة الخلايا النجمية والعصبون عبر المراحل الحادة إلى المزمنة للسكتة الدماغية الإقفاري.

طريقة متكاملة لنمذجة السكتة الضوئية وتسجيل الأوبترود البصري للنشاط العصبي والنجمي في الفئران السلوكية

اكتشف طريقة تحفيز الضوئي مزمن لدوائر عصبية محددة وراثياً باستخدام الألياف الضوئية في الفئران. تقلل هذه التقنية من تلف أنسجة المخ مقارنة بالطرق التقليدية.

الألياف الضوئية للزراعة تحفيز Optogenetic المزمن من أنسجة المخ

استكشف المزيد من الفيديوهات