تقييم توصيل الجينات البوليمرية الجسيمات النانوية من تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر وعالية الإنتاجية قياس التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنفيذ وتقييم تجارب نقل الجينات باستخدام جسيمات نانوية بوليمرية غير فيروسية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تعداء الخلايا بجسيمات نقل الجينات، ثم يتم تقييم كفاءة التعداء باستخدام المجهر وتحليل قياس التدفق الخلوي عالي الإنتاجية.

بعد ذلك، يتم تحديد توزيع حجم الجسيمات النانوية، وتركيزها، وعدد البلازميدات لكل جسيم باستخدام جهاز تحليل تتبع الجسيمات النانوية. وفي النهاية، تسمح هذه الطريقة بتوصيف حجم الجسيمات النانوية، وقياس كفاءة عفن الجينات باستخدام الجسيمات النانوية. وتكمن الميزة الرئيسية لاستخدام الجسيمات النانوية البوليمرية القابلة للتحلل الحيوي في نقل الجينات في أنها قد تكون أكثر أماناً وفعالية من طرق نقل الجينات الأخرى.

تتمثل الميزة الأساسية لتحليل تتبع الجسيمات النانوية مقارنة بالطرق الحالية مثل تشتت الضوء الديناميكي في أن تحليل تتبع الجسيمات النانوية يعطي مباشرة التوزيع المتوسط العددي وتركيز الجسيمات. ومن شأن هذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال توصيل الجينات غير الفيروسي، مثل عدد البلازميدات لكل جسيم، وهو أمر مهم لدراسات التعبير المشترك. يتم توضيح البروتوكول التالي باستخدام الخلايا البطانية الشبكية البشرية أو hre كخلايا نموذجية، وبولي بيتا أمينو إسترز أو PBA AEs كبوليمرات نموذجية.

لاحظ أنه قد يلزم ضبط ظروف الزرع والمذيبات بناءً على الخلايا والبوليمرات المستخدمة قبل 24 ساعة من عملية عفن الخلية (Transfection). استخدم ماصة متعددة القنوات لزرع الخلايا في أطباق ذات 96 بئرًا ذات قاع مسطح ومعالجة لزراعة الأنسجة وبشفافة، بتركيز يتراوح من 25 إلى 50 خلية لكل µL.

سيؤدي ذلك إلى تحقيق كفاءة نقل تتراوح بين 70 إلى 80% في يوم عملية عفن الخلايا (transfection)؛ قم بتحضير وتسمية أطباق ذات 96 بئراً شفافة وغير معالجة لزراعة الأنسجة لتكون بمثابة أطباق رئيسية لتحضير وتخفيف PBA وDNA. سيتم تحضير طبقين متطابقين.

واحد لتقييم السُمية والآخر لتقييم كفاءة عفن الخلايا (transfection). اتبع المحاليل المخزونة من بوليمر poly beta amino ester أو PVAE و P-E-G-F-P-N 1D NA في درجة حرارة الغرفة. بمجرد التجانس، استخدم ماصة ذات 12 قناة لتحضير بئر يحتوي على 50 µL من DNA بتركيز 0.06 mg/mL في محلول منظم من خلات الصوديوم بتركيز 25 mM لكل حالة.

بعد ذلك، وفي نفس الطبق، قم بتخفيف بوليمرات PBAE لتصل إلى تركيز 10 milligrams per milliliter في محلول منظم من أسيتات الصوديوم. ثم قم بتخفيف بوليمرات PBAE بشكل أكبر بنسب وزن البوليمر إلى وزن DNA تبلغ 30 و60 في 50 microliters من محلول منظم من أسيتات الصوديوم. ولتكوين الجسيمات النانوية، استخدم ماصة ذات 12 قناة لدمج 50 microliters من PBA المخفف مع 50 microliters من plasma DNA المخفف، مع الخلط بقوة عن طريق السحب والدفع بالماصة.

بعد ذلك، اترك الخليط يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح بالتجميع الذاتي. وعقب عملية التجميع الذاتي، استخدم ماصة ذات 12 قناة لإضافة 20 µL من محلول الجسيمات النانوية قطرة تلو الأخرى في كل بئر من آبار الخلايا المستزرعة التي تحتوي على الوسط الغذائي؛ مع ترانسفكشن أربعة آبار لكل حالة كما هو موضح في هذا المخطط. وبالنسبة لكل طبق، خصص أربعة آبار على الأقل لكل من الضوابط السالبة والموجبة.

تتكون المجموعة الضابطة السالبة من خلايا غير معالجة، بينما تتكون المجموعات الضابطة الموجبة من خلايا تم ترانزفكشنها باستخدام كاشف متاح تجارياً مثل lipo 2000 أو Fuge hd. تُحضن الأطباق التي تحتوي على الخلايا المترانزفكشنة عند 37 °C لمدة أربع ساعات. بعد فترة التحضين، تُستخدم ماصة 12 قناة لإزالة الوسط من الخلايا واستبداله بـ 100 µL من وسط hre الطازج لكل بئر. تُحضن الخلايا لمدة إضافية تتراوح من 24 إلى 48 ساعة.

في اليوم التالي، أخرج طبقاً واحداً من الحاضنة. قم بتقييم ترانسفكشن الخلايا والسمية باستخدام المجهر الفلوري، وقم بقياس سمية الخلايا باستخدام مقايسة cell titer 96 aqueous one كما هو موضح في النص المصاحب. بعد مرور 48 ساعة، أخرج الطبق الآخر من الحاضنة.

قم بتقييم كفاءة عفن الخلايا (transfection) عن طريق الفلورة، والمجهر، وقياس التدفق الخلوي كما هو موضح في النص المصاحب. استخدم بيانات السمية وكفاءة عفن الخلايا المكتسبة هنا لتحديد التركيزات المثلى من PBAs لاستخدامها في التجارب المستقبلية. إن nano site NS 500 هو جهاز لتحليل تتبع الجسيمات النانوية يمكنه تقديم معلومات عن توزيع حجم عينة الجسيمات النانوية من خلال تتبع انتشار الجسيمات النانوية الفردية؛ قبل الاستخدام، قم بتهيئة النظام المائعي لجهاز nano site في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 milliliter.

قم بتحضير PBA وDNA البلازما للتحليل كما سبق وبنفس التركيزات المستخدمة في القسم السابق من هذا الفيديو. بعد التجميع الذاتي، خفف محلول الجسيمات النانوية بمقدار 100 ضعف في PBS في أنبوب جديد سعة 1.5 milliliter للحصول على حجم نهائي لا يقل عن 500 microliters. سينتج عن ذلك تركيز للجسيمات النانوية في النطاق المناسب لتحليل تتبع الجسيمات النانوية.

بعد ذلك، قم بتحميل العينة في الموقع النانوي. تأكد من عدم إدخال فقاعات هواء، وتحقق بصرياً من وجود ما بين 20 إلى 100 جسيم على الشاشة. ويعد العدد المثالي لتتبع الجسيمات النانوية حوالي 50 جسيماً.

إذا كان عدد الجسيمات كبيراً جداً أو قليلاً جداً، قم بغسل جهاز NS 500، واضبط التخفيف في محلول PBS ثم أعد تحميل العينة. وإذا كان عدد الجسيمات الظاهرة على الشاشة يتراوح بين 20 إلى 100، ابدأ بتسجيل مقاطع الفيديو. وبمجرد التقاط مقاطع الفيديو، انتقل إلى مرحلة المعالجة عن طريق فتح ملف الفيديو في البرنامج نفسه.

بعد فتح الملف، قم بزيادة كسب الشاشة. اختر الضبط التلقائي لمعلمات الصورة من خلال النقر على المربعات المناسبة. إذا تعرف البرنامج على جسيم في الشاشة، فسيتم تمييزه بعلامة x حمراء.

بمجرد تحديد جميع الجسيمات، انقر فوق زر المعالجة (process) في البرنامج لمعالجة ملف الفيديو. بعد ذلك، سيتم عرض حجم الجسيمات، ومتوسطات توزيع الحجم، وتركيز الجسيمات للتحقق من دقة عدد الجسيمات. كرر هذا الإجراء باستخدام العينة نفسها بعد تخفيفها بمقدار 2x و4x.

تم نقل جسيمات E-G-F-P-P-B-A-E النانوية إلى خلايا Forex في محلول PBS كما هو موضح في هذا الفيديو. ولتقييم كفاءة عملية النقل بصرياً، تم إجراء التصوير بالمجهر الفلوري. تُظهر هذه الصور صور الفلورة والمجال المضيء والصور المدمجة للخلايا التي تم نقل الجسيمات إليها؛ وكما يظهر في الصورة المدمجة، فإن غالبية الخلايا تعبر عن EGFP وتحافظ على شكلها المورفولوجي الطبيعي.

لتحديد كفاءة عفن التحول (transfection efficiency)، تم إجراء تحليل التدفق الخلوي (flow cytometry) كما يظهر في هذا الشكل بعد تحديد البوابة على الجمهرة الحية. لم تحتوي الجمهرة غير المستأصلة على خلايا موجبة لـ EGFP. ومع ذلك، كانت 71.6% من الخلايا المعالجة موجبة لـ EGFP. بعد ذلك، تم استخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (Nanoparticle tracking analysis) لتحديد توزيع حجم الجسيمات النانوية وتركيزها.

من المهم لهذا التحليل أن يكون توزيع حجم الجسيمات أحادي التشتت. وباستخدام هذه المعلومات، يمكن حساب متوسط عدد البلازميدات لكل جسيم عن طريق قسمة تركيز البلازميدات في المحلول على تركيز الجسيمات الذي تم تحديده بواسطة جهاز NS 500. ويعد عدد البلازميدات لكل جسيم توزيعاً يعكس توزيع حجم الجسيمات.

ستحتوي العينة على جسيمات أكبر تكون فيها قيمة البلازميدات لكل جسيم أعلى من المتوسط، بالإضافة إلى جسيمات أصغر تكون فيها قيمة البلازميدات لكل جسيم أقل من المتوسط. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم ترك البوليمرات القابلة للتحلل في المذيب المائي لفترة طويلة جداً قبل إضافة الجسيمات النانوية إلى الخلايا؛ ولتحديد الحجم باستخدام ncy، يجب ضبط التخفيف بشكل مناسب. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية ترنسفكشن أنواع الخلايا الملتصقة باستخدام بوليمرات توصيل الجينات غير الفيروسية، بالإضافة إلى كيفية قياس كفاءة الترنسفكشن وتوزيع حجم الجسيمات.

لا تنسَ أن العمل مع الخلايا البشرية ينطوي على مخاطر بيولوجية. يجب دائماً ارتداء معدات الوقاية الشخصية والعمل داخل كبينة السلامة البيولوجية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.