إعداد كروموسوم من الخلايا المستزرعة

الهدف العام من هذا الإجراء هو حصاد وإعداد الكروموسومات لنطاقات GB واختبارات الوراثة الخلوية الجزيئية. أولا ، زراعة الخلايا في المرحلة اللوغاريتمية. ثم حصاد الكروموسومات مع smid ، ناقص التوتر والمثبت.

قم بإسقاط تعليق الخلية في الشرائح. وصمة عار شريحة واحدة. كمراقب لإعداد الكروموسومات ، انتقل إلى GB banding أو التقنيات الجزيئية للشرائح المتبقية.

كخطوة أخيرة في نطاقات GB ، قم بتحليل الكروموسومات عن طريق الفحص المجهري الضوئي والتنميط النووي. في النهاية ، ستكون الكروموسومات والنوى متاحة للتنميط النووي أو الصيد. خطرت لي فكرة نشر هذه الطريقة لأول مرة بسبب الطلب المرتفع من الباحثين الآخرين الذين يطلبون المساعدة في الكشف عن عدم استقرار الكروموسومات في أنواع مختلفة من الخلايا من كائنات حية مختلفة ولاختبار الوراثة الخلوية الجزيئية اللاحقة.

هذه التقنية ضرورية في تشخيص العديد من الاضطرابات الوراثية الخلقية بما في ذلك السرطان وتشخيصها في نهاية المطاف ، لأنها تسمح بتصور إعادة ترتيب الكروموسومات ، والتي تكون تشخيصية. لهذه الاضطرابات, على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لإعادة ترتيب الكروموسوم الموجودة في أنواع مختلفة من الخلايا البشرية. يمكن أيضا تطبيقه على خلايا من كائنات أخرى مثل Resus Maca و Ratus و Culture

2 مليون خلية ملتصقة إلى 80٪ con الطلاقة وإضافة 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام لكل مليلتر. كولون لكل مليلتر من الخلايا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 لمدة 45 دقيقة.

ثم باستخدام ماصة معقمة ، انقل الوسائط من الثقافة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر واحتفظ بها لوقت لاحق لغسل الخلايا ، أضف ملليلترين من HBSS في القارورة ، وقم بتحريكها وإزالة المخزن المؤقت. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من التربسين ، مع التأكد من أنه يغطي سطح القارورة بالكامل. بمجرد انفصال غالبية الخلايا ، أعد الماصة في الأنبوب المخروطي إلى الخلايا.

Aliquot 10 ملليلتر من تعليق الخلية في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 200 جرام لمدة 10 دقائق. قم بإزالة supernat.

أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من 75 ملليضرس كلوريد البوتاسيوم, والتي سيتم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية بعد 10 دقائق حضانة من 37 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي عند 200 جي لمدة خمس دقائق. عند 25 درجة مئوية ، قم بإزالة كل المادة الطافية باستثناء 0.5 مل وأعد تعليق الحبيبات بعناية.

أضف خمسة ملليلتر من مثبت ضوضاء السيارة الطازج إلى الخلايا. ثم أضف خمسة ملليلتر ، والمزيد من أجهزة الطرد المركزي المثبتة والدوامة عند 200 جي لمدة خمس دقائق. Resus ، قم بتعليق كل بيليه خلية في خمسة ملليلتر من التثبيت.

قم بتخزين الخلايا على أربع درجات لمدة تصل إلى عام واحد. الطرد المركزي للخلايا عند 200 Gs لمدة خمس دقائق. عند 25 درجة مئوية.

قم بإزالة sup natant حتى يبقى فقط 0.3 إلى 0.5 مل بعد إعادة التشكيل برفق لتعليق الحبيبات. ماصة ثلاث قطرات من تعليق الخلية من مسافة حوالي بوصتين على شريحة مائلة بزاوية حوالي 45 درجة. واسمح للتعليق بالتدحرج عبر الشريحة.

أضف قطرة كبيرة من ضوضاء السيارة الجديدة ، مثبتة للشريحة. قم بقيادة الجزء الخلفي من الشريحة على منشفة ورقية ، ثم اجلس الشريحة للخارج حتى تجف تماما. قم بإعداد حل مستدام جديد للجيم.

ضع الشرائح على رف تلطيخ. قم بتغطية الشريحة بأكملها في محلول دعم gim. بعد خمس دقائق ، اشطف الشرائح بتصريف الماء المقطر واتركها تجف في الهواء.

أضف أربع قطرات من حامل التجعيد إلى الشريحة وضع زلة غطاء لضمان عدم وجود فقاعات تحت زلة الغطاء. قم بإزالة الفائض لكل حامل بمنشفة ورقية. قم بتحليل الخلايا بمجهر ضوئي تحت تكبير 10 × و 100 ×.

إذا كانت خلايا الطور الطوري وفيرة ومنتشرة بشكل جيد ، فيمكن استخدام الشرائح المتبقية في إجراءات تجريبية أخرى. أضف 50 مل من محاليل العلاج إلى أربعة برطمانات كوبلاند. اغمر كل شريحة في البرطمان رقم واحد لمدة خمس ثوان بعد ذلك.

شطف الشريحة بسرعة في الجرة رقم اثنين. اتركه في البرطمان رقم ثلاثة لمدة 30 ثانية على الأقل. اشطفها في البرطمان رقم أربعة ، ثم اترك الشرائح حتى تجف.

قم بإعداد حل مستدام جديد ل GIM. ضع الشرائح على رف تلطيخ. قم بتغطية الشريحة بأكملها في محلول الحفاظ على gim لمدة خمس دقائق.

شطف الشرائح والماء المقطر بنفس الترتيب الذي كانت ملطخة به. ثم يجف لمدة 10 دقائق على الأقل. ضع زلة غطاء باستخدام حامل التجعيد كما هو موضح سابقا.

ثم قم بتحليل الخلايا تحت المجهر الضوئي للشرائح المتبقية. اضبط وقت حضانة tripsin. بناء على نتائج الشريحة الأولى.

عن الفحص الناجح كروموسومات منتشرة جيدا وذات مورفولوجيا كروموسومات مناسبة. صحيح. تحتوي الكروموسومات ذات النطاقات GB على أنماط النطاقات الفاتحة والداكنة المميزة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حصاد الكروموسومات لنطاقات GB والمزيد من الاختبارات الجزيئية الخلوية في توضيح عدم استقرار الكروموسومات.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية الحصاد هذه في حوالي ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بالنسبة لإجراء نطاقات GB ، من المهم اختبار وقت حضانة tripsin في البداية على شريحة واحدة قبل المتابعة إلى نطاق GB. بقية الشرائح.