الجمع بين المناعي وFISH DNA على الحفاظ على النواة 3D-الطور البيني لدراسة التغيرات في منظمة النووية 3D

الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف تعديلات الكروماتين وتسلسلات الحمض النووي في وقت واحد باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ثلاثي الأبعاد ، يتم أولا إنشاء مجسات الحمض النووي المحددة. وفي الوقت نفسه ، يتم إصلاح الخلايا التجريبية وملطخة بالمناعة. لعلامات هيستون ذات الأهمية.

ثم يتم تغيير طبيعة الخلايا وتضان بين عشية وضحاها بداخلك. يتم إجراء التهجين أو الأسماك باستخدام واحد أو أكثر من مجسات الحمض النووي. أخيرا ، يتم غسل الخلايا وتركيبها من أجل التألق ثلاثي الأبعاد.

يكشف التحليل المجهري للصور الناتجة عن التوطين النووي للمواقع ذات الأهمية والارتباط بتعديلاته الحجرية المحددة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تجمع بين تصور البروتين النووي ، بما في ذلك الأحجار مع المواقع الجينومية في نوى الحفاظ ثلاثية الأبعاد ، ويمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التنظيم النووي اللاجيني للكروماتين أو تنظيم الجينات. في هذا الإجراء ، يمكن استخدام البلازميدات الخلفية أو منتجات PCR لوضع العلامات.

وينبغي إعداد هذه الملاحظات على النحو المبين في النص المصاحب. لاحظ أنه بالنسبة لإشارة سمكة قوية ، يجب أن تنفق المجسات ما لا يقل عن 10 زوج كيلو قاعدة. ابدأ هذا الإجراء بدمج ميكروغرام واحد من الحمض النووي و 0.17 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي A في أنبوب طرد مركزي صغير.

احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بتعطيل الحمض النووي الريبي A لفترة وجيزة على الجليد وأضف الكمية المناسبة من ترجمة. امزج واحتضن لمدة ساعتين عند 16 درجة مئوية في حمام مائي مبرد أو كتلة باردة لتعطيل التفاعل.

ضع الأنابيب عند سالب 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة أو سالب 20 درجة مئوية طوال الليل. بعد ذلك ، حدد حجم المسبار على جل 2٪ agros. يجب أن تكون اللطاخة بين 101 ، 000 زوج أساسي مع الأغلبية في حوالي 300 إلى 500 زوج أساسي.

لاحظ أن مسحة مجسات الخيال العلمي غير مرئية. بمجرد تحديد الحجم ، قم بتنقية المجسات عن طريق غسيل الكلى على 0.02. مرشحات خمسة ملليمترات في أكواب لترين مملوءة بالماء.

الماصة برفق 200 ميكروغرام من المسبار في وسط كل مرشح عائم، ثم احتضنه لمدة ساعتين في الظلام. بعد الحضانة ، استخدم ماصة لنقل المسبار برفق من المرشحات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. بعد ذلك ، أضف عوامل الحظر إلى المجسات على النحو التالي.

ميكروغرام واحد من CO 1D NA. ميكروغرام واحد من الحمض النووي عالي الكتلة و 10 ميكروغرام من المنوية السلمون لميكروغرام واحد من مسبار الحمض النووي ومزيج تخزين مجسات الحمض النووي عند سالب 20 درجة مئوية. في يوم إجراء الأسماك ، يتم ترسيب المجسات وإعدادها للاستخدام. لاحظ أنه يجب تنفيذ الخطوات الموضحة في هذا القسم من الفيديو بالتوازي مع الخطوات الواردة في القسم التالي.

لترسيب المجسات ، اتبعها واجمعها مع حجم 0.1 من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية عند درجة الحموضة 5.2 و 2.5 حجم من 100٪ احتضان الإيثانول لمدة ساعة واحدة عند سالب 80 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بتدوير المجسات عند 16،000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الدوران ، تخلص من المادة الطافية وجفف الكريات بالهواء في الظلام.

اعتمادا على كمية ولون المجسات ، قد تكون الحبيبات مرئية وقد لا تكون مرئية. قم Resus بتعليق الحبيبات في 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتهجين لكل حالة اختبار ورجها باستخدام خلاط حراري einor في الظلام عند 37 إلى 45 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا. بجانب تغيير طبيعة المجسات ، تحتضنها لمدة خمس دقائق عند 75 إلى 95 درجة مئوية.

ثم للمجسات المسبقة ، قم باحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة على الخلاط الحراري. مباشرة بعد الحضانة ، سيتم تطبيق المجسات على الخلايا الموجودة على زلات الغطاء كما هو موضح في القسم التالي من الفيديو. لاحظ أنه بالنسبة للخطوات التالية ، يجب تعديل أوقات الحضانة حسب الضرورة للأجسام المضادة والخلايا المستخدمة.

يجب تنفيذ الخطوات الموضحة في هذا القسم من الفيديو بالتوازي مع الخطوات الواردة في القسم السابق كما هو موضح في النص المصاحب. قم بإسقاط الخلايا غير الملتصقة على زلات الغطاء المطلي ببولي ليسين في آبار من ستة ألواح بئر واتركها تعلق لمدة خمس دقائق. ثم أضف برفق ملليلترين من 2٪ ألدهيد بارافورم في PBS ، واحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة.

اشطف كل بئر باستخدام PB S3 مرات ثم لاختراق الخلايا ، أضف ملليلترين من الثلج البارد ، 0.4٪ تريتون × 100 في PBS واحتضنه لمدة خمس دقائق على الثلج. بعد شفط المحلول النفاذ، إذا تم دمج أسماك الحمض النووي مع التألق المناعي، فتابع على النحو التالي. أول ماصة 100 ميكرولتر من محلول المنع على البارم في غرفة مرطبة.

ضع جانب خلية انزلاق الغطاء لأسفل على محلول الحظر واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، نقل. ينزلق الغطاء إلى 100 ميكرولتر قطرة من الجسم المضاد الأساسي المخفف في محلول الحظر.

هنا يتعرف الجسم المضاد المستخدم على السوري الفسفري 1 39 من H اثنين A x أو جاما H اثنين A x. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، استخدم الملقط لإزالة زلات الغطاء بعناية.

إذا كان من الصعب التقاط زلات الغطاء ، فقم بغمر PBS وحاول مرة أخرى. انقل كل شريحة إلى بئر من ستة. لوحة البئر تحتوي على ملليلترين من 0.2٪ BSA 0.1٪ tween 20 في PBS تغسل الغطاء ينزلق في هذا المحلول ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز ، ثم احتضان الخلايا بالجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلوروفور المناسب المخفف في محلول مانع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة ورطبة على البارام.

كما كان من قبل بعد الحضانة ، اشطف الخلايا في 0.1٪ من 20 في PB S3 مرات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام لتثبيت الخلايا ، وغمرها في ملليلترين من 2٪ بارا فورمالديهايد في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بمجرد تلطيخ الخلايا أو إذا لم تكن ملطخة ، استمر في أسماك الحمض النووي عن طريق شطف زلات الغطاء ثلاث مرات في PBS. ثم ضع جانب الخلية المنزلق للغطاء لأسفل على قطرة 100 ميكرولتر بمقدار 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر.

الحمض النووي الريبي على البارام في غرفة رطبة وتحتضن لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، اشطف زلات الغطاء ثلاث مرات في PBS ثم قم بخزخ الخلايا في الجليد البارد 0.7٪ Trix 100 في حمض الهيدروكلوريك المولي 0.1 لمدة 10 دقائق على الجليد في الظلام. بعد ثلاث عمليات شطف في PBS ، قم بتغيير طبيعة الخلايا الموجودة في حمض الهيدروكلوريك المولي 1.9 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام وغسلها ثلاث مرات أخرى في PBS المثلج البارد بجوار تهجين الخلايا باستخدام المجسات.

ضع جانب الخلية المنزلقة للغطاء لأسفل على قطرة 15 ميكرولترا من المسبار المعدة في القسم السابق من هذا الفيديو على شريحة مجهرية ، وأغلق الشريحة بالأسمنت المطاطي واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة مظلمة. في اليوم التالي ، استخدم الملقط لإزالة الأسمنت المطاطي بعناية من الشرائح. ثم قم بإنفلونزا زلات الغطاء باستخدام اثنين من Acts SSC واستخدم الملقط لإزالة زلات الغطاء بعناية مع الخلايا.

ثم ضعها في آبار تحتوي على محلول غسيل. بعد ذلك ، قم بإجراء الغسلات التالية مع الرج في الظلام ، اثنان من XSSC لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، واثنان من XSSC لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و XSSC واحد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتركيب الشرائح ، ضع جانب الخلية المنزلقة للغطاء لأسفل على قطرة من 10 إلى 15 ميكرولتر من وسط تركيب الذهب المطول الذي يحتوي على 1.5 ملليغرام لكل مليلتر ختم DPI مع طلاء الأظافر. يمكن تخزين الشرائح لأشهر عند سالب 20 درجة مئوية.

بمجرد أن تصبح الشرائح جاهزة ، اجمع صورا ثلاثية الأبعاد مع أقسام بصرية مفصولة ب 0.3 ميكرون وقم بتحليلها كما هو موضح في المستند المصاحب لتحديد ما إذا كانت التغييرات في ارتباط الأليلين لمواقع مستقبلات المستضد مرتبطة بتنظيم عملية إعادة تركيب VDJ أثناء تطور الخلايا الليمفاوية ، والنوع البري والخلايا الطافرة التي تعاني من نقص في قطعة قماش البروتين المؤتلف لفحص موضع الاهتمام باستخدام الحمض النووي مسبار الأسماك الناتج عن ظهر يمتد على حوالي 200 زوج كيلو قاعدة يشمل المنطقة الجينومية. تم قياس المسافات بين الأليلات بين مركز كتلة كل إشارة خلفية في مداخن الصور ثلاثية الأبعاد ، والدوائر المتقطعة ، وتحديد أشكال النواة. أشرطة المقياس الموضحة عبارة عن منحنيات توزيع التردد التراكمي ميكرون واحد ثم تم إنشاؤها لإظهار النطاق الكامل للمسافات بين الأليلين المقاسين في النوع البري والخلايا الطافرة.

ثم استخدم اختبار KS غير المعلمي المكون من عينتين لتقييم دلالة الفروق بين التوزيعين. تم تقييم نطاق أقوى الاختلافات في المسافات بين الأليليات باستخدام سلسلة من اختبارين دقيقين لصياد الذيل المشار إليهما بالنقاط الزرقاء. تم العثور على أقوى قيم P المشار إليها بالنقاط الأعلى للمسافات حول ميكرون واحد.

وهكذا ، تم تحديد القطع للارتباط الوثيق أو الاقتران بين الأليلين عند ميكرون واحد. تشير منحنيات التردد التراكمي الموضحة هنا إلى نطاق المسافات للارتباط الوثيق بين الأليلين من صفر إلى 1.5 ميكرون في الحالتين البيولوجيتين المختلفتين. تم تقييم أهمية الاقتران بين الأليلين باستخدام الاختبار الدقيق لصياد الذيل لقطع عند ميكرون واحد.

يوضح هذا الرسم البياني أنه في الحالة الطافرة ، لا يرتبط الأليلان بالتردد العالي كما هو الحال في النوع البري. وبالتالي ، فإن قطعة قماش البروتين المفقودة تشارك في الاقتران الداخلي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الجمع بين التألق المناعي وأسماك الحمض النووي.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين من خلال إعطاء نظرة ثاقبة للتغيرات العالمية في الهندسة النووية ، وسلوك مواقع ومناطق جينومية معينة داخل الفضاء النووي وارتباط بروتينات نووية معينة داخل هذه المناطق. ويساعد على فهم الآليات الكامنة وراء الأمراض المختلفة بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل تقنيات إنتاجية الجليد العريض للجينوم مثل الكروماتين أو الترسيب المناعي أو الرقائق أو تأكيد التقاط الكروموسوم إلى جانب التسلسل العميق مثل الخمسة C أو IC ، لتوفير بيانات عالمية عن مجموعات الخلايا.