في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

التغيرات الجزيئية المعتمدة في الخلايا العصبية ضرورية لقدرة الدماغ على التكيف استجابة للتحديات السلوكية. يتم وصف طريقة تصوير الفوتون في الجسم الحي هنا والتي تسمح بتتبع مثل هذه التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية الفردية من خلال مراسلين مشفرين وراثيا. أحد الجينات المعتمدة ذات الخبرة الراسخة هو البروتين أو القوس المرتبط بالهيكل الخلوي المنظم للنشاط.

يتم تحفيز نسخ ARC بسرعة وبشكل كبير من خلال النشاط العصبي المكثف لتمكين فحص التعبير القوسي في الخلايا العصبية الحية عن طريق اثنين من الفحص المجهري للصور ، نستخدم خط الفأر المضرب الذي يتم فيه وضع مراسل GFP تحت سيطرة محفز القوس الداخلي. يصف هذا البروتوكول الاستعدادات الجراحية وإجراءات التصوير لتتبع أنماط تعبير GFP التابع للقوس في المجموعات العصبية في الحي. أولا ، سنصف تحضير اللازم لهذه التقنية.

سيخضع GFP القوسي لجراحة في نافذة الجمجمة ويتعافى من الجراحة لمدة أسبوعين تقريبا. ثم يتم فحص جودة نافذة الجمجمة وإذا كان من الممكن تصوير الخلايا العصبية من خلالها ، يتم وضع في بيئة qua حتى بداية تجربتي تصوير الفوتون السلوكيتين وتجربتين لتصوير الفوتون. ثم يتم تصوير هذه بشكل متكرر بواسطة منظارين مجهريين للصور.

بعد اكتمال النماذج السلوكية المرغوبة على مدار عدة أيام ، قم بتنظيف جميع الأدوات في معقم الخرز الساخن. قبل الجراحة المعقمة ، نظف موقع الجراحة بنسبة 70٪ من الإيثانول وضع قطعة قماش نظيفة. تخدير بمحلول إيفرتون 1.2٪ المعطى بمعدل 0.02 مل لكل جرام داخل الصفاق.

تحقق من مستوى التخدير باستخدام قرصات الذيل أو إصبع القدم لضمان التخدير الكامل. قم بتغطية عيون بمرهم عيون معقم وحقن ديكساميثازون 0.2 ملليغرام لكل كيلوغرام وكاربروفين خمسة ملليغرام لكل كيلوغرام تحت الجلد. احلق الشعر فوق الجمجمة بين الأذنين وقم بتعقيم الجلد باستخدام مقشر البيتادين وثلاث مسحات متناوبة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، قم بتركيب في مرحلة الجراحة التجسيمية باستخدام قضبان الأذن مع وسادة تسخين دوران الماء أسفل عند 37 درجة.

تحقق بانتظام من مستويات تخدير واستكمل جرعة التخدير الأصلية حسب الحاجة. حقن 200 ميكرولتر من 0.5٪ ماركيين تحت جلد فروة الرأس لتخدير المنطقة وشق الجلد وإزالة سديلة الجلد فوق الجمجمة. قم بإزالة السمحاق وجفف المنطقة بمسحات قطنية نظيفة.

استخدم مثقابا عالي السرعة للأسنان مع لدغ 0.5 ملم لتحديد دائرة قطرها ثلاثة إلى خمسة ملليمترات برفق فوق منطقة الدماغ التي تهمك حسب احتياجاتك. بلل موقع الحفر بشكل دوري بمحلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ وقم بإزالة غبار العظام باستخدام مسحات قطنية نظيفة. إذا نزف العظام ، استخدم رغوة الجل المبللة مسبقا بمحلول ملحي معقم لمسح النزيف وانتظر حتى يتوقف.

عند الوصول إلى الطبقة العظمية الأخيرة ، ارفع وقم بإزالة جزيرة العظام باستخدام ملقط ناعم. قد تواجه مرفقات جافية على الرف السفلي للعظم. إذا كانت نافذتك تتقاطع مع خياطة العظام ، فيجب إزالتها برفق.

عندما يتم رفع السديلة العظمية ، قم بلف رغوة الجل المبللة برفق فوق الجافية المكشوفة لتنظيف سطحها وانتظر توقف أي نزيف جافوي. إذا كانت منطقة اهتمامك تحت موقع به جافية سميكة بشكل خاص ، فقد يكون من الضروري إزالة الجافية فوقها. إذا كانت هذه هي الحالة، افصل الجافية برفق عن PIA أدناه باستخدام ملقط دقيق جدا.

قم بعمل شق صغير في الجافية المرفوعة باستخدام زوج آخر من الملقط الناعم. ثم أمسك الحواف المقطوعة وقسم الجافية برفق. الجافية رقيقة ولكنها قوية ، لذا احرص على عدم تقطيع الدماغ بحواف سليمة للجافية.

أثناء العمل ذهابا وإبعادا عن منطقة اهتمامك ، اشطف المنطقة بكمية وفيرة باستخدام السائل الدماغي النخاعي المعقم أو محلول ملحي معقم. إذا كانت الجمجمة المحيطة تنحني بشكل كبير حول الجافية المكشوفة أو البياء ، فاستخدم مادة لاصقة سريعة للخلايا لملء الفراغات التي لا تتلامس عن كثب مع غطاء النافذة في المناطق التي لن يتم تصويرها. ثم ضع غطاء زجاجي معقم ، وانزلق برفق فوق الجافية أو البيا.

استخدم جل الأكريليك سانو لتغطية لاصق المطاط الصناعي وحواف الزجاج. زلة الغطاء. قم بتغطية الجمجمة المكشوفة بالكامل بجل سانو سيانواكريليت أو غراء مجنون وخليط أسمنت الأسنان.

قم بتضمين قضيب تثبيت رأس معدني مصنوع خصيصا في الطرف المقابل من الجمجمة. أعد إلى غرفة التعافي الدافئة بعد حقن كيتوبروفين داخل الصفاق خمسة ملليغرام لكل كيلوغرام للتحكم في الألم. استمر في تناول المسكن لمدة يومين بعد العملية.

بعد أسبوعين من التعافي بعد الجراحة ، قم بتخدير بالفلور ISO. 5٪ للحث ، 1.5٪ للصيانة. قم بتثبيته في مرحلة مجهر مخصصة مع إطار تثبيت الرأس وتحقق من نافذة الجمجمة للتأكد من الوضوح البصري.

تحت الإضاءة بالضوء الأزرق ، فإن وضوح الأوعية الدموية لسطح الدماغ يدل بشكل كبير على جودة نافذة الجمجمة. إذا تم تحديد حوافها بشكل حاد ، فمن المحتمل أن تكون النافذة قابلة للاستخدام. قبل البدء في بروتوكول سلوكي ، يجب إبقاء في بيئة قفص منزلي متسقة لتقليل التباين اليومي.

في القوس الأساسي ، تبدأ مستويات تعبير GFP التدريب السلوكي أو نماذج التحفيز البيئي اعتمادا على منطقة الدماغ التي تهمهم. على سبيل المثال ، يمكن أن تتعرض لبيئات بصرية مختلفة على مدار أيام متتالية لتصوير مجموعات مميزة من الخلايا العصبية في قوس القشرة البصرية ، وعادة ما يصل مضان GFP في الخلايا العصبية إلى مستوى ذروته بعد ساعتين من التحفيز. يمكن تحسين الجدول الزمني التجريبي لتسهيل اكتشاف تعبير ARC GFP في الخلايا العصبية في مستويات ذروة تألقها.

بعد اكتمال جلسة التدريب السلوكي أو التحفيز البيئي ، قم بتخدير باستخدام فلور ISO 5٪ للحث ، و 1.5٪ للصيانة. قم بتركيب في مرحلة المجهر المخصص بإطار تثبيت الرأس. تحت المجهر الفوتوني ، يتم تثبيت موضع رأس على إطار تثبيت الرأس الذي يتصل مباشرة بالمسرح باستخدام الشريط المعدني المزروع على الجمجمة.

يتم توفير الفلور والأكسجين ISO باستمرار للفأر من خلال مخروط الأنف. يتم الحفاظ على درجة حرارة الجسم باستخدام وسادة تدفئة. تأكد من حماية أجهزة الكشف عن المجهر من الضوء المحيط.

من خلال إجراء مسحين بالليزر الفوتونيين في غرفة مظلمة ، استخدم عدسة غمر في الماء بفتحة رقمية 20 × أو 25 × 1.05 للتصوير. أولا ، تحت إضاءة مضان epi ، احصل على صورة لأنماط الأوعية الدموية السطحية فوق منطقة الدماغ ذات الاهتمام باستخدام كاميرا CCD. لمحاذاة الصورة في المستقبل ، ابدأ مسحا ضوئيا بالليزر الفوتوني للحصول على مكدس صور ثلاثي الأبعاد.

تم ضبط الطول الموجي للإثارة لليزر الفوتوني على 920 نانومتر ويتم ضبط الطاقة على حوالي 50. يتم الكشف عن التألق المنبعث من مللي واط في وقت واحد في كل من قوس القناة الأخضر والأحمر. يظهر تألق GFP فقط في القناة الخضراء ، بينما يظهر التألق الذاتي للأنسجة في كلتا القناتين.

مكدسات الصور النموذجية على أبعاد 320 × 300 تقريبا ، و 20 × 100 ميكرومتر ، ودقة أفقية تبلغ 0.5 ميكرومتر لكل بكسل ، ودقة رأسية تبلغ ثلاثة ميكرومتر لكل بكسل. بعد الحصول على مكدس الصور ، أعد إلى قفص منزله. لا تزعج حتى الجلسة السلوكية والتصوير التالية.

كرر السلوك وإجراء التصوير على مدار الأيام حسب الرغبة. استخدم صورة الأوعية الدموية على سطح الدماغ المكتسبة مسبقا للعودة إلى نفس موقع التصوير. تكمن قوة هذه التقنية في أنها تسمح بفحص تغيرات التعبير الجيني القوسي في نفس المجموعة من الخلايا العصبية على مدى عدة أيام.

في الحي. يمكن للطرق الكيميائية النسيجية القياسية تحقيق دقة خلية واحدة ، ولكن لا يمكنها تتبع تغيرات التعبير الجيني في نفس الخلايا العصبية على مدار عدة أيام. تفتقر تقنيات التصوير الأخرى مثل الرنين المغناطيسي أو طرق التصوير النووي إلى الدقة لتصوير الخلايا العصبية الفردية.

على هذا النحو ، لا توجد طرق أخرى موجودة لقياس تغيرات التعبير الجيني يمكن أن تتطابق مع كل من الدقة المكانية والتغطية الزمنية لطريقة التصوير الموضحة هنا. خطوة حاسمة في هذا الإجراء هي جراحة نافذة الجمجمة. يجب إجراؤه بعناية فائقة لتجنب صدمة الدماغ أو ترك الدم تحت زلة الغطاء الزجاجي.

يمكن إزالة الجافية إذا لزم الأمر. ضع في اعتبارك أن الحد الأقصى لعمق التصوير في الدماغ باستخدام هذا الإجراء سيعتمد على وضوح نافذة الجمجمة وإعداد المجهر وسطوع مراسلي الفلورسنت. يعد بروتوكول التصوير في الجسم الحي طريقة فعالة ومتعددة الاستخدامات للحصول على معلومات حول الديناميكيات الجزيئية المتعلقة بالمرونة العصبية في الخلايا العصبية الفردية استجابة للتجارب السلوكية المختلفة ، ومن المحتمل أن يكون قابلا للتطبيق بشكل عام على الفئران المعدلة وراثيا التي تحمل مراسلي الفلورسنت للجينات المنظمة الأخرى ذات الخبرة.