Cryosectioning المجتمعات الخميرة لفحص أنماط الإسفار

الهدف العام من التجربة التالية هو إنتاج مقاطع عرضية من مجتمعات الخميرة لفحص التوزيع المكاني لمجموعات الخلايا الفلورية المختلفة داخل المجتمع. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجميد المجتمع أولا ثم إصلاحه باستخدام الميثانول للحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا في المجتمع. كخطوة ثانية ، يتم تبخير الميثانول للسماح باختراق مركب OCT المضمن.

ثم يتم تجميد المجتمع المضمن استعدادا للاستئصال بالتبريد. بعد ذلك ، بعض أقسام التبريد. يمكن تصوير المجتمع والمقاطع العرضية تحت المجهر الفلوري يتم الحصول على النتائج التي تظهر التوزيع المكاني لمجموعات الخلايا الفلورية داخل المجتمع.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل التقسيم البصري ، هي أنها تكشف عن التوزيع المكاني للسكان في أعماق هذه المجتمعات. لبدء هذا الإجراء ، قم بزراعة مجتمعات الخميرة على مرشح غشاء. يتوافق هذا البروتوكول مع مجتمع نموذجي أقل من اثنين في 10 إلى الخلايا الثماني على مرشح غشائي قطره ستة ملليمترات بعد ذلك في فريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر.

للحفاظ على درجة أكبر من التألق ، استخدم قطعة من ورق الترشيح watman 5 4 1 لتغطية الجزء السفلي من قطر سنتيمتر واحد. حسنا ، يتم استخدام ورق الترشيح هذا كناقل لنقل المجتمع في مراحل لاحقة ، أضف ملليلترا واحدا من 20 درجة مئوية تحت الصفر ، و 100٪ ميثانول إلى البئر ، واترك البئر عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تتوازن درجة الحرارة. الآن ، قم بتجميد مجتمع الخميرة باستخدام ملاقط لغمس مرشح الغشاء مع المجتمع في النيتروجين السائل لمدة 15 ثانية على الأقل.

بعد ذلك ، انقل المجتمع المجمد إلى البئر بدرجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. يضمن الميثانول الموجود في الفريزر الحفاظ على المجتمع أفقيا. عند غمره في الميثانول ، انتظر لمدة 20 دقيقة ، سيبدأ مرشح الغشاء في التفكك في الميثانول.

بعد 20 دقيقة ، انقل المجتمع باستخدام ورق ترشيح واتمان الناقل من بئر الميثانول إلى طبق بتري بارد يحفظ عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. عند النقل، احتفظ بالمجتمع على رأس مرشح Watman الخاص بشركة الاتصالات. اسحب قطرات إضافية من الميثانول باستخدام قطعة أخرى من ورق واتمان السميك قبل وضعها في طبق بتري البارد.

سيضمن ذلك أن وقت تبخر الميثانول متسق من عينة إلى أخرى. انتظر من أربع إلى ست ساعات حتى يتبخر الميثانول. يعد إنهاء التبخر في الوقت المناسب أمرا بالغ الأهمية لنجاح هذا الإجراء.

لتجنب الإفراط في تجفيف العينة ، تحقق من حالة مجتمع الخميرة بشكل دوري أثناء التبخر ، بينما يتبخر الميثانول. اصنع حاوية مستطيلة من رقائق الألومنيوم المكعبة كبيرة بما يكفي بحيث تحتوي العينة على هوامش لا تقل عن ملليمترين من كل جانب. أضف قطرة من OCT إلى قاع هذه الحاوية للتأكد من أن العينة محاطة ب OCT من جميع الجوانب.

عند اكتمال التبخر ، أخرج العينة من الفريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر. قم بقص أجزاء ورق الترشيح التي لا يغطيها مجتمع الخميرة. من المهم تنفيذ هذه الخطوة بسرعة.

لتجنب الإفراط في تجفيف العينة. ضع المجتمع على السطح السفلي لحاوية رقائق الألومنيوم وقم بتغطية العينة على الفور باستخدام OCT حتى ثلاثة إلى أربعة ملليمترات فوق ارتفاع المجتمع. انتظر 10 دقائق.

أخيرا ، ضع عينة OCT المضمنة على صفيحة معدنية على ثلج جاف لتجميد تخزين المجتمعات المجمدة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر أو 80 درجة مئوية تحت الصفر. استعدادا لتقسيم المجتمعات المجمدة ، اضبط درجة حرارة غرفة قسم التبريد على 25 درجة مئوية تحت الصفر. اترك العينات في الغرفة حتى تصل درجة حرارتها إلى درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بإزالة الرقاقة من العينة وقطع OCT الزائد. ضع قطرة من OCT على حامل التبريد وقم بتركيب العينة على حامل التبريد. انشر OCT بشكل موحد على جانب العينة باستخدام ورق ترشيح watman المكشوف بحيث يكون سمك OCT من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات.

يساعد ضمان هامش OCT من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات على جميع جوانب العينة في الحفاظ على سلامة الأقسام. دع OCT يتجمد داخل غرفة ناظم التبريد قبل التقسيم. استخدم جوانب كتلة عينة OCT لمحاذاة العينة فيما يتعلق بالشفرة.

إذا لم تتم محاذاة العينة فيما يتعلق بالشفرة ، فسيبدأ التقسيم من زاوية أو جانب العينة. اضبط الحامل للتأكد من أن الشفرة تقطع وجها رأسيا تماما لكتلة العينة. يبلغ سمك الأقسام النموذجية لمجتمعات الخميرة حوالي 14 ميكرومتر.

بعد قطع القسم ، استخدم شريحة مجهر محفوظة في درجة حرارة الغرفة لجمع القسم. عن طريق تحريك الشريحة ببطء إلى قسم القطع ، سوف يذوب القسم وينتقل إلى المجهر. يمكن نقل ما يصل إلى 18 قسما إلى شريحة واحدة.

قم بتخزين الشرائح في درجات حرارة باردة ، ويفضل أن تكون تحت الصفر 20 درجة مئوية قبل التصوير. يكون فقدان الإشارة ضئيلا عند الاحتفاظ به لمدة أسبوع عند أربع درجات مئوية للحصول على أقصى إشارة فلورية. يجب أن يتم التصوير مباشرة بعد التقسيم.

هنا صور التألق التمثيلية للمقاطع العرضية الرأسية لمجتمعات الخميرة المزروعة في ظل ظروف متطابقة. يتكون المجتمع من سلالتين ضوئيتين من الرؤية الموسومة ببروتينات الفلورسنت. تم تصور M cherry باللون الأحمر و Y-E-G-F-P على أنه منافسة خضراء على الموارد المشتركة ، بما في ذلك المساحة التي تؤدي إلى أنماط عمودية كما هو موضح في المقاطع العرضية الرأسية.

يمكن حل الدقة وصولا إلى خلية واحدة في المقاطع العرضية. يقارن هذا الشكل المقاطع العرضية التي تم الحصول عليها بتثبيت الميثانول الموضح في اللوحة السفلية وبدون تثبيت الميثانول الموضح في اللوحة العلوية. يتم الحفاظ على إشارة الفلورسنت في أقسام المجتمع دون إصلاح ، ولكن سلامة المجتمع تتعرض للخطر.

نتيجة لذلك ، تطفو بعض الخلايا بعيدا حول حافة القسم ويكون العائد الإجمالي أقل مقارنة بالمجتمعات الثابتة. يحافظ تثبيت الميثانول على تماسك خلايا المجتمع ، ولكنه يسبب انكماشا كما لوحظ في انخفاض ارتفاع المجتمع. يوضح هذا الشكل المقاطع العرضية الرأسية التمثيلية للحقل الساطع والفلورة لمجتمع الخميرة الذي يتكون من سلالتين من البروتوبيت من الرؤية المربوطة ببروتينات الفلورسنت DS RED و YFP.

تشكل الخلايا الموجودة أعلى المجتمع تاجا يبدو مختلفا عن الخلايا الأم ، ويتميز بتشتت أقوى في المجال الساطع ومضان أكثر إشراقا. تتوافق هذه الأنماط مع أنماط التمايز المبلغ عنها في مستعمرات الخميرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام التشريح بالتبريد لفحص الأنماط المكانية للتألق داخل مجتمعات الخميرة.