باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR لتحديد الجهات المانحة Engraftment خلية في التنافسية نموذج الفئران زرع نخاع العظم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنفيذ تقنية تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لقياس كمية تطعيم الخلايا المانحة في نموذج تنافسي لزراعة نخاع العظم في الفئران، ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إجراء زراعة لنخاع العظم في فئران مستقبلة إناث باستخدام خلايا مانحة من ذكور. بعد ذلك، يتم جمع الدم المحيطي من الفئران المستقبلة في نقاط زمنية مختلفة وعزل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (gDNA) الجينومي. ثم يتم تحضير العينات لإنشاء منحنى قياسي.

وأخيرًا، يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) باستخدام عينات قياسية وعينات اختبار. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح تطعيم الخلايا المشتقة من المانح الذكر في الفئران المستقبلة الأنثى، وذلك من خلال الحساب مقابل منحنى قياسي بنسبة معروفة من الحمض النووي الذكري مقابل الأنثوي. وتكمن ميزة هذه التقنية على الطرق الحالية، مثل الطريقة القائمة على قياس التدفق الخلوي، في أنها أكثر حساسية وأكثر اقتصادية، كما يمكن تخزين العينات لفترة طويلة.

والأهم من ذلك أن تقنيتنا مستقلة تماماً عن السلالة ويمكن استخدامها مع أي خلفية جينية للفئران، مثل استخدام علامة سطح خلية محددة بدقة للتمييز بين الخلايا المانحة والخلايا المستقبلة. بعد قتل ذكور الفئران المانحة وإناث الفئران من سلالة FVB nj رحمةً تحت غطاء تدفق صفائحى، استخدم مقصاً صغيراً وملقطاً لاستئصال عظمتي الفخذ والقصبة ووضعهما في طبق زراعة أنسجة مقاس 60 مليمتر يحتوي على 6 ملليلتر من وسط RPMI 1640 البارد جداً مع 5% من مصل جنين البقر (FBS) المعطل حرارياً. استخدم منديل Kim wipe لإزالة العضلات والأنسجة الأخرى، ثم اقطع كلا طرفي ساق كل عظمة داخل الطبق. بعد ذلك، قم بتوصيل طرف العظام بإبرة مقاس 23 غيج متصلة بمحقنة سعة 3 سم مكعب مملوءة بوسط RPMI 1640 مع 5% من مصل جنين البقر (FBS) المعطل حرارياً، ثم قم بغسل النخاع لإخراجه.

استخدم الإبرة نفسها لتفكيك نسيج نخاع العظم عن طريق عمليات شفط متكررة. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter وقم بتدويره لمدة خمس دقائق عند 400 G. بعد إزالة الطافي، أعد تعليق الخلايا في 1 milliliter من منظم تحليل كريات الدم الحمراء في درجة حرارة الغرفة، واتركها لتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق قبل إضافة من 5 إلى 10 milliliters من وسط RPMI 1640 مع 5% FBS غير نشط حرارياً، ثم مرر الخلايا عبر مصفاة خلايا واجمع السائل المتدفق في أنبوب جديد. بعد تدوير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 400 G وإزالة الطافي، يجب أن تكون الراسبة خالية من اللون الأحمر، مما يشير إلى الإزالة الكاملة لكريات الدم الحمراء؛ أعد تعليقها في 10 milliliters من وسط RPMI 1640 مع 5% FBS غير نشط حرارياً، وبعد الرج الخفيف باستخدام جهاز الفورتيكس، أضف كمية صغيرة إلى مقياس كرات الدم (hemocytometer) وقم بعد الخلايا.

احسب حجم الخلايا المطلوب خلطها مع الخلايا الأنثوية المنافسة بنسبة خمسة إلى اثنين لعملية زراعة نخاع العظام. كخطوة نهائية لتحضير الخلايا للحقن، اخلط خلايا المتبرع والخلايا المنافسة ثم قم بترسيب الخلايا وغسلها بـ PBS وإعادة تعليقها في PBS بتركيز نهائي قدره 5 × 10⁶ لكل ملليلتر من خلايا المتبرع و 2 × 10⁶ لكل ملليلتر من الخلايا المنافسة، وذلك قبل 4 إلى 6 ساعات من عملية زراعة نخاع العظام. قم بتعريض الفئران الأنثى المستقبلة للإشعاع باستخدام أشعة غاما من السيزيوم 137 بجرعة واحدة قدرها 11 grays.

ضع الفئران الإناث التي تعرضت للإشعاع في مثبت للفئران، ثم احقن الخليط من الخلايا المانحة والمنافسة عبر وريد الذيل في حجم إجمالي قدره 0.1 milliliter، بحيث تتلقى كل فأرة 5×10⁵ من الخلايا المانحة و2×10⁵ من خلايا نخاع العظم المنافسة لسحب عينات الدم. بعد التخدير، اجمع حوالي 50 µL من الدم في أنابيب مطلية بـ EDTA عن طريق النزف خلف المدار. اجمع أيضاً عينات من فئران ذكور وإناث متطابقة في العمر.

بعد ذلك، يتم عزل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي (genomic DNA) من الفئران الخاضعة للدراسة والفئران الأخرى. ولإعداد المنحنى القياسي، أضف حوالي 200 µL من محلول تحلل كرات الدم الحمراء (RBC lysis buffer) بدرجة حرارة الغرفة إلى كل عينة دم، واتركها لمدة خمس دقائق. ثم أضف 1 mL من محلول PBS وقم بالطرد المركزي للتخلص من معظم كرات الدم الحمراء المتحللة.

بعد ذلك، استخدم طقم استخلاص الحمض النووي DNA من الدم لعزل الـ DNA مع تسخين محلول الاستخلاص مسبقاً إلى 37 °C. ولتعزيز الإنتاجية، قم بقياس تركيز الـ DNA لكل عينة. وتُستخدم العينات التي تتراوح فيها نسبة OD 260/280 بين 1.8 و 2.0 للتحليلات اللاحقة.

لإعداد منحنى قياسي، يتم تخفيف الحمض النووي DNA للذكر والأنثى إلى تركيز 4 ng/µL وإعداد خليط الـ DNA وفقاً لهذه الإرشادات. يتم تجهيز لوحة تفاعل PCR عن طريق خلط كاشف cyber green super mix مع البادئات الموضحة هنا والـ DNA الجينومي. يحتوي كل تفاعل بحجم 20 µL على 400 nM من كل بادئ وخمسة µL من الـ DNA الجينومي لخلايا الدم، ويتم إجراء التفاعل في ثلاث مكررات.

قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وفقًا للشروط المذكورة في البروتوكول النصي واستخرج قيم عتبة الدورة أو قيم CT. احسب delta CT مضروبة في الكمية CT مرفوعة للقوة ZY 1 ناقص CT مرفوعة للقوة BCL 2 ومستويات تعبير ZY 1 أو 2 مرفوعة للقوة ناقص delta CT؛ قم بإنشاء منحنيات قياسية عن طريق رسم متوسط قيم 2 مرفوعة للقوة delta CT المكررة ثلاث مرات مقابل النسبة المئوية المعروفة للحمض النووي الذكري (male DNA) في الخليط مع إظهار ملاءمة الانحدار الخطي. إليك أمثلة لمنحنيات قياسية رُسمت باستخدام القيم المتوسطة لـ 2 مرفوعة للقوة delta CT مقابل النسب المئوية للحمض النووي الذكري.

يتضمن هذا المخطط درجة حرارة انصهار محددة لمنتجات تضخيم BCL two وZFY one، والتي تقع عند 78.5 و88.5 درجة Celsius على التوالي. يُستخدم BCL two كجين مرجعي لتقييس الكمية الإجمالية من الـ DNA المضافة في كل تفاعل PCR. وتندمج منحنيات تضخيم BCL two لكل عينة قياسية مع بعضها البعض بغض النظر عن تركيز الـ DNA الذكري، مما يشير إلى تساوي كميات الـ DNA المضافة.

ومع ذلك، انتقلت منحنيات تضخيم ZFY إلى اليسار مع زيادة كميات الحمض النووي الذكري في العينات. تعاني الخلايا الجذعية المكونة للدم في الفئران من طراز PIM TKO من عيوب في إعادة تشكيل الفئران التي تعرضت لإشعاع قاتل، وكما هو متوقع، أظهرت الفئران المستقبلة التي زُرعت بخلايا PIM TKO نسبة مئوية أقل بكثير من الخلايا الذكرية مقارنة بالفئران التي زُرعت بخلايا من النوع البري. وللتحقق من صحة طريقتنا، اختبرنا تطعيم الخلايا المانحة الذكرية في إناث الفئران المزروعة، والتي تلقت خلايا نخاع العظم من النوع البري مقابل فئران PIM triple knockout أو TKO في نقاط زمنية مختلفة بعد الزرع؛ حيث تم تحليل كل من الدم المحيطي عند ستة أسابيع وعينات نخاع العظم عند 16 أسبوعاً بعد مشاهدة هذا الفيديو.

يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام طريقة تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتقدير كمية تطعيم الخلايا المانحة في نموذج تنافسي لزراعة نخاع العظم البحري.