تجهيز رأب الثدي لحد من استئصال الثدي والأنسجة البشرية للثقافة الخليوي

يهدف هذا البروتوكول إلى عزل الأجزاء الظهارية من الغدة الثديية الخالية من الخلايا اللحمية الثديية المرتبطة بها. ابدأ بالتشريح المتراكم للمادة الجراحية المرتجعة لإثراء الهياكل الظهارية باستخدام الهضم الأنزيمي. افصل العضيات الظهارية عن المادة اللحمية خارج الغشاء القاعدي.

ثم قم بمعالجة العضيات المهضومة من خلال مصافي خلايا بحجم المسام الثابت للحصول على الكسور المخصبة. قم بزرع العضيات للاستزراع الفوري أو تجميد المخزونات لاستخدامها في المستقبل. في النهاية ، تستخدم العضيات الظهارية لتوليد ثقافات طويلة الأمد للخلايا الظهارية الثديية البشرية الطبيعية.

لقد طورت هذه الطريقة لأول مرة في أواخر السبعينيات من القرن العشرين من أجل النهوض بمجال بيولوجيا الخلايا الظهارية البشرية وتكوين التسرطن. كانت المواد الجراحية الوفيرة من أنسجة الذاكرة البشرية الطبيعية متاحة. ما كان مطلوبا هو طريقة لمعالجة هذه المادة غير المتجانسة السائبة لجعلها مناسبة لزراعة الخلايا الظهارية النقية والوسائط لدعم النمو على المدى الطويل.

العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا ، لا سيما لملاحظة كيفية إجراء التشريح الخام. كيف تبدو العضيات المهضومة بشكل صحيح؟ تصفية العضيات وطلاء العضيات للثقافة.

ميزة هذه التقنية هي أنها توفر كسور ظهارية نظيفة للسدى وتبقى الخلايا الظهارية سليمة. العضيات ، التي وجدناها ، تعطي أفضل نمو أولي وتزيد من عدد الخلايا التي يمكن الحصول عليها. سيقوم عالمان من مختبر لورانس بيركلي الوطني ، جيمس غارفي ومارك ليبارج الآن بتوضيح هذا الإجراء من المواد المهملة للإجراءات الجراحية.

الحصول على أنسجة الثدي البشري في حاويات معقمة تحتوي على عازلة أو وسط كامل بالإضافة إلى مضادات حيوية عند أربع درجات مئوية. قطع قطع من الأنسجة ووضعها في طبق زجاجي كبير معقم. افصل المناطق الظهارية عن المصفوفة اللحمية للأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة والأوعية الدموية.

قم بتشريح الخيوط البيضاء للمناطق الظهارية المضمنة في المصفوفة اللحمية الصفراء. امسك المادة بالملقط واكشط المادة الدهنية الشديدة بمشرط. ثم باستخدام مشارط متعارضة ، قم بتقطيع الأنسجة الظهارية إلى قطع أربعة ملليمترات تقريبا لتسهيل الهضم.

انقل الأنسجة الظهارية المقطعة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 أو 15 مليلتر في الأنسجة الليفية بشدة. سيكون هناك المزيد من المواد البيضاء غير الظهارية الصلبة. إذا كان من الصعب تشريح الخلايا الظهارية من هذه المصفوفات الليفية.

يمكن تقطيع الأنسجة إلى قطع مساحة واحدة إلى ثلاثة ملليمترات مربعة وهضمها بشكل منفصل. املأ الأنبوب بوسائط الهضم التي تحتوي على الكولاجيناز الخام وأيام اللور العالية ، مع ترك مساحة هوائية صغيرة للسماح بالخلط أثناء الدوران. احتضان العينة طوال الليل عند 37 درجة مئوية على دوار 360 درجة عند ثمانية دورات في الدقيقة بعد الهضم.

بيليه العينات بالطرد المركزي 600 جم لمدة خمس دقائق. تخلص من الدهون الطافية والوسط باتباع الإرشادات المؤسسية للتخلص من الأنسجة البشرية. لمراقبة هضم الأنسجة, قم بتخفيف Eloqua صغيرة من الحبيبات في وسط وفحصها مجهريا في العضيات المهضومة بالكامل ستظهر السدى المرفق.

كرر عملية الهضم الأنزيمي حتى يتم هضم الأنسجة تماما إلى عضيات نقية. إذا كانت هناك حاجة إلى هضم ثان بين عشية وضحاها ، فقد يلزم تقليل تركيز الإنزيمات لمنع الهضم الزائد. ستظهر العضيات المهضومة بشكل صحيح هياكل سنخية قنوية أو سنخية قنوية ذات مظهر ناعم خالية من السدى المرفق.

عند اكتمال الهضم ، قم بتعليق الحبيبات النهائية في مكان متوسط المضادات الحيوية. مرر العينة المهضومة في quats من خلال مصفاة معقمة 100 ميكرون فوق أنبوب معقم سعة 50 مل. بعد تصريف الوسيط في الأنبوب ، اغسل العضيات بثلاثة ملليلتر من المتوسط.

كرر حتى يتم نقل كل الحبيبات المعلقة. ثم اقلب الفلتر بحذر فوق أنبوب معقم واغسل العضيات في الأنبوب بمزيد من المتوسطة. هذا هو التجمع العضوي 100 ميكرون.

الآن قم بتمرير المادة التي تم تصريفها في الأنبوب الأصلي سعة 50 مليلتر من خلال مصفاة 40 ميكرون لفصل الهياكل السنخية عن بركة الترشيح للخلايا المفردة والكتل الصغيرة من الخلايا الوسيطة والظهارية وقطع صغيرة من أنسجة الأوعية الدموية. جهاز الطرد المركزي 100 ميكرون 40 ميكرون وترشيح الأحواض عند 600 غرام لمدة خمس دقائق. أعد تكوين كل عينة باستخدام مليلتر واحد من ccpm.

محلول تجميد لكل 0.1 مل من الحنك المعبأ. يحفظ عند أربع درجات مئوية. ضع بعناية 0.1 ملليلتر من كل من البركتين العضويات.

قطرة قطرة في توزيع متساو على طبق واحد أو 2 35 ملم. تجنب خدش سطح الطبق بعد بضع دقائق من السماح للعضويات بالالتصاق. أضف وسائط النمو ببطء لتجنب إزاحة العضيات.

ثم احتضان الثقافات الأولية عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة. أيضا بذرة 0.1 مليلتر من بركة الترشيح مباشرة على بلاستيك زراعة الأنسجة مع وسط الخلايا الليفية. احتضان الثقافات الأولية عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة.

بعد 24 إلى 48 ساعة ، تحقق من هجرة الخلايا من العضيات وبعد يومين إلى ثلاثة أيام ، راقب ثقافة النمو الانقسامي. الخلايا القريبة من التقاء تجديد الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام. قد تلتصق قطع صغيرة من الأوعية الدموية وتؤدي إلى نمو خلايا الخلايا الليفية.

في حالات نمو الخلايا الليفية بشكل كبير. قم بإجراء التربس التفاضلي لإزالة الخلايا الليفية من البقع الظهارية الكبيرة. اغسل الخلايا مرة واحدة في المخزن المؤقت STE.

ثم أضف 0.5 مل STE طازج لتغطية الطبق فقط بمراقبة مجهرية مستمرة وضربات لطيفة ولكن حادة للطبق على سطح صلب. ابحث عن انفصال الخلايا الليفية بينما لا تزال الخلايا الظهارية ممرا ملتصقا. الثقافات الأولية عندما تقترب بقع النمو الظهاري من التقاء.

للاحتفاظ بالثقافة الأولية وإنشاء ثقافات ثانوية متعددة ، استخدم التربسين الجزئي. اغسل الخلايا مرة واحدة في المخزن المؤقت STE ، ثم أضف STE الطازج لتغطية الطبق فقط. راقب أن ما يقرب من 50٪ من الخلايا قد انفصلت.

ثم أضف ملليلترين من المصل الذي يحتوي على وسط النمو وحصاد الخلايا. ثم انقل الخلايا إلى أنبوب معقم سعة 15 مليلتر بعد غسلتين. تجميع الخلايا المحصودة والثقافة يمكن تكرار التقسيم الجزئي حوالي أربع إلى ثماني مرات مع إعادة نمو الخلايا الجيدة من الأطباق الأولية وبنمو طويل الأمد مكافئ من الزراعة الفرعية أو الثانوية المجمدة.

نوصي بتجميد الخلايا من أول عملية تربسين جزئية لحفظها واستخدام الخلايا من PT الثاني للزراعة الفرعية. عندما يتم هضم الأنسجة وتصفيتها بشكل مناسب ، يمكن رؤية العضيات المعروضة والهياكل القنوية والسنخية بحواف ناعمة خالية من السدى المرفق. إذا تم هضمها بشكل غير مهضوم ، فسيكون هناك مواد متصلة والمزيد من تلوث الخلايا الليفية إذا تم هضمها بشكل مفرط ، فستكون الحواف خشنة وسيكون المرفق أقل كفاءة بعد التعلق العضوي.

يبدأ النمو الظهاري في غضون 48 إلى 72 ساعة بعد 48 ساعة. لا يوجد بعد انقسام خلوي نشط مع انقسام مرئي بمقدار 72 ساعة. يجب أن يصبح الانقسام أكثر وضوحا.

يمكن أن تكون القطع الصغيرة من الأوعية الدموية مصدرا لنمو الخلايا الوسيطة بعد أربعة أيام. تظهر النتوءات الظهارية مجموعات غير متجانسة شكليا هنا تلطيخ بالأجسام المضادة للكيراتين 14 والكيراتين 19 تشير إلى السلالات العضلية الظهارية الإيجابية K 19 والحمراء K 14 الإيجابية ، وكذلك الخلايا السلفية الإيجابية K 14 الصفراء K 19. يمكن استزراع HMEC في تركيبات وسائط مختلفة.

ستدعم الوسائط منخفضة الإجهاد مثل M 87 a المكملة بتوكسين الكوليرا والأوكسيتوسين النمو الفائق على المدى الطويل لHMEC الطبيعي قبل الركود ، بالإضافة إلى نمو سلالات HMEC المتعددة. توضح نتائج تحليل الحقائق تنوع النسب في العضيات غير المستزرعة وفي المقطع الرابع ، تم استزراع HMEC في M 87 ، وسط. هنا ، يتم تحديد التجمعات اللمعية والظهارية العضلية من خلال التعبير عن العلامات اللمعية ، EPCA و CD 2 27 والعلامات الظهارية العضلية CD 49 F و CD 10 المعاد طلحونها.

المقطع الرابع ، HMEC. تم تأكيد نسالة الحقائق المخصبة للعلامات اللمعية والظهارية السابقة باستخدام تحليلات التألق المناعي للكيراتين K 14 و K 19 HMEC. المستزرعة على البلاستيك لمرور أربعة قادرة على تكوين هياكل منظمة مع في الجسم الحي مثل علاقات النسب للخلايا اللمعية والظهارية العضلية عند وضعها في CD المناسب 2 و 27 و CD 10 تستخدم لإثراء هاتين السلالتين.

تحتفظ HMCs بقدرتها على تكوين تنظيم مناسب للخلايا ثلاثية الأبعاد في آبار صغيرة ثلاثية الأبعاد ذات منقوشة دقيقة مع خلايا لمعة داخلية للخلايا الظهارية العضلية. الحقائق يمكن أن تشكل الخلايا السلفية المخصبة أيضا هياكل ثلاثية الأبعاد قوية عند طلاءها في matrigel تحاكي الهياكل القنوية والسنخية. تظهر الهياكل ثلاثية الأبعاد في Matrigel أيضا التنظيم الذاتي ثلاثي الأبعاد المناسب.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية الأجزاء الظهارية من الغدة الثديية الخالية من السدى الثديي المرتبط. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية على مدار يومين إلى ثلاثة أيام. تقنية معالجة الأنسجة واضحة بشكل عام.

من المهم أن تتذكر إيقاف الهضم عند النقطة الصحيحة.