العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء المتصورة berghei ANKA الفئران المصابة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الكريات البيض الالتهابية الملتصقة من الأوعية الدموية في الدماغ للفئران المصابة بالمتصورة للإصابة بالمتصورة للإصابة بالملاريا الدماغية التجريبية. تصاب الفئران بالمتصورة بيرج العين anca خلايا الدم الحمراء المتطفلة عن طريق الحقن. بعد أن تبدأ الفئران في إظهار علامات المرض ، تتم إزالة الخلايا المنتشرة للفئران المصابة بالملاريا عن طريق التروية داخل الفم.

ثم يتم حصاد الأدمغة وهضم الأنسجة بالإنزيمات للسماح بعزل الكريات البيض الالتهابية. ثم يتم إجراء قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان للنمط الظاهري المناعي. يكشف تحليل الكريات البيض المعزولة في الدماغ للبيانات الناتجة عن النسبة المئوية والأعداد المطلقة للكريات البيض المهاجرة إلى دماغ الفئران المصابة بالملاريا.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التسبب في الملاريا ، مثل نوع الخلايا الالتهابية التي تهاجر إلى موقع عزل الطفيليات في دماغ المصابة في ظل ظروف تجريبية مختلفة. العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية. يصعب تعلم خطوات التروية لأنها تتطلب السرعة والعناية بعدم إتلاف أي أوعية دموية مهمة ، وسيتم توضيح بعض أجزاء هذا الإجراء ليانا ميسيك ، وهي فنية ، والسيدة فيكتوريا ، وريك ، طالبة دكتوراه ، والدكتورة ليزا آيز ، باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري.

ابدأ هذا البروتوكول عن طريق إصابة الفئران ب p berge eye anca defrost aliopreserved of P berge eye anca تتطفل خلايا الدم الحمراء أو pbcs عن طريق السماح لها بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة فأر متبرع عمره من ثمانية إلى 12 أسبوعا من قفصه وضعه على محطة عمل. أمسك قفظاظ الرقبة بين السبابة والإبهام.

اقلب الماوس وحقن 100 إلى 200 ميكرولتر من عين المتصورة في التجويف البريتوني. بشكل روتيني يتم حقن اثنين من الفئران المانحة ب pbcs. بعد الحقن ، ضع الفئران في قفصها بعد أربعة إلى خمسة أيام من الإصابة.

قم بإزالة الفأر المتبرع من قفصه وضعه على محطة عمل. ضع قطرة دم من وريد ذيل الفأر بالقرب من نهاية شريحة المجهر النهائي. ضع شريحة ثانية بزاوية 45 درجة وأعدها إلى قطرة الدم.

بمجرد أن ينتشر الدم على طول الحافة ، ادفع الموزعة بالتساوي عبر شريحة المجهر لجعل مسحة الدم. اترك اللطاخة تجف في الهواء لإصلاح مسحات الدم. اغمر الشرائح في 100٪ ميثانول لمدة 30 ثانية.

ثم قم بتلطيخ الشرائح في GIM ZA المحضر حديثا لمدة 10 دقائق بعد تلطيخه ب gim za ، اشطف الشريحة بالماء الجاري لمدة 30 ثانية. اترك الشريحة تجف في الهواء ، ثم افحصها تحت المجهر باستخدام عدسة غمر الزيت 100 ×. تعداد كرات الدم الكريهة الكريات الحمراء ضمن ألف كريات الدم الحمراء وحساب النسبة المئوية إذا وصل الفأر المتبرع إلى المستويات المطلوبة من 2.5 إلى 5٪ بارسيت جمع الدم من الفأر المتبرع عن طريق ثقب القلب تحت التخدير أو النزيف خلف الحجاج باستخدام أنبوب شعري هيماتوكريت دقيق هبارين.

قم بإذابة الدم في وسط RPMI بتركيز نهائي واحد في 10 إلى ستة PRBC لكل 0.2 ملليلتر لكل فأر. ضع في اعتبارك أن الهيماتوكريت الطبيعي للفأر هو حوالي ستة أضعاف 10 إلى تسعة خلايا الدم الحمراء لكل مليلتر. في الواقع ، من ثمانية إلى 12 أسبوعا ، تم اختبار C 57 ستة فئران سوداء عن طريق حقن مرة واحدة في 10 إلى سادس PRBC في 0.2 مل داخل الصفاق كما كان من قبل.

لمراقبة المستويات شبه المستويات للفئران المصابة ، قم بإعداد مسحة دم كما كان من قبل. يجب تحديد الفقرة كل يومين إلى ثلاثة أيام بدءا من اليوم الثاني أو الثالث بعد الإصابة من اليوم الخامس. بعد العدوى فصاعدا.

تتم مراقبة الفئران يوميا بحثا عن علامات الملاريا الشديدة بمجرد أن تزيد مستويات para عن 5٪ وتظهر على الفئران أعراضا عصبية في حوالي اليوم السادس بعد الإصابة. يتم قتل الفئران المصابة بالقتل الرحيم عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون ويتم إغراقها على الفور ب PBS كما هو موضح في المستند المصاحب. أصعب جانب في هذا الإجراء هو التروية داخل القلب.

يتم توضيح سلسلة من نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها هنا مع تثبيت الماوس على لوحة تشريح الستايروفوم. داخل درج التشريح. امسح الجانب البطني بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم استخدم مقصا كبيرا وملقطا لفتح الجلد على طول خط الوسط لكشف التجويف الصدري ، وطي الجلد ودبوسه على الجانبين.

امسك القص بالملقط الناعم وقطع الحجاب الحاجز وعلى جانبي القص ، وقطع الأضلاع. احرص على عدم إتلاف أي أوعية دموية كبيرة. قم بتثبيت القفص الصدري من القص بشكل فضفاض بجوار الرأس.

امسك البطينين بالملقط الدقيق وقم بشق الأذين الأيمن بعناية بمقص ناعم. أدخل إبرة قياس 23 متصلة بنظام نضح الجاذبية في البطين الأيسر باتجاه الشريان الأورطي الصاعد. أثناء تشغيل PBS ، أدخل 0.5 سم فقط من طرف الإبرة لاختراق الماوس لمدة خمس دقائق أو حتى تصبح النفايات السائلة صافية.

بعد التروية الداخلية، قم بتشريح الدماغ ووضعه في أنبوب طرد مركزي سعة 10 ملليلتر يحتوي على RPMI. متوسط. ضع الدماغ الذي تم حصاده حديثا فوق مصفاة خلايا من الفولاذ المقاوم للصدأ بحجم 40 إلى 60 في طبق بتري يحتوي على ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من وسط زراعة أنسجة RPMI. قطع أنسجة المخ إلى قطع صغيرة.

ثم باستخدام مكبس بلوري ، ادفع قطعا صغيرة من أنسجة المخ عبر مصفاة الخلية. انقل الدماغ المتجانس إلى أنبوب سعة 10 مليلتر وقم بطرده عند 250 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، تخلص من المادة الطافية وقم بإذابة الحبيبات في ثلاثة ملليلتر من RPMI.

وسط يحتوي على الكولاجيناز D وبجعة الحمض النووي. قم بتدوير الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة أي بقايا خلية عن طريق دفع الخليط عبر مصفاة خلايا نايلون 70 ميكرون.

ثم احتضن على الجليد لمدة خمس دقائق بعد الحضانة في أنبوب سعة 10 ملليلتر. قم بتراكب الدماغ بعناية على جهاز طرد مركزي بنسبة سبعة ملليلتر 30٪ لكل وسادة مكالمة عند 400 مرة G لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الانقطاع. بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق الحبيبات في مليلتر واحد من تحلل خلايا الدم الحمراء ، واحتضانها على الجليد لمدة خمس دقائق.

لتحلل ثنائي الفينيل متعدد الكلور الملتصقة ، والتي لا تتم إزالتها من الدماغ عن طريق التروية داخل الفم. أضف تسعة ملليلتر من خلايا الغسيل المتوسطة RPMI وأجهزة الطرد المركزي عند 250 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. يقوم Resus بتعليق الكريات البيض المعزولة في الدماغ أو الحبيبات BSL التي تحتوي على الحبيبات في 50 إلى 100 ميكرولتر من وسط RPMI ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق تحسب الخلايا القابلة للحياة تحت المجهر باستخدام مقياس الخلوي الدموي واستبعاد ثلاثي الأزرق.

ستة أيام من الإصابة ، يمكن استرداد 20،000 إلى 100،000 BSLs بمجرد الحصول على عدد الخلايا القابلة للحياة. يتم تحضير الخلايا للتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي. وترد تفاصيل هذا الإجراء في الوثيقة المصاحبة، ولكن يتم تلخيصها هنا أولا.

يتم طرد جميع الخلايا المعزولة من كل دماغ في أنبوب فوج دقيق سعة 1.5 مليلتر ويتم تعليقها في مخزن مؤقت للتلطيخ باستخدام الأجسام المضادة المضادة للقرص المضغوط 16 و CD 32. بعد حضانة لمدة 10 دقائق على الجليد ، يتم غسل الخلايا بالطرد المركزي للتلطيخ مرة أخرى وإعادة تعليقها في مخزن مؤقت يحتوي على الأجسام المضادة المضادة للقرص المضغوط الرابع ، ومضادة للقرص المضغوط ثمانية ، ومضادة ل TCR ، ومضادة للأجسام الفلورية NK 1.1. يتم تحضين الخلايا على الجليد لمدة ساعة واحدة وغسلها بالتلوين والمخزن المؤقت وأجهزة الطرد المركزي.

بعد الدوران ، يتم إعادة تعليق الخلايا في PBS ويتم الحصول على ما لا يقل عن 5،000 إلى 10،000 حدث على مقياس التدفق الخلوي. يتم تحليل البيانات الناتجة باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي المناسب. تم استرداد مجموعات BSL من أدمغة الفئران المصابة بالملاريا والساذجة الملوثة بالملاريا والملطخة ب PE و NK 1.1 و PC الأجسام المضادة بيتا المضادة TCR.

هذه المخططات النقطية النسب المئوية للخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا الليمفاوية التائية والخلايا الإيجابية TCR الإيجابية NK 1.1 والخلايا السالبة المزدوجة. NK 1.1 سلبي TCR سلبي في الفئران المضطربة أو غير المدمجة والمصابة بالملاريا والساذجة بما يتفق مع النتائج السابقة. شكلت الخلايا التائية الإيجابية ألفا بيتا TCR نسبة عالية من مجموعة BSL في أدمغة الفئران المصابة بالملاريا في اليوم السادس بعد الإصابة.

يبدو أن هذه المجموعة الممثلة تمثيلا ناقصا بشكل كبير في أدمغة غير المنفوخة. ارتبط الانخفاض الواضح في ترددات الخلايا التائية في الأدمغة غير المنفوخة بنسبة أعلى بكثير وإجمالي عدد الخلايا السالبة المزدوجة في هذه. لم يتم اكتشاف نسبة عالية وأعداد الخلايا السالبة المزدوجة في أدمغة غير ممتلئة فقط في الفئران المصابة بالملاريا ، ولكن أيضا في الضوابط الساذجة التي تشير إلى أن هذه الخلايا عبارة عن كريات البيض غير الالتهابية الموجودة في الأوعية الدموية في الدماغ والتي يتم استردادها مع الخلايا الالتهابية إذا لم يتم إجراء التروية داخل القلب.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إجراء وفرة القلب داخل الفئران المصابة قبل استخراج الأعضاء لتجنب تلوث الكريات البيض المعزولة بالخلايا المنتشرة غير الالتهابية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وتحليل الكريات البيض المعزولة في الدماغ من الفئران المصابة بالمتصورة من خلال الهندسة المتدفقة.