المستمر الملاحظة المجهرية عالية الدقة من تنسخي الشيخوخة في الخميرة الناشيء.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تتبع خلايا الخميرة الهابلو المفردة خلال عمرها التكاثري بالكامل. تتمثل الخطوة الأولى في صنع شريحة موائع دقيقة تحتوي على مجموعة من الوسادات الدقيقة. بعد ذلك ، يتم تحميل خلايا الخميرة في شريحة الموائع الدقيقة ، ولأن المنطقة الموجودة أسفل الوسادات الدقيقة لها ارتفاع مشابه لقطر خلية الخميرة ، فإن الخلايا ستستقر هناك.

بعد ذلك ، يتم تطبيق تدفق مستمر للوسط الطازج على خلايا الخميرة المحاصرة ، ويتم غسل الخلايا الوليدة الناشئة عن طريق تدفق المجال الساطع المتوسط والفلورة. يستخدم الفحص المجهري لتصور التغييرات في مورفولوجيا الخلية أو العضيات ، وتعبير البروتين ، وتوطين البروتين الذي قد يحدث في خلايا الخميرة المتقدمة في السن. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على طريقة التشريح المجهري الكلاسيكية هي أنها أقل كثافة في العمالة وأنها تتيح صورا مجهرية مستمرة طويلة الأمد لكامل عمر خلايا الخميرة الفردية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للشيخوخة التكرارية ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا للدراسات التي تتطلب المراقبة المجهرية المستمرة على مدى فترات طويلة من الزمن. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه يجب توخي الحذر في خطوات معينة لإنتاج رقاقة feic الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتطلب تحميل الخلايا في رقاقة Feic الدقيقة بعض الخبرة.

يتم إنتاج قالب رقاقة السيليكون بواسطة الطباعة الحجرية الناعمة. للحصول على تفاصيل إنتاجه ، يرجى الرجوع إلى البروتوكول المصاحب. يقطع النص قطعة من العلامات الصعبة إلى شرائح رفيعة يبلغ حجمها حوالي 0.5 ملم × ثلاثة ملليمترات.

باستخدام مشرط ، ضع الشرائط بعناية على قالب رقاقة السيليكون قليلا أعلى هيكل القناة بين قنوات المدخل والبادرة الصغيرة. بعد ذلك ، قم بتغطية طبق بتري زجاجي بطبقة مزدوجة من رقائق الألومنيوم وضع الرقاقة في طبق بتري. ستمنع رقائق الألومنيوم PDMS من العمل بين الرقاقة وطبق بتري أثناء إنتاج رقائق الموائع الدقيقة.

لبدء إجراء صنع رقائق الموائع الدقيقة ، ضع كوبا بلاستيكيا فارغا على الميزان وقم بتمزيق التوازن. صب 40 جراما من قاعدة PDMS في الكوب البلاستيكي. أضف عامل معالجة PDMS بنسبة وزن إلى وزن من واحد إلى 10 ، والتي تبلغ في هذه الحالة حوالي أربعة ملليلتر.

باستخدام الماصة البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة والممزوجة جيدا لعدة دقائق، من المهم أن يتم خلط الخليط جيدا لضمان البلمرة المناسبة ل PDMS لاحقا. صب PDMS فوق الرقاقة في طبق بتري الزجاجي. سيحتوي خليط PDMS في طبق بتري على الكثير من الفقاعات إلى ديغا.

مكان PDMS ، طبق بتري في مجفف متصل بمضخة تفريغ لمدة 30 دقيقة تقريبا عند إزالة جميع الفقاعات. بلمرة PDMS عن طريق وضع طبق بتري مع الرقاقة فوق صفيحة ساخنة على حرارة 120 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، متبوعة ب 65 درجة مئوية لمدة ساعة أخرى. بعد ساعتين ، قم بإزالة رقاقة رقائق الألومنيوم و PDMS المبلمر من طبق بتري الزجاجي.

انزع ورق الألمنيوم في PDMS من الجزء الخلفي من الرقاقة. ثم ارفع طبقة PDMS بعناية من أعلى الرقاقة. ضع طبقة PDMS رأسا على عقب بحيث تكون القنوات متجهة لأعلى وقم بقص تصميمات الشريحة المفردة المطبوعة بعناية على PDMS باستخدام المشرط.

حاول الاحتفاظ بحوالي ثلاثة ملليمترات من PDMS حول حواف القنوات. الخطوة التالية هي عمل ثقوب في نظام إدارة البيانات (PDMS) في نهايات مخرج المدخل والقناة الجانبية كما هو موضح في هذا الرسم البياني. لإحداث ثقب ، ادفع كعب إغراء قياس 20 على طول الطريق عبر PDMS بطريقة مستقيمة.

قم بإزالة عمود PDMS في كعب الإغراء قبل سحب كعب الروتين للخارج. مرة أخرى ، هذا يمنع عمود PDMS من سد الثقب المثقوب حديثا. بمجرد ثقب جميع الثقوب ، قم بتنظيف أسطح الرقاقة من جزيئات الغبار ونظام PDMS المتبقي عن طريق وضع شريط لاصق عليها وإزالة الشريط على الفور.

وبالمثل ، قم بتنظيف زجاج الغطاء الذي سيتم توصيل الشريحة به. ضع الشريحة وزجاج الغطاء أسفل مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمنظف الأوزون بالأشعة فوق البنفسجية مع الجوانب التي تحتاج إلى ربطها ببعضها البعض ، في مواجهة المصباح المعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة ست إلى ثماني دقائق ، وضع الأسطح المكشوفة فوق بعضها البعض. اضغط برفق حول جوانب الشريحة لتعزيز ربط نظام إدارة المفاتيح السياحي بزجاج الغطاء وإزالة أي فقاعات هواء.

لا تنقر على الجزء العلوي من بنية القناة لأن ذلك قد يتسبب في تثبيت الوسادات الصغيرة بالغطاء. زجاج كذلك. ضع إعداد الموائع الدقيقة المصنوع حديثا على لوح ساخن على حرارة 100 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، تحقق من ربط زجاج الغطاء بشريحة PDMS عن طريق رفع حواف شريحة PDMS قليلا. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فإن الترابط ناجح وتكون الشريحة جاهزة للاستخدام. لتحضير رقاقة الموائع الدقيقة لتحميل الخلية ، ضع الشريحة في الحامل المعدني مع هلام السيليكون بين زجاج الرقاقة والأجزاء المعدنية للحامل.

لإنشاء ختم مقاوم للماء ، قم بلف الصواميل برفق لتجنب كسر الزجاج. قم بتوصيل الأنابيب الرفيعة بالقناة الجانبية وقناة مخرج الشريحة. يسهل استخدام الملقط إدخال الأنبوب في الثقوب المثقوبة.

املأ حقنة قفل إغراء سعة 50 مليلتر بوسط الاستزراع. قم بإزالة الهواء من المحقنة وقم بتوصيله بالتتابع بحقنة. قم بتصفية كعب إغراء قياس 20 وأنبوب قصير وسميك وأنبوب رفيع.

ضع المحقنة في مضخة الحقنة وقم بتقديم المضخة بسرعة حتى يمتلئ الأنبوب الرفيع بالكامل بالوسط. ادفع الأنبوب الرفيع المتصل بالحقنة إلى قناة مدخل القناة واترك الوسيط يتدفق عبر الرقاقة بمعدل 10 ميكرولتر في الدقيقة. اجمع الوسط مع ترك الشريحة في طبق بتري.

سوف ينفد الوسيط عبر القناة الجانبية. بسبب اختلاف المقاومة بين العلامة الصعبة الكبيرة المصنوعة من القناة الجانبية وقناة المخرج. ضع الشريحة على مرحلة المجهر واضبط تركيز المجهر على الوسادات.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتوصيله بحقنة طرف إغراء سعة خمسة ملليلتر بكعب إغراء قياس 20 وأنبوب سميك. قم بتحميل المحقنة بحوالي ملليلتر واحد من تعليق الخلية ليتم تحميلها في الشريحة. يتراوح عدد الخلايا المفضل للتحميل بين واحد وخمسة أضعاف 10 من الخلايا الست لكل مليلتر.

قلل معدل تدفق مضخة الحقنة إلى 0.5 ميكرولتر في الدقيقة. أصعب جزء في هذا الإجراء هو تحميل الخلايا في شريحة الميكروم. هذا يتطلب عادة بعض الممارسة.

قم بتوصيل المحقنة التي تحتوي على تعليق الخلية بأنبوب قناة المخرج. قم بتحميل الخلايا بالضغط على مكبس المحقنة. راقب بلطف الخلايا القادمة وتستقر تحت الوسادات الدقيقة عبر شاشة العين أو الكمبيوتر.

حافظ على الضغط على المكبس حتى تستقر خلايا كافية تحت الوسادات. الحمل الأمثل هو خلية إلى ثلاث خلايا لكل وسادة. افصل المحقنة المستخدمة لتحميل الخلية واغسل القناة الجانبية لبضع دقائق بمعدلات تدفق أعلى لإزالة فقاعات الهواء و / أو الخلايا التي لم تخرج بعد من الشريحة.

قلل تدفق مضخة الحقنة إلى 0.5 ميكرولتر في الدقيقة مرة أخرى ، وأغلق القناة الجانبية عن طريق توصيلها بأنبوب سميك يحتوي على سدادة قسطرة في نهايتها. قم بزيادة تدفق مضخة الحقنة إلى معدل تدفق نهائي من واحد إلى خمسة ميكرولتر في الدقيقة. قد تختلف معدلات التدفق حسب سلالة الوسط والخميرة.

ابدأ فيلما بالمجهر وإعداد الكاميرا المناسب لهدف التجربة. هذا مثال على فيلم الفاصل الزمني لخلية برية واحدة من النوع E تنمو على YPD. تم التقاط صور متوسطة كل 10 دقائق ويمثل شريط المقياس المعروض للتو خمسة ميكرومترات.

تنتج الخلية ما مجموعه 30 برعما قبل أن تموت. يمكن تحديد العمر التكاثري عن طريق حساب عدد البراعم التي تنتجها خلية أم واحدة. يتم تحويل هذه البيانات إلى منحنى العمر الافتراضي عن طريق رسم النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة مقابل عدد البراعم المنتجة أو عدد الأجيال.

يوضح هذا الشكل مثالا على منحنيات العمر التي تم الحصول عليها لسلالة الخميرة البرية وسلالتين متحولتين. يؤدي حذف جين SER إلى عمر أقصر بينما يؤدي حذف الجين FOB إلى عمر أطول. يمكن دراسة مورفولوجيا الميتوكوندريا كدالة للعمر باستخدام جهاز الموائع الدقيقة.

تم إجراء تجربة الشيخوخة مع BY 7 42 خلية خميرة من النوع البري تعبر عن ILV 3G FP ، والتي تستهدف الميتوكوندريا. في هذا الشكل ، يشار إلى مثال تمثيلي للتغيرات المرتبطة بالعمر في مورفولوجيا الميتوكوندريا في خلية واحدة بواسطة السهم الأبيض. يتم تغيير حجم جميع الصور بشكل متماثل ويمثل شريط المقياس خمسة ميكرومترات.

فيلم الفاصل الزمني الثاني هو خلية واحدة تعبر عن ILV 3G FP من التجربة حيث لوحظت مورفولوجيا الميتوكوندريا كدالة للعمر. تم التقاط الصور كل 30 دقيقة ويمثل شريط المقياس خمسة ميكرومترات. يوضح هذا الشكل النهائي مورفولوجيا الميتوكوندريا التي لوحظت في نفس المجموعة من الخلايا في أعمار تكاثرية مختلفة قبل إنتاج برعمها الأول بعد 10 براعم وقبل الموت.

يتم تضمين مثال على صورة لكل فئة من فئات التشكل أنبوبي ، أنبوبي مجزأ ، وبقع وبقع كبيرة. تشبه التغييرات المورفولوجية التي شوهدت في الخلايا في منتصف العمر تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا من خلال المراقبة المستمرة للخلايا أثناء انقسامها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الشيخوخة التكاثرية للخميرة ، مثل سبب تقدم خلايا الخميرة في العمر ، وما هي التغييرات المظهرية التي تحدث ، وكيف تؤثر هذه على العمر التكاثري للخميرة؟

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تعرف كيفية إنشاء رقائق دقيقة خاصة بك ودراسة الشيخوخة التكاثرية في الخلايا باستخدام أي مجهر فلوري بشكل أساسي.