Electroporation من الدماغ المؤخر لتتبع مسارات محور عصبي والأهداف متشابك في الجنين الفرخ

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسمية مجموعات فرعية محددة من الخلايا العصبية في الدماغ الخلفي للكتكوت وتتبع مساراتها وأهدافها المحورية. يتم تحقيق ذلك عن طريق فتح نافذة بيضاوية صغيرة أولا في وسط يوم جنيني.2.75. يتم حقن بلازميدات الحمض النووي التالية للبيض في تجويف الدماغ الخلفي.

ثم يتم كهرب الدماغ الخلفي من جانب واحد للسماح بالتعبير عن التركيبات في المجموعة العصبية المرغوبة وتحضين البويضات. أخيرا ، يتم تشريح جذع الدماغ من الجنين بأكمله لتحضير التثبيت المسطح أو تقسيم الأنسجة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر الإسقاطات المحورية والأهداف المشبكية في الخلف والدماغ والمخيخ في مراحل النمو المختلفة من خلال تلطيخ الفلورسنت المناعي وتحليل الفحص المجهري.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا العصبية التنموية ، مثل كيفية عرض خلايا عصبية معينة لأكواسها وتشكيل روابط متشابكة أثناء التطور الجنيني. للتحضير للتثقيب الكهربائي ، قم باحتضانها عند 37 إلى 38 درجة ونصف درجة مئوية لمدة 65 إلى 70 ساعة حتى تصل إلى المرحلة من 16 إلى 17. أثناء احتضان البيض ، تربط الشعيرات الدموية الزجاجية المسحوبة أقطاب كهربائية ذهبية منحنية على شكل حرف L بحامل محول بالراوي النبضي.

اضبط معلمات التثقيب الكهربائي على 25 فولت ، وخمسة أرقام نبضة ، وطول نبضة 45 مللي ثانية ، وفاصل نبض 300. قم بإعداد ماصة الفم ، وشرائط شكلية لإبرة حقنة سعة 10 ملليلتر ، وفرشاة ناعمة ، ومقص تشريح حاد ، و 25 مل من PBS المعقمة. قم بإعداد خليط مناسب من بلازميدات الحمض النووي وأضف صبغة خضراء سريعة لتصور الحمض النووي المحقون.

عندما يصل البيض إلى مرحلة النمو المناسبة ، أخرجه من الحاضنة واحتفظ به في وضع أفقي. استخدم 70٪ إيثانول لتنظيف قشر البيض. تعامل مع بيضة واحدة في كل مرة لتقليل التعرض الجنيني.

حان وقت الهواء بأطراف المقص. اصنع ثقبا في عمود البيض وباستخدام المحقنة ، قم بإزالة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من الألبومين. باستخدام مقص التشريح ، افتح نافذة بيضاوية صغيرة في القطب الأفقي العلوي لقشر البيض.

خلال العملية برمتها ، قم بتقطير بضع قطرات من PBS فوق الجنين لمنع الجفاف. باستخدام ماصة الفم، قم بتحميل كمية صغيرة من خليط الحمض النووي في الشعيرات الدموية الزجاجية. بعد ذلك ، ضع الجنين مع نهايته الخلفية وجهة نظر غير مباشرة.

ثم أمسك الشعيرات الدموية عند حوالي 45 درجة ، واخترق الدماغ الخلفي المدلل. لا تقم بإزالة أي غشاء من حول الجنين دون تكوين أي فقاعات هواء. الزفير بعناية لحقن محلول الحمض النووي في التجويف الخلفي.

سوف ينتشر المحلول للأمام مباشرة بعد حقن الحمض النووي. ضع الأقطاب الكهربائية المتوازية في مواضع الدماغ الخلفي AP و DV المستهدفة بالضبط. دون لمس القلب ، ادفع الأقطاب الكهربائية بطنيا قليلا ونبض الكهربائية.

يجب تغطية الأقطاب الكهربائية بالفقاعات للإشارة إلى التوصيل الكهربائي ، وإزالة الأقطاب الكهربائية بعناية وتقطير بضع قطرات من PBS لتبريد الجنين وإزالة الفقاعات. استخدم شريط perfil لإغلاق فتحة البيضة بشكل صحيح لمنع الجفاف أثناء الحضانة بفرشاة ناعمة وغسل الأقطاب الكهربائية PBS ، ضع البيضة في الحاضنة للمدة الزمنية المطلوبة. بقاء الأجنة على قيد الحياة حوالي 90٪ بعد يومين إلى ثلاثة أيام من التثقيب الكهربائي ويقل حتى 50٪ 12 يوما بعد التثقيب الكهربائي.

لعمل مستحضرات مسطحة للدماغ الخلفي ، قم بتشريح الجنين بعناية ، وفصله عن الأغشية والأوعية الدموية المحيطة. ضع الجنين في طبق بتري صغير مغطى بالسيليكون يحتوي على PBS مع توجيه الجنين إلى الظهر. استخدم دبابيس التنغستن لتثبيتها في الطبق.

ثم باستخدام شعري زجاجي حاد. قم بعمل شق ظهري في لوحة سقف الدماغ الخلفية باستخدام ملاقط حادة ومقص صغير. أمسك الجزء العلوي من الرأس واسحب أنسجة المخ الخلفية بعناية فائقة من المنقار إلى الصغير.

بعد فصل الدماغ الخلفي ، قم بإزالة الأنسجة البطنية المتبقية. احتضان الدماغ الخلفي في 4٪ ألدهيد بارافورم أو محلول PFA لمدة ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسله باستخدام PBT لإزالة PFA.

بعد اتباع مستحضر التألق المناعي الموضح في بروتوكول النص ، ضع الدماغ الخلفي مواجها ظهريا على شريحة زجاجية. أضف وسيط تركيب الفلورسنت إلى الدماغ الخلفي واستخدم الشعيرات الدموية الزجاجية أو إبر التنغستن لتسطيح الدماغ الخلفي على الشريحة. أضف كمية صغيرة من الشحوم في كل زاوية لمنع ضغط الأنسجة بواسطة زلة الغطاء.

ضع بعناية زلة غطاء أعلى الدماغ الخلفي لتجنب فقاعات الهواء للالتصاق. أضف طلاء الأظافر إلى حواف زجاج الغطاء. يمكن إجراء أقسام التبريد من جذع الدماغ في أي مرحلة من مراحل النمو بعد E 6.5.

يجب أن تكون الطريقة المفضلة بسبب صعوبة تصور المحاور في الجنين المسطح ، والذي يصبح سميكا جدا. علاوة على ذلك ، يتطلب عرض المشابك تقسيم الأنسجة وعرض التكبير العالي تحت المجهر. لتحضير عينة لقسم التبريد ، قم بتشريح الجنين وإزالة جميع الأنسجة المحيطة بالدماغ.

اشطفه باستخدام PBS. ثم استخدم مقصا دقيقا وملاقط حادة لقطع الجنين في منطقة التدليل من النخاع. قم بعمل شق واسع بين المخيخ والدماغ المتوسط وإزالة جذع الدماغ بالكامل.

يجب أن تحتوي الأنسجة على جسر النخاع والمخيخ. في المثال التالي ، تم استنساخ عنصر محسن يتم التعبير عنه في DA مجموعة فرعية واحدة من الخلايا العصبية البينية في الدماغ الخلفي للتحقق من المنبع من Cree recombinase وتضييق الكهربة مع بلازميد مراسل GFP السيتوبلازمي المعتمد على Cree. يكشف تحضير التثبيت المسطح في المرحلة E 4.5 عن نمطين من الإسقاط المحوري الصاعد المقابل لرسم خريطة الإسقاطات المحورية ل DA one inter neurons في مراحل لاحقة من التطور.

تم استنساخ كاسيت مراسل GFP غير المشروط قبل الاحتيال بين ذراعين على ظهر الخنزير ، جنبا إلى جنب مع محسن الكرين الواحد A TOH وناقل النقل. باستخدام هذه الإستراتيجية ، يتم دمج MG FP الشرطي C المغذي بالكهرباء في كروموسومات الكتاكيت ، وبالتالي ، تتم إزالة كاسيت الإيقاف فقط في الخلايا العصبية D one التي تتيح التعبير المطول عن GFP. في [د] واحدة خلية.

يربطه الشكل الميزلي ل GFP بالغشاء بحيث يتم توطينه على طول الغشاء المحوري بدلا من تخفيفه في السيتوبلازم. في السيقان العقلية التي تم جمعها في E 13.5 وتحليلها في أقسام سهمية. تم العثور على محاور DA واحدة لتتراكم في المخيخ وتمتد نحو الطبقة الحبيبية الخارجية أو EGL ، والتي تميزت ب ZI واحدة خلايا موجبة.

تم تحليل الأهداف المشبكية لمحاور D واحدة في المخيخ. تم تزويد الأجنة E 2.75 بالكهرباء باستخدام بروتين الحويصلة المشبكية اثنين من البلازميد المراسل ، جنبا إلى جنب مع محسن H واحد Cree وتبديل الظهر. تتيح هذه الطريقة التعبير عن مراسل GFP في DA قبل المشبكي ، محطة محورية واحدة.

تم تقسيم المخيخ في E 13.5 وتم تلطيخه بعلامة ما قبل المشبكي العامة ، وكذلك بالكالبيندين الذي يصنف طبقة البيكيني. يوضح عرض التكبير العالي للقسم SV اثنين من الحويصلات المشبكية الإيجابية GFP في مناطق مخيخية متعددة ، بما في ذلك طبقة البيكيني. تكشف هذه النتيجة عن الوصلات المشبكية ل DA واحد الخلفي في الخلايا العصبية في المخيخ.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشغيل الحمض النووي بالكهرباء في هاين الطيور في اليوم الجنيني الثاني نقطة 75 من أجل تسمية مجموعة فرعية من الخلايا العصبية على وجه التحديد. يتيح هذا الإجراء للمرء متابعة الإسقاطات المحورية والوصلات المشبكية للخلايا العصبية المسماة في مراحل نمو متعددة.