المستمر الملاحظة المجهرية عالية الدقة من تنسخي الشيخوخة في الخميرة الناشيء.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تتبع خلايا خميرة أحادية المجموعة الكروموسومية (haplo) مفردة طوال فترة حياتها التضاعفية الكاملة. تتمثل الخطوة الأولى في تصنيع شريحة ميكروفلويديك تحتوي على مصفوفة من الوسادات الدقيقة. بعد ذلك، يتم تحميل خلايا الخميرة في شريحة الميكروفلويديك، وبما أن المنطقة الموجودة أسفل الوسادات الدقيقة لها ارتفاع مشابه لقطر خلية الخميرة، فإن الخلايا ستستقر هناك.

بعد ذلك، يتم تطبيق تدفق مستمر من الوسط الغذائي الطازج فوق خلايا الخميرة المحتجزة، ويتم غسل الخلايا الوليدة الناشئة بواسطة تدفق الوسط الغذائي. ويُستخدم المجهر ذو الحقل المضيء والمجهر الفلوري لتصور التغيرات في مورفولوجيا الخلايا أو العضيات، والتعبير البروتيني، وتمركز البروتين التي قد تحدث في خلايا الخميرة الهرمة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطريقة التشريح المجهري التقليدية في أنها أقل استهلاكاً للجهد وتتيح الحصول على صور مجهرية مستمرة طويلة المدى لدورة الحياة الكاملة لخلايا الخميرة الفردية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول الشيخوخة التكرارية، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً في الدراسات التي تتطلب ملاحظة مجهرية مستمرة لفترات زمنية طويلة. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات نظراً للحاجة إلى توخي الحذر في خطوات محددة من عملية إنتاج شريحة micro feic. بالإضافة إلى ذلك، قد يتطلب تحميل الخلايا في شريحة micro feic بعض الخبرة.

يتم إنتاج قالب رقاقة السيليكون عن طريق الليثوغرافيا اللينة. وللحصول على تفاصيل إنتاجه، يرجى الرجوع إلى البروتوكول المرفق. قم بقص قطعة من شريط لاصق متين إلى شرائح رفيعة يبلغ قياسها حوالي 0.5 millimeters في ثلاثة millimeters.

باستخدام مشرط، ضع الشرائح بعناية على قالب رقاقة السيليكون بحيث تكون فوق هيكل القناة قليلاً بين قنوات المدخل وmicro padre. بعد ذلك، قم بتغطية طبق بتري زجاجي بطبقة مزدوجة من رقائق الألومنيوم وضع الرقاقة في طبق بتري. ستمنع رقائق الألومنيوم تسرب PDMS بين الرقاقة وطبق بتري أثناء إنتاج الرقائق المائعية الدقيقة.

لبدء إجراء تصنيع الرقائق الموائعية الدقيقة، ضع كوباً بلاستيكياً فارغاً على الميزان ثم قم بتصفيره. صب 40 grams من قاعدة PDMS في الكوب البلاستيكي. أضف عامل تصلب PDMS بنسبة وزنية تبلغ 1 إلى 10، وهو ما يعادل في هذه الحالة حوالي أربعة milliliters.

باستخدام الماصة البلاستيكية المخصصة للاستخدام مرة واحدة، اخلط المزيج جيداً لعدة دقائق؛ ومن المهم التأكد من تجانس المزيج تماماً لضمان بلمرة الـ PDMS بشكل صحيح لاحقاً. صب الـ PDMS فوق الرقاقة الموجودة في أطباق بيتري الزجاجية. سيحتوي مزيج الـ PDMS في طبق بيتري على الكثير من الفقاعات التي تتطلب عملية إزالة الغاز (Degas).

ضع طبق بتري الذي يحتوي على PDMS في مجفف متصل بمضخة تفريغ لمدة 30 دقيقة تقريباً حتى يتم إزالة جميع الفقاعات. قم ببلمرة PDMS عن طريق وضع طبق بتري مع الرقاقة فوق لوح ساخن عند درجة حرارة 120 درجة Celsius لمدة ساعة واحدة، تليها درجة حرارة 65 درجة Celsius لمدة ساعة أخرى. بعد مرور الساعتين، قم بإزالة رقاقة رقاقة الألومنيوم وPDMS المبلمر من طبق بتري الزجاجي.

قم بإزالة رقاقة الألومنيوم الملتصقة بـ PDMS من الجزء الخلفي للرقاقة (wafer). بعد ذلك، ارفع طبقة PDMS بعناية من الجزء العلوي للرقاقة. ضع طبقة PDMS مقلوبة بحيث تكون القنوات متجهة للأعلى على طاولة المختبر، وقم بقص تصاميم الرقائق المنفردة المطبوعة على PDMS بعناية باستخدام المشرط.

حاول الاحتفاظ بحوالي 3 mm من الـ PDMS حول حواف القنوات. الخطوة التالية هي ثقب ثقوب في الـ PDMS عند نهايات المدخل والمخرج والقناة الجانبية كما هو موضح في هذا المخطط. لثقب الثقب، ادفع سن إبرة (lure stub) قياس 20 gauge بالكامل عبر الـ PDMS بطريقة مستقيمة.

قم بإزالة عمود PDMS الموجود في نتوء الطُعم قبل سحب النتوء للخارج. ويهدف ذلك مجدداً إلى منع عمود PDMS من سد الثقب الذي تم تثقيبه حديثاً. وبمجرد الانتهاء من تثقيب جميع الثقوب، قم بتنظيف أسطح الشريحة من جزيئات الغبار وبقايا PDMS عن طريق وضع شريط لاصق عليها ثم نزعه على الفور.

وبالمثل، قم بتنظيف شريحة الغطاء الزجاجي التي سيتم تثبيت الرقاقة عليها. ضع الرقاقة والغطاء الزجاجي أسفل مصباح الأشعة فوق البنفسجية لجهاز تنظيف الأوزون بالأشعة فوق البنفسجية المكتبي، بحيث تكون الجوانب التي يلزم ربطها معاً مواجهة للمصباح ومعرضة للأشعة فوق البنفسجية لمدة تتراوح بين ست إلى ثماني دقائق، ثم ضع الأسطح المعرضة فوق بعضها البعض. انقر برفق حول جوانب الرقاقة لتعزيز التصاق PDMS بالغطاء الزجاجي، ولإزالة أي فقاعات هوائية.

تجنب النقر على الجزء العلوي من هيكل القناة لأن ذلك قد يؤدي إلى التصاق الوسادات الدقيقة بالغطاء، وكذلك الزجاج. ضع تجهيزات الموائع الدقيقة التي تم إعدادها حديثًا على لوح تسخين عند 100 درجة Celsius لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، تحقق من ترابط غطاء الزجاج مع شريحة PDMS عن طريق رفع حواف شريحة PDMS قليلاً. إذا تعذر القيام بذلك، فإن عملية الترابط قد تمت بنجاح وأصبحت الشريحة جاهزة للاستخدام. ولتجهيز الشريحة الموائعية الدقيقة لتحميل الخلايا، ضع الشريحة في الحامل المعدني مع وضع جل السيليكون بين زجاج الشريحة والأجزاء المعدنية للحامل.

لإنشاء سدادة مقاومة للماء، قم بربط الصواميل برفق لتجنب كسر الزجاج. صِل أنابيب رفيعة بالقناة الجانبية وقناة المخرج في الرقاقة. يسهل استخدام الملاقط إدخال الأنابيب في الثقوب المخرمة.

املأ حقنة lure lock سعة 50 milliliter بوسط استنبات. قم بتفريغ الهواء من الحقنة ثم وصلها بالتتابع بحقنة أخرى. قم بترشيح lure stub بمقياس 20 gauge، وأنبوب قصير سميك، وأنبوب رفيع.

ضع المحقنة في مضخة المحاقن وقم بتشغيل المضخة بسرعة حتى يمتلئ الأنبوب الرفيع بالوسط تماماً. أدخل الأنبوب الرفيع المتصل بالمحقنة في قناة المدخل واترك الوسط يتدفق عبر الشريحة بمعدل 10 µL في الدقيقة. اجمع الوسط الخارج من الشريحة في طبق بتري.

سوف يتدفق الوسط عبر القناة الجانبية، وذلك بسبب فرق المقاومة بين القناة الجانبية المصنوعة من علامة متينة وكبيرة وقناة المخرج. ضع الشريحة على منصة المجهر واضبط تركيز المجهر على الوسادات.

لبدء هذا الإجراء، قم بتوصيل محقنة ذات طرف لور سعة 5 mL بوصلة لور قياس 20 gauge وبأنبوب سميك. املأ المحقنة بحوالي 1 mL من معلق الخلايا المراد تحميله في الشريحة. يُفضل أن يتراوح عدد الخلايا عند التحميل بين 1 و5 × 10⁶ خلايا لكل mL.

قم بخفض معدل تدفق مضخة السرنجة إلى 0.5 microliters per minute. الجزء الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو تحميل الخلايا في الشريحة المائعية الدقيقة (microchip)، وهو أمر يتطلب عادةً بعض التدريب.

قم بتوصيل المحقنة التي تحتوي على معلق الخلايا بأنبوب قناة المخرج. قم بتحميل الخلايا عن طريق الضغط على مكبس المحقنة. راقب بلطف دخول الخلايا واستقرارها أسفل الوسادات الدقيقة عبر العدسة العينية أو شاشة الكمبيوتر.

حافظ على الضغط على المكبس حتى تستقر كمية كافية من الخلايا تحت الوسادات. الحمولة المثلى هي من خلية واحدة إلى ثلاث خلايا لكل وسادة. افصل المحقنة المستخدمة لتحميل الخلايا واغسل القناة الجانبية لبضع دقائق بمعدلات تدفق أعلى لإزالة الفقاعات الهوائية أو الخلايا التي لم تخرج من الشريحة بعد.

قم بخفض تدفق مضخة الحقنة مرة أخرى إلى 0.5 microliters per minute، وأغلق القناة الجانبية عن طريق توصيلها بأنبوب سميك يحتوي على سدادة قسطرة في نهايته. قم بزيادة تدفق مضخة الحقنة إلى معدل تدفق نهائي يتراوح من one to five microliters per minute. قد تختلف معدلات التدفق اعتماداً على الوسط وسلالة الخميرة.

ابدأ بتصوير مقطع فيديو باستخدام إعدادات المجهر والكاميرا المناسبة لهدف التجربة. هذا مثال لمقطع فيديو بتقنية التصوير الزمني (time-lapse) لخلية واحدة من النوع البري (wild type) من سلالة E تنمو على وسط YPD. تم التقاط صور للوسط كل 10 دقائق، ويمثل شريط المقياس الموضح خمسة micrometers.

تنتج الخلية ما مجموعه 30 برعماً قبل أن تموت. ويمكن تحديد عمر التكاثر عن طريق حساب عدد البراعم التي تنتجها خلية أم واحدة. يتم تحويل هذه البيانات إلى منحنى عمر من خلال رسم النسبة المئوية للخلايا الحية مقابل عدد البراعم المنتجة أو عدد الأجيال.

يوضح هذا الشكل مثالاً لمنحنيات طول العمر التي تم الحصول عليها لسلالة خميرة من النوع البري وسلالتين طافرتين. يؤدي حذف جين SER2 إلى قصر طول العمر، بينما يؤدي حذف جين FOB1 إلى زيادة طول العمر. ويمكن دراسة مورفولوجيا الميتوكوندريا كدالة في العمر باستخدام الجهاز الموائع دقيق القنوات.

أُجريت تجربة شيخوخة باستخدام خلايا خميرة من النوع البري BY 7 42 تعبر عن ILV 3G FP، والذي يتم توجيهه إلى الميتوكوندريا. في هذا الشكل، يشير السهم الأبيض إلى مثال تمثيلي للتغيرات المرتبطة بالعمر في مورفولوجيا الميتوكوندريا داخل خلية واحدة. جميع الصور بمقياس رسم متماثل، ويمثل شريط القياس خمسة ميكرومترات (5 µm).

الفيديو الثاني بنظام الفاصل الزمني هو لخلية واحدة تعبر عن ILV 3G FP من التجربة التي رُصد فيها مورفولوجيا الميتوكوندريا كدالة في العمر. تم التقاط الصور كل 30 دقيقة، ويمثل شريط المقياس خمسة micrometers. يوضح هذا الشكل النهائي مورفولوجيا الميتوكوندريا التي لوحظت في نفس المجموعة من الخلايا في أعمار تضاعفية مختلفة قبل إنتاج أول برعم لها، وبعد 10 buds، وقبل الوفاة.

تتضمن الصور المرفقة مثالاً لكل فئة من فئات المورفولوجيا: الأنبوبية، والأنبوبية المجزأة، والبقع والبقع الكبيرة. تشبه التغيرات المورفولوجية الملحوظة في الخلايا متوسطة العمر تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقاً من خلال المراقبة المستمرة للخلايا أثناء انقسامها. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في شيخوخة التضاعف لدى الخميرة، مثل: لماذا تشيخ خلية الخميرة، وما هي التغيرات المظهرية التي تحدث، وكيف تؤثر هذه التغيرات على عمر التضاعف للخميرة؟

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادراً على صنع الرقائق الدقيقة الخاصة بك ودراسة الشيخوخة التكرارية في الخلايا باستخدام أي مجهر فلوري تقريباً.