تحليل وظائف الجينات والتخيل ولدت سيليا من تدفق السوائل في حويصلة كوبفر
مارس 31, 2013
أهداب ولدت في تدفق السوائل حويصلة كوبفر (KV) تسيطر على اليسار واليمين الزخرفة الجنين الزرد. هنا، نحن تصف تقنية لتعديل وظيفة الجين في الخلايا على وجه التحديد KV. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا كيفية توصيل الخرز الفلورسنت في KV لتصور تدفق السوائل.
الهدف من هذا الإجراء هو تعديل الجينات الوظيفية في حوصلة كافاس أو KV في جنين الزرد المسؤول عن الزخرفة اليسرى اليمنى وتحليل تدفق السائل غير المتماثل الناتج عن كليا motil عن طريق توصيل حبات الفلورسنت في kv. يتم تحقيق ذلك عن طريق حقن قليل النوكليوتيدات الفلورية التي تمنع التعبير عن جين معين ذي أهمية في خلية صفار البيض لجنين مرحلة ديلا في منتصف الصفيحة ، بحيث يتم تحميلها في الخلايا الظهرية الرائدة التي تؤدي إلى ظهور kv. بعد ذلك ، يتم اختيار الأجنة المحقونة التي تحتوي على مورفو فلوري فقط في خلية صفار البيض و kv لمزيد من التحليل.
ثم يتم تركيب الأجنة في شرائح الاكتئاب ويتم حقن حبات الفلورسنت في تجويف الحويصلة المملوءة بالسوائل في kv. أخيرا ، يتم استخدام الفحص المجهري بالفيديو لتسجيل الخرزات المتدفقة داخل kv. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تحدد ما إذا كان استنفاد الأنسجة الخاص بالجين المرشح في KV يغير تدفق السوائل غير المتماثل من خلال التحليل الكمي لحركات الخرز.
يعدالعرض الفيروسي لهذا الفصل الدراسي أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم حقن المولينو الخاصة بالمرحلة وحقن الخرز الفلوري لأن كلاهما يعتمد على اقتراح الجنين وتوقيت نمو التجربة. لإجراء حقن التحويل العالمي أو MO ، اجمع الأجنة مباشرة بعد الإخصاب وقم بتحميلها في لوحة الحقن. استخدم نارا مصقولة خلف الماصة لوضع الأجنة في صفيحة الحقن لشل حركة الأجنة.
اكسر طرف إبرة الحقن واضبط إعدادات الحقن لإنشاء قطرة حقن بحجم نانولتر واحد. باستخدام مجهر تشريح ، قم بحقن نانولتر واحد من MO في نير ما لا يقل عن 50 جنينا بين مرحلتي الخلية الواحدة والأربع مرحلتين. بالنسبة لحقن M mo المستهدف DFC ، اجمع الأجنة مباشرة بعد الإخصاب واحتضانها عند 28.5 درجة مئوية.
عندما تصل الأجنة إلى مرحلة 256 خلية ، قم بتحميلها بسرعة في لوحة الحقن وحقن نانولتر واحد من MO الفلوري في صفار البيض. حقن ما لا يقل عن 100 جنين بين 256 و 1000 مرحلة خلية لإجراء الحقن المستهدف بصفار البيض. بعد احتضان البويضات المخصبة إلى مرحلة القبة ، قم بحقن نانولتر واحد من MO الفلوري في نير ما لا يقل عن 100 جنين بين القبة و 30٪ هي مراحل رقائق.
عندما تصل الأجنة المحقونة إلى 75٪ من مرحلة الرقائق. قم بإزالة الأجنة غير المخصبة والميتة تحت مجهر تشريح لحقن MO العالمية. اختر الأجنة الحية للتألق موزعة بالتساوي في جميع الخلايا.
بالنسبة لحقن M mo المستهدفة DFC ، حدد الأجنة ذات التألق المنتشر في جميع أنحاء صفار البيض وتتركز في هامش الجلد الظهري. لحقن MO المستهدفة بصفار البيض. اختر الأجنة التي يتم فيها توزيع التألق بالتساوي في جميع أنحاء صفار البيض ولا يتم ملاحظتها في أي خلايا جنينية بين اثنين إلى أربعة.
لذا مراحل العث. حدد الأجنة المستهدفة DFC التي تظهر مضان فقط في خلايا KV وصفار البيض وتخلص من الباقي للحقن المستهدفة بصفار البيض. حدد الأجنة ذات التألق حصريا في صفار البيض لتحليل التدفق غير المتماثل في KV من MO تبدأ الأجنة المحقونة باستخدام ملقط حاد لطلاء حوالي 20 جنينا بعناية بين أربعة إلى ستة.
لذلك قد تنقل المراحل جنينا واحدا إلى شريحة الاكتئاب الزجاجي وتزيل أكبر قدر ممكن من الماء. قم بتثبيت الجنين عن طريق إضافة ما يكفي من الهواء الدافئ بنسبة 1٪ من نقطة الانصهار المنخفضة لتغطيته فقط عندما يتجمد الهواء. استخدم الملقط لوضعه بحيث يكون KV مواجها لأعلى 10 أجنة تعمل بسرعة لضمان اكتمال جميع الحقن بواسطة 10.
لذا مرحلة العث. بعد تخفيف حبات الفلورسنت الدقيقة بقطر 0.5 ميكرون إلى واحد إلى 50 في الماء المعقم. امزج الخرزات جيدا وقم بتحميل ثلاثة ميكرولترات في إبرة شعرية باستخدام نفس الحاقن الصغير المستخدم في حقن MO.
استخدم الملقط لكسر طرف الإبرة وضبط إعدادات الحقن لتوليد أصغر حقن ممكن. قطرة. بعد ذلك ، تحت مجهر تشريح ، قم بمحاذاة الإبرة مع تجويف KV للجنين المركب الأول. ثم أدخل الإبرة في التجويف وحقن أقل من 0.5 نانو لتر من الخرز.
أضف قطرة من الماء المعقم على الشقوق لتجنب جفاف الجنين تحت المجهر الفلوري المستقيم. باستخدام شاشة موضوعية 20 × ، يتم حقن الأجنة المحقونة للتسليم الناجح للخرز لكل جنين محدد مع حبات داخل KV عند قطرة من الماء المعقم لتغطية الحمال. ثم لاحظ استخدام مجهر مركب فلورسنت مع هدف غمس الماء 63 ×.
باستخدام كاميرا عالية السرعة مثبتة على المجهر ، قم بتسجيل فيلم من عشر ثوان. استخدم قناة الفلورسنت لتسجيل الخرزات بمعدل 70 إطارا في الثانية تقريبا وتباين المجال الساطع أو التداخل التفاضلي لتسجيل تجويف KV. قم باستيراد الأفلام إلى Image J.Create الحد الأقصى من الإسقاطات واستخدم البرنامج لتتبع حركات الخرزات الفردية.
يوضح هذا الشكل توزيع MO الفلوري في مرحلة ناجحة من الأجنة الحية المحقونة المحددة. يظهر هنا حقن MO غير ناجح يظل فيه المحلول مجمعا في خلية صفار البيض. يمكن قياس تدفق السوائل في الأجنة المحقونة بنجاح نوعيا أو كميا في جنين تحكم بحرز التدفق الطبيعي.
اتبع المسارات عكس اتجاه عقارب الساعة التي يمكن تصورها عن طريق إجراء أقصى إسقاط لمواضع حبة الفلورسنت بمرور الوقت أو عن طريق تتبع الخرزات الفردية بمرور الوقت. لإثبات فقدان التدفق المنسق ، تم حقن الأجنة ب MO لتحطيم صف كيناز اثنين B أو الصخور Two B ، مما يعطل التدفق ، ونتيجة لذلك ، تتحرك الخرزات بشكل عشوائي في kv ، يظهر متوسط سرعة خمس حبات من التحكم وصخور اثنين من أجنة B mo هنا بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا التنموية لاستكشاف الجينات والآليات في إنشاء وصول الجسم الأيمن الأيسر في أسماك الزرد.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تركز هذه الدراسة على تعديل وظيفة الجين في حويصلة كوبفر (KV) في أجنة الأسماك الزُّرقاء، وهو أمر بالغ الأهمية لنمذجة اليسار واليمين. يصف المؤلفون طريقة لتصور تدفق السوائل في KV عن طريق توصيل حبات فلورية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء التنموي
- علم الأجنة
الخلفية
- تلعب حويصلة كوبفر دورًا مهمًا في إنشاء عدم التماثل بين اليسار واليمين في أسماك الزرد.
- الأهداب في KV تولد تدفقًا للسوائل يؤثر على تطور الجنين.
- فهم وظيفة الجين في KV يمكن أن يوفر رؤى حول العمليات التنموية.
- يمكن استخدام الحبات الفلورية لتصور وتحليل ديناميكيات السوائل في KV.
غرض الدراسة
- لتعديل وظيفة الجين بشكل خاص في خلايا KV في أجنة أسماك الزرد.
- لتحليل تأثير تعديل الجين على تدفق السوائل غير المتماثل في KV.
- لتطوير تقنية لتصور تدفق السوائل باستخدام الحبات الفلورية.
الطرق المستخدمة
- حقن الأوليغونوكليويدات المورفولينية الفلورية في خلايا الصفار في أجنة مرحلة البلاسطولية المتوسطة.
- اختيار الأجنة ذات المورفولينية الفلورية في KV لمزيد من التحليل.
- حقن الحبات الفلورية في تجويف KV.
- التصوير المجهري بالفيديو لتسجيل حركة الحبات وتحليل تدفق السوائل.
النتائج الرئيسية
- تعديل ناجح للتعبير الجيني في خلايا KV.
- تصور تدفق السوائل في KV باستخدام الحبات الفلورية.
- تحليل كمي لحركات الحبات لتقييم تأثير وظيفة الجين على ديناميكيات السوائل.
- تشير النتائج إلى أن استنزاف الجين المحدد يغير تدفق السوائل غير المتماثل في KV.
الاستنتاجات
- تسمح التقنية المطورة بتعديل الجين المستهدف في خلايا KV.
- حقن الحبات الفلورية فعال لدراسة ديناميكيات السوائل في أجنة أسماك الزرد.
- تساهم النتائج في فهم دور KV في نمذجة اليسار واليمين.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding left-right asymmetry establishment in vertebrate embryos provides mechanistic insights into developmental signaling pathways relevant to congenital disorder modeling. The zebrafish Kupffer's vesicle model enables high-resolution visualization of cilia-driven fluid flow, supporting target validation in early developmental biology. This approach aids in de-risking hypotheses about genes regulating asymmetric signaling cascades before mammalian translation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in dorsal forerunner cells to assess impact on cilia-mediated left-right patterning.
- Operational Value: Uses stage-specific morpholino knockdown to create chimeric embryos for lineage-restricted functional analysis.
- Predictive Value: Links gene depletion to alterations in asymmetric fluid flow, providing functional readouts for target validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Fluorescent bead injection into Kupffer's vesicle lumen allows direct visualization and quantification of motility-driven flow.
- Operational Value: Enables high-speed video capture and bead tracking for objective measurement of flow dynamics.
- Assay Readiness: Generates quantitative displacement data that can be correlated with genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved Nodal signaling pathway initiation, relevant to laterality defect studies.
- Translational Continuity: Connects cilia function in zebrafish KV to asymmetric signaling in lateral plate mesoderm.
- Mechanistic De-risking: Supports evaluation of whether candidate genes affect flow symmetry before mammalian model testing.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by linking genetic modulation to functional phenotypic readouts in a living embryo system.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about gene roles in cilia organization and motility through targeted knockdown in dorsal forerunner cells.
- Screening: Delivers fluorescent beads to quantify flow as a functional output of cilia activity.
- Analytics: Uses bead tracking to generate velocity and trajectory data for flow asymmetry assessment.
- Translational Research: Connects KV flow to downstream Nodal signaling, supporting relevance to symmetry-breaking mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for gene-function-to-phenotype mapping in vertebrate left-right patterning.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into how genes regulate cilia-dependent fluid flow and symmetry initiation.
- Operational Value: Combines lineage-specific gene knockdown with live imaging for correlated genetic and phenotypic analysis.
- Strategic Value: Enables early-stage go/no-go decisions based on functional disruption of conserved patterning mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports prioritization of targets based on their role in establishing asymmetric signaling cascades.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microinjection, and fluorescence microscopy.
- Dependent on precise timing of injection relative to developmental stages (dome to 30% epiboly for DFC targeting).
- Needs fluorescent bead preparation and high-speed video capture capability for flow quantification.
- Requires optimization of bead concentration and injection volume to avoid lumen obstruction or embryo damage.
- Limited to non-mammalian systems; findings require validation in higher vertebrate models for translational relevance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Stage-specific Injection of Morpholinos (MO)
3:10
Selecting Injected Embryos for Analysis
4:16
Mounting Embryos and Injection of Fluorescent Beads to Analyze Fluid Flow in Kupffer's Vesicle
5:56
Visualization and Analysis of KV Fluid Flow
6:38
Representative Kupffer's Vesicle Fluid Flow Results
7:45
Conclusion
