المكورات العنقودية الذهبية النمو باستخدام الهيموجلوبين الإنسان باعتبارها المصدر الحديد

تختبر هذه التجربة قدرة المكورات العنقودية الذهبية على استخدام الهيموجلوبين البشري كمصدر وحيد للحديد. أولا ، عزل خلايا الدم الحمراء من دم الإنسان الطازج. تنقية الهيموجلوبين عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء لضمان سلامة الهيموجلوبين.

أضف الآن الهيموجلوبين إلى وسط مستنفد للحديد لتزويد الحديد على شكل ثقافة الهيموجلوبين التالية. S ريوس. في وجود الهيموجلوبين وقياس قدرته على استخدام الهيموجلوبين كمصدر للحديد.

تظهر النتائج أنه مع تكاثر الريوس في وجود الهيموجلوبين كمصدر وحيد للحديد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة ، مثل ما إذا كان بإمكان العامل الممرض استخدام البروتينات المضيفة كمصادر للحديد ، وما هي الآليات المطلوبة لاستخدام الحديد باستخدام هذه العملية. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على اكتساب المكورات العنقودية من الهيموجلوبين.

يمكن أيضا تطبيقه على دراسات البكتيريا الأخرى وكيفية استخدامها للبروتينات المحتوية على الحديد من المضيف. ستظهر هذه التقنية GLA Ani وكاثرين هالي من مختبري. أولا ، احصل على دم بشري معزول حديثا ، مكملا بمضاد للتخثر وحافظ على أربع درجات مئوية طوال فترة التنقية بيليه خلايا الدم الحمراء عن طريق الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة عند 15 ، 000 Gs.شفط بعناية snat وأعد تعليق الحبيبات برفق في محلول كلوريد الصوديوم المثلج ، 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم بعد ثلاث غسلات ، resus ، تعليق الحبيبات في حجم واحد من الثلج البارد 10 ملليمولار تريس ، حمض الهيدروكلوريك لكرات الدم الحمراء عن طريق الضغط الاسموزي.

ثم أضف التولوين إلى 20٪ من الحجم النهائي واحتضانه عند أربع درجات مئوية على دوار طوال الليل. جهاز الطرد المركزي التالي. المحللة في 20 ، 000 جي في ساعة واحدة.

اجمع جزء الانحلال الأوسط ، مع ترك طبقة التولوين العليا والحبيبات دون إزعاج. مرر الانحلال من خلال مرشح حقنة 0.44 ميكرومتر. إذا كان المحلول يحتوي على جسيمات ولا يمكن تمريره عبر المرشح ، كرر الطرد المركزي عالي السرعة.

الآن قم بتنقية الهيموجلوبين باستخدام عمود تبادل الأنيون الكروماتوغرافيا السائلة عالي الأداء. استخدم المرحلة المتنقلة A من 10 مللي مولار تريس ، HCL ، والمرحلة المتنقلة B من 10 مللي مولار تريس ، HCL بالإضافة إلى 0.5 كلوريد الصوديوم المولاري. قم بتشغيل تدرج 0٪ إلى 100٪ من المذيب B على مدار دقيقتين بمعدل تدفق ملليلتر في الدقيقة.

مراقبة الشطف على أساس الامتصاص عند 410 نانومتر و 280 نانومتر. اجمع الكسر الذي يتميز باللون الأحمر الفاتح وذروة امتصاص بارزة. غسيل الكلى ضد محلول ملحي مخزن بالفوسفات لمدة 16 ساعة تقريبا.

لتعقيم العينة ، قم بتمريرها عبر مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر لتحديد تركيز الهيموجلوبين. قم بإعداد حلول HP القياسية في PBS. الآن امزج المحاليل القياسية أو محاليل العينة مع كاشف xra kins بنسبة واحد إلى واحد في 96 لوحة بئر بعد 15 دقيقة قياس الامتصاص عند 540 نانومتر.

ارسم منحنى قياسي وحدد تركيز HP للعينات من خمسة إلى 15 ملليغرام لكل ملليلتر. الغلة عبارة عن حصة تشغيل نموذجية من 15 إلى 20 ميكروغراما من عينة الهيموجلوبين المنقى على اثنين من المواد الهلامية لصفحة STS بنسبة 15٪. قم بتلطيخ أحد المواد الهلامية ونقل البروتينات من هلام آخر إلى غشاء النيتروسليلوز إلى لطخة مناعية لتجميد الهيموجلوبين وتخزين مليلتر واحد من الهيموجلوبين المعزول في النيتروجين السائل من خط مخزون مجمد S aureus على ثلاثية الصبغة ، أجار الصويا ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 24 ساعة.

تلقيح المستعمرات المفردة في خمسة ملليلتر من RPMI التي تحتوي على E-D-D-H-A والثقافة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 180 RP M بين عشية وضحاها. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 7 ، 500 Gs.ثم Resus ، قم بتعليق البكتيريا في RPMI التي تحتوي على 0.5 مللي مولار E-D-D-H-A ، وتطبيع إلى OD 600 من حوالي ثلاثة. بعد ذلك ، قم بإعداد N-R-P-M-I يحتوي على 2.5 ميكروغرام لكل مليلتر ، HB و 0.1 إلى ملليمولار واحد E-D-D-H-A لاستخلاص الحديد الحر.

الآن ، قم بزراعة 10 ميكرولتر من المعلق البكتيري في مليلتر واحد من N-R-P-M-I بالإضافة إلى E-D-D-H-A بالإضافة إلى HP ، وتحتضن الثقافات عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة مع الاهتزاز عند 180 RRP M كل ست إلى 12 ساعة. قم بإزالة 50 ميكرولترا من مزيج الثقافة مع 150 ميكرولتر من PBS في 96 لوحا جيدا وخذ قراءات OD 600. في تنقية HPLC للهيموجلوبين البشري من محلل الهيموليزات ، يتم قياس امتصاص الشطف عند أطوال موجية 280 و 410 نانومتر بجزء خمسة يحتوي على الهيموجلوبين.

عادة ، يتم الحصول على غلة من خمسة إلى 15 ملليغرام من الهيموجلوبين لكل مليلتر لكل مستحضر. تم تحليل الهيموجلوبين المنقى بواسطة صفحة SDS في نسختين ، وكانت المواد الهلامية إما تعني البروتينات أو تم نقلها إلى النيتروسليلوز ومناعية. بعد ذلك ، تم اختبار الهيموجلوبين البشري المنقى للتأكد من قدرته على دعم نمو النوع البري من ASUS و ASUS الذي يفتقر إلى مستقبلات الهيموجلوبين المطلوبة للحصول على الحديد المشتق من الهيموجلوبين.

تشير الزيادة في الكثافة الضوئية للثقافات بمرور الوقت إلى أنه في N-R-P-M-I بالإضافة إلى E-D-D-H-A plus hb ، ينتشر النوع البري ASUS ، لكن الطافرة لا تتكاثر. في المقابل ، فإن القدرة على استخدام الحديد الحر المكملات متطابقة في كل من النوع البري والسلالات الطافرة ، ولا يتكاثر أي منهما في حالة عدم وجود مصدر. في هذه المقارنة بين الوسائط المكملة بالهيموجلوبين المنقى من الدم الطازج أو الهيموجلوبين المجفف بالتجميد ، يتطلب الهيموجلوبين المنقى من الدم ISDB للنمو.

بينما يتيح الهيموجلوبين المجفف بالتجميد تكاثر متحولة ISDB بمجرد إتقانه ، يمكن إكمال تنقية الهيموجلوبين بشكل صحيح في غضون ساعات قليلة. تذكر أن المتبرعين هم حاملون محتملون لمسببات الأمراض المنقولة بالدم ، لذا تعامل مع دم الإنسان كمادة خطرة بيولوجيا.