عزل والخلايا اللمفاوية المناعية والخلايا الجذعية من الفئران باير لالرقع

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الليمفاوية والخلايا المتغصنة وصبغها المناعي من بقع دافعي الخلايا العصبية ، باستخدام طريقتين تجريبيتين متوازيتين. أولا ، استكمال بقع دافعي الدفعات الجديدة من الماوس والأمعاء الدقيقة. ثم قم بفصل بقع الدافع جسديا ، وحصاد الأنسجة وتمريرها عبر مرشح شبكي لتوليد معلق خلية واحدة لتحليل قياس التدفق الخلوي.

حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتوزيع الحصص في صفيحة سفلية مستديرة 96 بئر. بعد ذلك ، قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة ضد علامات السطح الخاصة بنوع الخلية. انتقل على الفور إلى تحليل التدفق الخلوي لتعداد أنواع الخلايا المحددة بالتوازي مع عزل بقع دافع وعينات الأنسجة المجمدة المفاجئة.

في كتل OCT ، قسم التبريد ، يتم تسمية العينات بالأجسام المضادة ضد علامات السطح الخاصة بنوع الخلية ثم يتم تصورها عن طريق الفحص المجهري بالليزر المسح متحد البؤر معا. ستحدد هذه الطرق الخلايا البائية والخلايا التائية والخلايا المتغصنة في مقصورات محددة داخل أنسجة التصحيح الخاصة بالدافع. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن أنسجة التصحيح PI هشة للغاية ويمكن أن تتلف بسهولة.

أثناء المناولة. ضع الأمعاء الدقيقة المعزولة حديثا على سرير من المناشف الورقية المبللة أو مناديل كيم. ثم بلل الأمعاء الدقيقة برفق باستخدام محلول ملحي لمنع جفاف الأنسجة.

الآن ، حدد بصريا بقع دافعي الأفراد الموجودة على الجانب المضاد للمساريقية من الأمعاء. عادة ما يحتوي الماوس الواحد على خمسة إلى 10 تصحيحات دافع مرئية يتم توزيعها بالتساوي من الاثني عشر إلى الدقاق. باستخدام المقص الجراحي المنحني ، يقوم عموما باستئصال بقع الدافع الفردي.

ضعها في محلول فرز التوازن البارد ، مع الحفاظ على الأنسجة عند أربع درجات مئوية للحفاظ على صلاحية الخلية. بعد ذلك ، انقل بقع الدافع إلى خمسة ملليلتر من وسط تفكك الطحال ورجه بسرعة 250 دورة في الدقيقة لمدة 15 إلى 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم لتوليد معلق خلية واحدة ، ضع العينة على مصفاة خلية شبكية معقمة من النايلون 70 ميكرون وطحن الأنسجة بالقوة في الشبكة باستخدام قاعدة مكبس من حقنة سم مكعب واحدة لإزالة الركام الخلوي المتبقي.

صب تعليق الخلية من خلال خلية ثانية 70 ميكرون ، ومصفاة وجمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 أو 50 ملليلترا. قم بتوزيع 10 على الخلايا الخمس لكل بئر في 96 خلية بيليه من الألواح السفلية المستديرة عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 1000 مرة. G- ثم صب المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة برفق.

الآن أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت لكتلة FC واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، أضف الأجسام المضادة المترافقة بالفلور مباشرة إلى معلقات الخلايا عند التخفيف المطلوب واحتضانها على خلايا غسيل الثلج مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق. ثم أعد تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت لتحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي لعزل بقع دافعي الحفر للاستئصال بالتبريد.

قطع أجزاء عرضية بطول 0.5 سم من الأمعاء الدقيقة تحتوي على رقعة دافع واحدة. انقل الأنسجة إلى طبق بتري يحتوي على PBS. ثم ضع أجزاء الأنسجة المعوية عموديا داخل قوالب القاعدة التي تحتوي على OCT.

اغمر القوالب في النيتروجين السائل واترك الأنسجة تتجمد تماما. قم بإزالة القوالب الأساسية المجمدة من النيتروجين السائل باستخدام الملقط. اسمح للقالب بتسخين درجة حرارة الغرفة لفترة كافية حتى تلين حواف كتلة OCT.

ثم قم بإزالة الكتلة المجمدة من OCT من القالب. اقلب القالب واضغط برفق على الظهر لإخراج الكتلة على قطعة نظيفة من رقائق الألومنيوم أربعة × أربعة سنتيمترات. لف الأنسجة على الفور في ورق القصدير وضعها في كيس عينة مصنف مخزن في النيتروجين السائل أو على قسم التبريد الجاف بالثلج باستخدام ميكروتوم التبريد LI a CM 3 0 5 0 s أو ما يعادله.

اضبط درجة حرارة الغرفة على ناظم البرد على 21 درجة مئوية تحت الصفر. قطع أقسام من 12 إلى 14 ميكرون في السماكة. اجمع الأقسام على شرائح المجهر الزجاجي Supercross plus.

افحص العينات بصريا باستخدام مجهر ضوئي قياسي منخفض الطاقة. اغمر الشرائح في الأسيتون لمدة دقيقتين. ضع في اعتبارك أن الحضانة المطولة قد تتسبب في انفصال الأنسجة عن الشريحة.

اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBST. ثم قم بتطويق الأقسام بقلم مسعور للصورة. الآن احتضان العينات في مخزن مؤقت للكتلة ، وتراكب أقسام الأنسجة بمحلول الجسم المضاد الأولي.

جفف المنطقة المحيطة بالأقسام باستخدام مناديل كيم المبللة أو غيرها من الأنسجة الماصة دون لمس أقسام الأنسجة الفعلية. باستخدام ماصة أو قطارة ، ضع برفق قطرة من وسط التثبيت الذهبي المطول مباشرة على القسم. ضع زلة غطاء زجاجي ، وتجنب فقاعات الهواء ونشاف أي تركيب زائد.

يكشف تحليل الفاكس المتوسط للتعليق الأحادي المشتت لخلايا التصحيح الإجمالية للدافعين عن تمييز واضح بين مستحضرات الخلايا الجيدة والفقيرة في مستحضرات الخلايا الجيدة. مع أكثر من 80٪ من الجدوى ، تظهر الغالبية العظمى من الخلايا تشتت أمامي مرتفع يشير إلى حجم خلية مرتفع وتشتت جانبي منخفض يتوافق مع دقة الخلايا المنخفضة. في هذه التجربة ، تم إعداد ضعيف للخلية عمدا لإثبات أنه في مجموعة سكانية سيئة ، تظهر غالبية الخلايا انخفاض FSC ، و SSC مرتفع ، وهي خارج المشية R المشار إليها.

من المحتمل أن تخضع هذه الخلايا لموت الخلايا المبرمج و / أو النخر. هنا كوكتيل من ما يصل إلى أربعة فلور مختلفة. أربعة أجسام مضادة أحادية النسيلة مترافقة للتمييز بين مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا.

في الدافعين ، تم استخدام تعليق الخلية المفردة مع وضع العلامات مع مجموعة من علامات التمايز. يكشف القرص المضغوط 19 و B 20 أن الخلايا B تشكل حوالي 60٪ من دافعي البوابات. يمكن تعداد المجموعات الفرعية الخاصة بالخلايا التائية الخاصة بمجموعة الخلايا التصحيحية بسهولة عن طريق وضع العلامات المزدوجة مع الأجسام المضادة ضد القرص المضغوط الثالث والقرص المضغوط الرابع ، أو القرص المضغوط الثالث والقرص المضغوط ثمانية ، وتشكل الخلايا التائية الأربعة الإيجابية والمضغوطة الثماني إيجابية حوالي 23٪ و 9٪ على التوالي من إجمالي خلايا التصحيح الدافعين.

أيضا تعداد المجموعات الفرعية ل DC ، والتي ستكون CD 11 C موجبة و CD 1 0 3 موجبة بهذه الطريقة. تساهم CD 11 C الإيجابية DCS في حوالي 8٪ من إجمالي السكان المسورين ، وهو ما يعادل تقريبا 10،000 dcs لكل تصحيح دافع. من بين سكان الخلايا الإيجابية CD 11 C ، كان ما يقرب من 4.7٪ إيجابيا مزدوجا ل B اثنين 20 إيجابيا.

يتم الحصول على نتائج مماثلة عندما يتم جمع الخلايا المرقعة للدافعين من C 57 ستة فئران سوداء. يمكن أن تؤدي مستحضرات الخلايا السيئة إلى نتائج مضللة للغاية ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى أن الخلايا الميتة أو المحتضرة تميل إلى ربط الأجسام المضادة بشكل غير محدد. عادة ما يؤدي ذلك إلى تمثيل مفرط ل B 2 2 0 إيجابي و CD ثلاث خلايا موجبة مزدوجة موجبة بالإضافة إلى B خليتين بائية موجبة 20 و CD أربع خلايا موجبة

أقسام التبريد لتصحيح دافعي الفأر قابلة للتحليل النسيجي المرضي بالإضافة إلى وضع العلامات المناعية. في حين أن قوة الأقسام توفر مزيدا من الدقة على المستوى الخلوي عند تلطيخها ب h و e ، فإن المناطق الفاتحة والمظلمة للمراكز الجرثومية لتصحيح الدافعين يتم ترسيمها بسهولة أكبر في أقسام قسم التبريد. في هذا القسم النموذجي لتصحيح الدافعين ، الأجسام المضادة المضادة للقرص المضغوط الثلاثة ، قم بتسمية الخلايا التائية المضادة للأجسام المضادة CD 11 C.

تسليط الضوء على الخلايا المتغصنة ومضاد B اثنين من الأجسام المضادة 20. تسليط الضوء على الخلايا البائية بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في هذا المجال لفهم كيفية استجابة أنواع معينة من الخلايا مثل الخلايا المتغصنة داخل الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالأمعاء لمستضدات الأمعاء ومسببات الأمراض الميكروبية.

أثرت هذه المعلومات على تصميم وتطوير لقاح الغشاء المخاطي.