تقييم توصيل الجينات البوليمرية الجسيمات النانوية من تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر وعالية الإنتاجية قياس التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء وتقييم تجارب توصيل الجينات باستخدام جسيمات نانوية بوليمرية غير فيروسية. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل الخلايا أولا بجزيئات توصيل الجينات. ثم يتم تقييم كفاءة التعدي عن طريق الفحص المجهري وتحليل قياس التدفق الخلوي عالي الإنتاجية.

بعد ذلك ، يتم تحديد تركيز توزيع حجم الجسيمات النانوية والبلازميدات لكل جسيم باستخدام أداة تحليل تتبع الجسيمات النانوية. في النهاية ، تسمح هذه الطريقة بتوصيف حجم الجسيمات النانوية ، وفعالية التعدي باستخدام الجسيمات النانوية. الميزة الرئيسية لاستخدام الجسيمات النانوية البوليمرية القابلة للتحلل الحيوي لتوصيل الجينات هي أنها يمكن أن تكون أكثر أمانا وفعالية من طرق نقل الجينات الأخرى.

الميزة الأساسية لتحليل تتبع الجسيمات النانوية على الطرق الحالية مثل تشتت الضوء الديناميكي هي أن تحليل تتبع الجسيمات النانوية يعطي مباشرة متوسط توزيع الرقم وتركيز الجسيمات. ستساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال توصيل الجينات غير الفيروسية ، مثل عدد البلازميدات لكل جسيم ، وهو أمر مهم لدراسات التعبير المشترك. يتم توضيح البروتوكول التالي باستخدام الخلايا البطانية للشبكية البشرية أو hre كخلايا نموذجية وإسترات أمينية بولي بيتا أو PBA AEs كبوليمرات نموذجية.

لاحظ أن ظروف الثقافة والمذيبات قد تحتاج إلى تعديل اعتمادا على الخلايا والبوليمرات المستخدمة قبل 24 ساعة. تعداد. استخدم ماصة متعددة القنوات لزرع الأنسجة في مزرعة أنسجة شفافة معالجة بشكل مسطح. أسفل 96 لوحة بئر بتركيز 25 إلى 50 خلية لكل ميكرولتر.

سيعطي هذا 70 إلى 80٪ طلاقة مشتركة في يوم التعدي ، وإعداد وتسمية ثقافة غير الأنسجة الشفافة المعالجة. 96 لوحة بئر لتكون بمثابة لوحات رئيسية لإعداد وتخفيف PBA و DNA. سيتم تحضير لوحين متطابقين.

واحد لتقييم السمية والآخر لتقييم كفاءة التعدي. اتبع محاليل مخزون بولي بيتا الأمينية أو بوليمر PVAE ومحاليل مخزون P-E-G-F-P-N 1D NA في درجة حرارة الغرفة. بمجرد تقطيعها ، استخدم ماصة 12 قناة لتحضير بئر يحتوي على 50 ميكرولتر من 0.06 ملليغرام لكل مليلتر من الحمض النووي في مخزن أسيتات الصوديوم 25 ملليمولار لكل حالة.

بعد ذلك على نفس اللوحة ، قم بتخفيف بوليمرات PBAE إلى 10 ملليغرام لكل مليلتر في المخزن المؤقت لأسيتات الصوديوم. ثم قم بتخفيف بوليمرات PBAE إلى نسب وزن البوليمر إلى وزن الحمض النووي 30 و 60 و 50 ميكرولتر من عازلة أسيتات الصوديوم. لتكوين الجسيمات النانوية، استخدم ماصة ذات 12 قناة لدمج 50 ميكرولترا من PBA المخفف مع 50 ميكرولترا من الحمض النووي للبلازما المخفف الممزوج بقوة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

ثم اترك الخليط يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح بالتجميع الذاتي. بعد التجميع الذاتي، استخدم ماصة ذات 12 قناة لإضافة 20 ميكرولترا من محلول الجسيمات النانوية بالتنقيط إلى كل بئر من الخلايا المصنفة التي تحتوي على أربعة آبار متوسطة لكل حالة كما هو موضح في هذا الرسم التخطيطي. لكل لوحة ، احتفظ بأربعة آبار على الأقل لكل عنصر من الضوابط السلبية والإيجابية.

يتكون التحكم السلبي من خلايا غير معالجة وعناصر تحكم إيجابية ، وتتكون من خلايا منقولة بكاشف متاح تجاريا مثل lipo 2000 أو Fuge hd. احتضان الصفائح بالخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات بعد الحضانة ، استخدم الماصة ذات 12 قناة لإزالة الوسط من الخلايا واستبداله ب 100 ميكرولتر لكل بئر من المرنب الطازج. احتضان متوسط لمدة 24 إلى 48 ساعة إضافية.

في اليوم التالي ، قم بإزالة طبق واحد من الحاضنة. قم بتقييم تعداء الخلية وسميتها عن طريق الفحص المجهري الفلوري ، وتحديد سمية الخلية باستخدام معيار الخلية 96 مائي واحد كما هو موضح في النص المصاحب. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة اللوحة الأخرى من الحاضنة.

تقييم كفاءة التعدي عن طريق التألق والفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي كما هو موضح في النص المصاحب. استخدم بيانات السمية والتعداء التي تم الحصول عليها هنا لتحديد التركيزات المثلى من PBAs لاستخدامها في التجارب المستقبلية. موقع النانو NS 500 هو أداة تحليل تتبع الجسيمات النانوية التي يمكن أن توفر معلومات عن توزيع حجم عينة الجسيمات النانوية عن طريق تتبع انتشار الجسيمات النانوية الفردية قبل استخدام النظام السائل لموقع النانو في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 ملليلتر.

قم بإعداد PBA والحمض النووي للبلازما للتحليل كما كان من قبل بنفس التركيزات المستخدمة في القسم السابق من هذا الفيديو. بعد التجميع الذاتي ، قم بتخفيف محلول الجسيمات النانوية 100 ضعفا في PBS في أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر للحصول على حجم نهائي لا يقل عن 500 ميكرولتر. سينتج عن ذلك تركيز جسيمات نانوية في النطاق المناسب لتحليل تتبع الجسيمات النانوية.

بعد ذلك ، قم بتحميل العينة في موقع النانو. تأكد من عدم إدخال فقاعات الهواء التي تم فحصها بصريا للتأكد من وجود ما بين 20 إلى 100 جسيم على الشاشة. الرقم المثالي لتتبع الجسيمات النانوية هو حوالي 50 جسيما.

إذا كان هناك عدد كبير جدا أو قليل جدا ، فقم بمسح NS 500 ، واضبط التخفيف في PBS وأعد تحميل العينة. إذا كان عدد الجسيمات على الشاشة يتراوح بين 20 إلى 100 مقطع فيديو. بمجرد التقاط مقاطع الفيديو ، انتقل إلى مرحلة المعالجة عن طريق فتح ملف فيديو في نفس البرنامج.

ثم بمجرد فتح الملف ، قم بزيادة كسب الشاشة. حدد الضبط التلقائي لمعلمات الصورة بالنقر فوق المربعات المناسبة. إذا تم التعرف على جسيم على الشاشة بواسطة البرنامج ، تمييزه بصليب أحمر.

بمجرد وضع علامة على جميع الجسيمات ، انقر فوق زر العملية في البرنامج لمعالجة ملف الفيديو. سيتم بعد ذلك عرض حجم الجسيمات ومتوسطات حجم التوزيع وتركيز الجسيمات للتحقق من دقة عدد الجسيمات. كرر هذا الإجراء باستخدام نفس العينة المخففة بمقدار اثنين x و أربعة.

تم تحويل الفوركس في PBS apre مع الجسيمات النانوية E-G-F-P-P-B-A-E كما هو موضح في هذا الفيديو. لتقييم كفاءة التعدي بصريا ، تم إجراء تصوير مجهري فلوري. تظهر هذه الصور المجال الساطع الفلوري والصور المدمجة للخلايا المنقولة كما هو موضح في الصورة المدمجة ، وتعبر غالبية الخلايا عن EGFP وتحافظ على التشكل الطبيعي.

لتحديد كفاءة التعدي ، تم إجراء قياس التدفق الخلوي كما يتضح من هذا الشكل بعد البوابات على السكان الحيين. لم تحتوي السكان غير المقطوعين على خلايا إيجابية EGFP. ومع ذلك ، فإن 71.6٪ من الخلايا المعالجة كانت إيجابية لموقع EGFP النانوي ، ثم تم استخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد توزيع حجم الجسيمات النانوية وتركيزها.

في هذا التحليل ، من المهم أن يكون توزيع حجم الجسيمات أحادي التشتت. باستخدام هذه المعلومات ، يمكن حساب متوسط عدد البلازميدات لكل جسيم بقسمة تركيز البلازميدات في المحلول على تركيز الجسيمات الذي يحدده NS 500. عدد البلازميدات لكل جسيم هو توزيع يعكس توزيع حجم الجسيمات.

داخل العينة ، ستكون هناك جزيئات أكبر مع البلازميدات لكل قيمة جسيم أكبر من المتوسط ، بالإضافة إلى جزيئات أصغر ذات قيمة بلازميدات أقل لكل جسيم من المتوسط. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم السماح للبوليمرات القابلة للتحلل بالبقاء في مذيب مائي لفترة طويلة قبل إضافة الجسيمات النانوية إلى الخلايا لاستخدام ncy ، وضبط التخفيف المناسب للتحجيم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نقل أنواع خلايا الالتصاق باستخدام بوليمرات توصيل الجينات غير الفيروسية ، بالإضافة إلى قياس فعالية التعدي ، بالإضافة إلى توزيع حجم الجسيمات.

لا تنس أن العمل مع الخلايا البشرية أمر خطير بيولوجيا. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية واعمل في خزانة السلامة الحيوية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.