تحليل الفئران خلايا شوان التنمية جنبا إلى جنب المحوار النامي

الهدف من التجربة التالية هو تحليل تطور خلايا شوان على طول المحاور النامية ، موطنها الطبيعي. يتم تحقيق ذلك من خلال العقد العنقية العنقية العليا ، أو S cgs من أجنة الفئران على مصفوفات الكولاجين كخطوة ثانية. يتم التعامل مع S cgs بعامل نمو الأعصاب أو NGF ، مما يسهل النمو المحوري من الخلايا العصبية SCG بطريقة إكليلية.

بالإضافة إلى النمو المحوري من X explan ، يمكن ملاحظة خلايا شوان الداخلية وهي تهاجر على طول المحاور الممتدة باتجاه المحيط. يمكن تحليل تطور خلايا شوان عن طريق التصوير بفاصل زمني وأيضا عن طريق تحليل نقطة النهاية للأنسجة الثابتة ، مما يتيح قياسات المسافة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل مقايسة هجرة الخدش ، هي أن الموطن الطبيعي لخلايا البجعة مدرج في هذا الفحص.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية. حيث أن التجميع الصحيح لمقاييس الكولاجين والتشريح الصحيح ل sgs هما مفتاح النجاح. هذه الخطوات ليست صعبة بشكل خاص للتعلم.

إنهم يحتاجون فقط إلى الممارسة أولا. أثناء العمل في مزرعة الأنسجة ، فهم غطاء المحرك ظروفنا مع جميع الحلول على الجليد. تحضير وسط زراعة المخزون ، وكولاجين ذيل الفئران وفقا للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب.

امزج 800 ميكرولتر من كولاجين ذيل الفئران مع 210 ميكرولتر من وسط المخزون. بدون إدخال فقاعات ، يجب أن يظل المحلول باللون الأحمر. إذا تحول المحلول إلى اللون الأصفر ، فإن محلول كولاجين راتال يكون حمضيا للغاية ويحتاج إلى إعادة تصنيعه بتركيز أكبر من ماصة هيدروكسيد الصوديوم 100 تحرير دقيق من المحلول في كل بئر من شريحة متعددة الآبار وتأكد من تغطية قاع كل بئر بالكامل.

ضع الأطباق في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة على درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين. بعد الحصاد ، يتم وضع أجنة E 16 إلى E 18 في طبق بتري يحتوي على PBS ثم يتم تشريحها من السلى وقطع رأسها عند مستوى الترقوة C. ثم يتم نقل مناطق الرأس والرقبة إلى طبق قاع من السيليكون ، وأثناء النظر من خلال مجهر تشريح ، يتم استخدام إبر الحشرات لتثبيت الأنسجة في المناطق تحت الفك السفلي والترقوة.

استخدم الآن الملقط لإزالة الجلد والأنسجة تحت الجلد في المنطقة تحت الفك السفلي. ثم قم بإزالة الغدد اللعابية تحت الفك السفلي للكشف عن العضلات فوق اللامية ، وتحت الحمراء ، والعضلات القصية الترقوية الخشائية. بعد ذلك ، استخدم الملقط لإزالة عضلات القشرة تحت الحمراء والعضلات القصية الترقوية الخشائية بعناية للكشف عن الحنجرة والقصبة الهوائية.

أمسك القصبة الهوائية بالملقط وارفع القصبة الهوائية والحنجرة. بمجرد إزالة الحنجرة والقصبة الهوائية ، تكون الشرايين السباتية مرئية ، وهما جانبان من عضلات ما قبل الفقرات. تقع العقد العنقية العلوية في تشعب الشرايين السباتية ويمكن تحديدها على أنها شكل بيضاوي.

استخدم ملقطا وحامل إبرة مركب بإبرة حشرات لإزالة العقد العنقية العلوية وضعها في طبق جديد يحتوي على PBS ثم قم بتشريح أي أوعية دموية أو أنسجة متصلة من العقد. بمساعدة إبر الحقنة ، قم بإزالة المواد الهلامية الكولاجين الجيلاتينية من الحاضنة واستخدم إبر الحقنة المثبتة على المحاقن لنقل العقد إلى المواد الهلامية. ضع النباتات في حاضنة زراعة الأنسجة على درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والظروف الرطبة لمدة ساعة إلى ساعتين.

بعد ساعة إلى ساعتين من الحضانة ، يتم استرداد التحويلات العقدية العنقية العلوية من حاضنة زراعة الأنسجة ويضاف 100 ميكرولتر من الوسط القاعدي العصبي الذي يحتوي على الجلوتامين المكمل B 27 والمضادات الحيوية إلى كل xplan. بعد ذلك ، 200 ميكرولتر من الوسط القاعدي العصبي يحتوي على 60 نانوغرام لكل ملليلتر. يضاف NGF أيضا إلى الآبار لتسهيل النمو المحوري.

يمكن أيضا إضافة مواد الاختبار في هذا الوقت ، والتي يتم تعريفها على أنها يوم في المختبر صفر لدراسة التأثير على خلايا البجعة التي بدأت بالفعل في الهجرة. يمكن إعطاء مواد المحاور في ثلاثة أيام في المختبر عن طريق إزالة 180 ميكرولتر من الوسائط الموجودة واستبدالها ب 200 ميكرولتر من الوسائط التي تحتوي على المادة ذات الأهمية و NGF بضعف التركيز النهائي ، ويتم إجراء التصوير بفاصل زمني باستخدام إعداد مجهر مقلوب سيمكن من حضانة ثقافة الخلايا المتوازية والتصوير بفاصل زمني لمقارنة مواد الاختبار المختلفة. في إحدى التجارب، يوصى بإعداد متعدد المواضع في نقطة نهاية التجربة.

بعد تثبيت المزرعات داخل شرائح المزرعة مع 4٪ PFA لمدة ثلاث إلى أربع ساعات والغسيل باستخدام PBS قم بإجراء الكيمياء المناعية للتحقق من صحة النبتة X حيث يقوم SCG بمنع الأنسجة مع PBS الذي يحتوي على 10٪ مصل حمار عادي و 2٪ تريتون X 100 لمدة ساعتين. ثم اتبعه بحضانة الأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب طوال الليل. في اليوم التالي بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، قم بنقل X explan المحتوي على المواد الهلامية إلى صفيحة 24 بئرا بعد الغسيل باستخدام PBS ، واحتضان الأجسام المضادة الثانوية المسمى بالفلورسنت لمدة ساعتين أثناء حمايتها من الضوء ، ثم اغسلها باستخدام PBS واحتضانها بمحلول ناعم لمدة 10 دقائق.

بعد الغسيل عدة مرات ، ضع المواد الهلامية التي تحتوي على X explan على المجهر ، ثم حركها وجففها ثم قم بتثبيتها مع لحم العجل. استخدم مجهر فلورسنت قياسي للحصول على صور للتحليل الكمي لاحقا. من المفيد أن يكون برنامج المجهر قادرا على تسجيل البيانات الوصفية.

يمكن إجراء التحليل الكمي للصور التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج Fiji أو ImageJ ، والذي يمكن استخدامه مجانا للتطبيقات العلمية. يظهر هذا الفيلم النمو المحوري من SCGX EXPLAN التخطيطي على مدار أربعة أيام في المختبر. يمكن إجراء الكيمياء المناعية في اليوم الرابع في المختبر لتحديد العقدة المستزرعة بوضوح.

كعقدة متعاطفة ، يمكن ملاحظة خلايا شوان وهي تهاجر على طول المحور العصبي ، وتنتقل من العقدة العنقية العلوية إلى المحيط. يعرض هذا الفيديو نمط الترحيل نفسه كما رأينا للتو بتكبير أعلى. يمكن قياس مسافات الهجرة بسهولة على عينات مضادة للنوى باستخدام DPI عن طريق قياس المسافة من نوى خلايا شوان الرائدة إلى حدود SCG المزروع في مواقع متعددة كما هو موضح في التخطيطي وصورة عينة معالجة DPI المسماة NGF في أربعة أيام في المختبر ، يظهر هذا الفيلم هجرة خلايا شوان على حدود تخطيط SCG.

الجمع بين المجال الساطع والفلورة تصور خلايا البجعة الإيجابية S 100 GFP والمحاور. أخيرا ، يظهر هذا الفيلم هجرة خلايا شوان على حدود عقدة عنق الرحم العليا explan. هنا يتم عرض القناة الفلورية فقط مما يتيح تفسيرا أسهل لخلايا شوان الإيجابية S 100 GFP.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تحليل كمي إضافي مثل القياس الكمي لتكاثر خلية واحدة أو القياس الكمي لموت الخلايا المبرمج لخلية واحدة. بالطبع ، يجب إجراء الكيمياء المناعية الكافية لتحليل نقطة النهاية أو يجب استخدام المعدلة وراثيا المحددة لإظهار التأثيرات في السياق الحي.