مقدمة إلى صلب غشاء المعتمدة واستنادا الكهربية

تعتبر تقنية الفسيولوجيا الكهربائية القائمة على الأغشية المدعومة، والمختصرة بـ SSM-based electrophysiology، نهجاً فسيولوجياً كهربائياً جديداً، حيث توفر تحسناً ملحوظاً في عدد من التطبيقات مقارنة بالطرق التقليدية.

تتمثل الأداة الرئيسية في الفيزيولوجيا الكهربائية التقليدية في القطب الكهربائي الدقيق المملوء بالإلكتروليت، بينما تعتمد الفيزيولوجيا الكهربائية القائمة على M على اكتشاف انتقال الشحنات عبر قطب كهربائي ذو غشاء مدعوم بمادة صلبة. وتعد هذه الطريقة مفيدة للغاية في الحالات التي لا يمكن فيها استخدام الفيزيولوجيا الكهربائية التقليدية، كما هو الحال مع ناقلات البكتيريا، والتي لا يمكن استقصاؤها -باستثناء حالات نادرة قليلة- باستخدام طرق تثبيت الجهد أو تقنية الرقعة (patch clamp). وفي مثل هذه الحالات، أثبتت الفيزيولوجيا الكهربائية القائمة على SSM نجاحاً كبيراً.

ويمكن استخدامه أيضاً لدراسة الناقلات حقيقية النواة ذات الصلة فسيولوجياً في الأغشية داخل الخلوية. وهناك طرق عديدة لإجراء تجارب الفيزيولوجيا الكهربائية القائمة على طريقة SSM. وفي الأبحاث الأساسية، يمكن تطبيقه لتحديد المعاملات الحركية وتوضيح آلية النقل، كما أن متانته وقدرته على الأتمتة تجعله مثالياً لتطبيقات الفحص في اكتشاف المسارات.

يحتوي قطب SSM على نظام غشائي مركب يتكون من غشاء SSM الأساسي والبروتيازومات المعتمدة أو شظايا غشائية تحتوي على بروتين النقل المستهدف. يمكن وصف الخصائص الكهربائية للغشاء المركب بواسطة دائرة مكافئة تشكل فيها الأغشية نظاماً مقترناً سعوياً. يرجى ملاحظة أن السلوك الكهربائي للنظام هو نفسه أساساً سواء تم استخدام شظايا غشائية أو ليبوزومات بروتينية.

تنتقل إزاحة الشحنة في بروتين النقل إلى دائرة القياس عبر سعة غشاء المثانة، وهو مبدأ كشف يُسمى الاقتران السعوي. في تجربة نموذجية، يوفر التبادل السريع للمحلول عند VSSM الركيزة لبروتين النقل V، مما يؤدي إلى نشاط نقل كهربائي للبروتين يولد تياراً يتم اقترانه بنظام القياس عبر سعة SSM.

وفي الوقت ذاته، يؤدي نشاط البروتين المولد للكهرباء إلى شحن الغشاء الليبوزومي تدريجياً، مما يؤدي إلى تثبيط البروتين الناقل وانخفاض التيار في دائرة التسجيل؛ حيث يكون التيار المقاس نتيجة لتفاعلات نقل متزامنة لملايين الليبوزومات البروتينية الممتصة على الـ Enzo، والتي يحتوي كل منها على حوالي 100 ناقل. يتكون الإعداد من قفص فاراداي يحتوي على مسار للمحلول، ودوائر خارجية للتحكم في الصمامات، وتضخيم الإشارة، بالإضافة إلى نظام الحصول على البيانات وتحليلها.

تتضمن قفص EC حاويات وصمامات وأنابيب مطلوبة للتحكم في تدفق المحلول، بالإضافة إلى مكعب يحتوي على شريحة XOR. تحمل شريحة XOR قطب SSM والليبوزومات البروتينية الممتصة. يتصل vete بمضخم ومولد الدوال للدائرة الكهربائية الخارجية.

قياسات SSM، تسبب حريقاً، محلولان، أحدهما منشط والآخر غير منشط باستثناء المادة الركيزة، والتي توجد فقط في المحلول المنشط. يمتلك كلا المحلولين التركيب نفسه في تكوين التبادل الفردي. ويتحكم صمامان ثنائيان في تدفق المحاليل غير المنشطة والمنشطة.

يُستخدم الصمام النهائي، وهو صمام ثلاثي المسارات مقترن ميكانيكياً ثلاث مرات، للتبديل بين المحاليل غير المنشطة والمحاليل المنشطة، حيث يتم توجيه أحد المحاليل إلى حاوية النفايات والمحلول الآخر إلى qve. وعند تبديل الصمام النهائي، يتم تحويل تدفق المحلول غير المنشط إلى النفايات ويتدفق المحلول المنشط إلى qve. ويسمح هذا التكوين بتدفق مستمر ومتزامن لكلا المحلولين.

يمكن تحسين مسار التدفق في أي وقت خلال بروتوكول التدفق وفقاً للحاجة. ومع ذلك، يجب مراعاة الحفاظ على أقصر مسافة ممكنة بين SSM ونقطة التقاء المحاليل المنشطة وغير المنشطة، حيث إن هذه المسافة هي التي تحدد الزمن اللازم لعملية تبادل المحاليل.

يتم توصيل مضخم التيار الموجود خارج قفص منصة الطاقة بشريحة استشعار. وعادةً ما يُضبط التضخيم على قيمة تتراوح من 10⁸ إلى 10⁹ فولت لكل أمبير، وزمن راحة يتراوح من 1 إلى 10 ميلي ثانية. كما يتم توصيل مولد دالات بالقطب المرجعي، ويكتمل النظام بجهاز كمبيوتر مزود ببرمجيات للتحكم في الصمامات واستحواذ البيانات، وصندوق واجهة.

يحتوي صندوق الواجهة على نظام الحصول على بيانات مشغلات الصمامات، ويتم الحفاظ على تدفق الحل الرقمي عبر مخرجات الأجهزة بواسطة هواء مضغوط بضغط 0.22 bar. يتم مراقبة ضغط 1 bar باستخدام مقياس مليمتر رقمي، ويمكن الحفاظ عليه عن طريق ملء حاوية فولاذية مثبتة بين مصدر إمداد الهواء وحاويات المحلول في قفص EC عبر صمام إبري.

تتكون خلية CVIC من أربعة أجزاء. تقع شريحة zen محصورة بين القاعدة vet والرأس vet. ويتم ربط موصل مخرج أسطواني بالرأس vet، حيث يحمل مجموعة القطب المرجعي.

يتكون القطب المرجعي من سلك فضة مكلور مزود بموصل SMC صغير، وهو معزول عن مسار التدفق بواسطة جسر ملحي من هلام البولي أكريليك. وعندما لا يكون قيد الاستخدام، يتم تخزين مجموعة جسر الهلام في محلول فوسفات البوتاسيوم بتركيز 100 millimolar وبدرجة pH سبعة، ويحتوي على كلوريد البوتاسيوم بتركيز 100 millimolar. أولاً، يجب تركيب القطب المرجعي في مجموعة القطب المرجعي التي تحتوي على جسر الهلام.

من المهم تجنب تكون فقاعات الهواء أثناء تركيب القطب المرجعي. الآن يتم توصيل هذا الجزء من الـ vete بموصل المخرج، والذي تم ملؤه مسبقاً بمحلول منظم. يجب إحكام غلق جميع التوصيلات باستخدام الحلقات الدائرية (O rings).

تم تشكيل هذا SM على شريحة zor، وهي عبارة عن ضوء زجاجي مطلي بالماعز ومنظم. يبلغ قطر هذا الطريق السيمانتيكي 1 millimeter وهو متصل بمنصة التلامس عبر شريط تلامس أبيض بعرض 0.2 millimeter. ويقوم دبوس تلامس نابضي بإنشاء اتصال بالمضخم.

يُحفظ شريحة zen في الظلام في محلول 10 LAR Okta Deccan thiol ethanol. وللحفاظ على طبقة arcane thi وإزالة جزيئات Okta deccan الفيروسية التي لم يتم امتصاصها، يتم شطف القطب بالإيثانول النقي ثم تجفيف القطب بغاز النيتروجين. الآن يمكن تجميع طبقة الفوسفوكولين الأحادية.

يحتوي المحلول الدهني على 15 mg/mL من DFI choline و 250 µg/mL من Okta two A mine in decay، ويُحفظ عند درجة حرارة -20 °C. يتم الآن وضع القطب الكهربائي بدقة على قاعدة SA cubit.

تُضاف 1 µL من المحلول إلى قطب SSM دون لمس الطبقة الذهبية. يمكن تجميع الـ vete فور إضافة محلول الدهون. يكون حجم الـ vete المحكم بواسطة حلقة دائرية (O ring) أسطوانياً بحجم داخلي يبلغ 17 µL عند التركيب.

يجب وضع نظام رصد العينة (SSM) في المنتصف تحت فتحة المدخل. وقبل توصيل الجهاز، يجب ملء النظام المائعي مسبقاً بمحلول منظم من فوسفات البوتاسيوم بتركيز 100 millimolar. ومن الضروري التأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الأنابيب والصمامات.

يمكن الآن تثبيت العينة في القفص اليومي للغدة الدرقية، وتوصيل المضخم، ومدخل ومخرج مسار تدفق المحلول، ومولد الدوال. وأخيراً، يمكن شطف العينة بـ 100 millimeter من محلول منظم فوسفات البوتاسيوم. يؤدي ذلك إلى تكوين SSM تلقائي للتحقق من جودة الـ SSM.

يتم قياس السعة والموصلية باستخدام مولد الدوال، حيث يُستخدم جهد تيار مستمر قدره 100 millivolt لقياس الموصلية. ويظهر اضمحلال التيار شحن مكثف الغشاء بعد شحن المكثف بالكامل. ويؤدي التيار المقاس إلى تحديد موصلية الغشاء باستخدام قانون M'S.

نلاحظ هنا موصلية تبلغ 0.17 nano Siemens. ويمكن قياس السعة باستخدام جهد متردد مثلثي بسعة ذروة إلى ذروة تبلغ 50 millivolt وتردد قدره 0.5 hertz. ويمثل سعة التيار الناتج في شكل موجة مربعة تيار التفريغ للمكثف.

تساوي السعة الكهربائية كمية الشحنة المنقولة مقسومة على الجهد الكهربائي المسلط. يُظهر هذا الغشاء سعة قدرها 2.3 nano، ويشير وجود موصلية عالية وسعة منخفضة إلى أن غشاء SSM لم يتشكل بشكل صحيح. في هذه الحالات، يجب التخلص من الغشاء وتحضير غشاء SSM آخر باستخدام شريحة قطب كهربائي جديدة.

عادةً ما يتم تخزين ليبوزومات البروتين مجمدة عند درجة حرارة -80 °C. يجب إذابة العينة على الثلج، ويعد استخدام جهاز السونيكاتور (الموجات فوق الصوتية) أمراً ضرورياً لأن العينة المتكتلة تمتص الموجات بشكل ضعيف، وذلك للحصول على معلق ليبوزومات بروتينية متجانس. يتم تطبيق ثلاث دورات سونيكاتور مدة كل منها 10 ثوانٍ، بالتناوب مع فترات تبريد على الثلج لمدة 10 ثوانٍ.

اشطف وحدة استشعار السطح (SSM) بمحلول غير منشط. بعد ذلك، قم بفك موصل المخرج مع عينة القطب المرجعي. وباستخدام ماصة، احقن 30 µL من عينة البروتين عبر مخرج vete إلى حجم ette.

قم أولاً بتركيب طرف الماصة في فتحة المخرج. ثم افتح الصمام اليدوي الموجود أعلاه في المسار غير النشط واحقن ليبوزومات البروتيا. قم بذلك قبل إزالة طرف الماصة.

أغلق الصمام اليدوي أعلاه لمنع استمرار تدفق المحلول. اترك الليبوسومات البروتينية لتمتص في غشاء SSM لفترة تحضين تتراوح من ساعة إلى ساعتين. استخدم نافذة بروتوكول التدفق (flow protocol Window) في برنامج التحكم في الصمامات وتحصيل البيانات لتحديد بروتوكول التدفق الخاص بك.

إذا كنت ترغب في القياس تحت ظروف متماثلة، كما في حالة تحديد خصوصية الركيزة، أو قيمة KM، أو الاعتماد على pH، فاختر بروتوكول تبادل المحلول المنفرد. اضبط مدة التدفق لكل محلول من 0.5 إلى ثانية واحدة. يتم تسجيل التيار طوال بروتوكول التدفق بالكامل.

عادةً ما يتم ضبط التكبير على 10 أس تسعة، وبالنسبة لمعدل العينات، نختار 2000 نقطة بيانات في الثانية. أخيرًا، احفظ البروتوكول الجديد تحت عنوان NA a و a. في علامة التبويب الثانية من نافذة بروتوكول التدفق، يمكنك تحديد الحالة المفتوحة أو المغلقة لصمامات محددة للتحكم في تدفق المحلول غير المنشط أو المنشط عبر qubit.

نوضح هنا كيفية قياس الليبوزومات البروتينية، استيراد بروتونات السكر مثل Y من E coli. يحتوي المحلول المنشط على مادة الركيزة المنقولة اللاكتوز، بينما يحتوي المحلول غير المنشط على نفس الكمية من الجلوكوز غير المنقول كمركب تعويضي. وبالإضافة إلى السكريات، تحتوي المحاليل على 100 millimolar من فوسفات البوتاسيوم عند pH 7.6 وone millimolar من DTT.

بعد تغيير المحاليل، استخدم الصمام اليدوي للتأكد من إزالة الفقاعات الهوائية. وقبل البدء في بروتوكول التدفق، اضبط الضغط قبيل البدء في القياس مباشرةً. نستخدم عادةً ضغطاً قدره 0.6 bar، والذي يعطي في تكوين الصمام والأنابيب الخاص بنا معدل تدفق يبلغ حوالي ملليلتر واحد في الثانية.

بعد ذلك، اختر بروتوكول تدفق آمن من هنا، وهو بروتوكول NAA، ثم اضغط على زر البدء لبدء كل قياس. خلال القياسات القليلة الأولى، تتم إزالة ليبوزومات البروتين الممتصة بشكل فضفاض، وبالتالي قد ينخفض تيار الذروة. كرر القياس حتى يظل تيار الذروة ثابتاً.

خلال المرحلة الأولى من تدفق المحلول غير المنشط، يكون التيار صفراً. ويؤدي الانتقال من المحلول غير المنشط إلى المحلول المنشط، الذي يحتوي على اللاكتوز، إلى تحفيز نشاط النقل الكهرجيني للغشاء. فتتراكم الشحنة الموجبة للبروتين داخل البروتوليبوزومات، ويكتشف المضخم تياراً عابراً موجباً نتيجة الاقتران الموجب عبر SSM.

يُطلق على هذا التيار المقترن إيجابيًا اسم إشارة التشغيل (on signal) الناتجة عن تبادل V من المحلول المنشط. وبالعودة إلى المحلول غير المنشط، يتم تحفيز النقل المشترك للبروتونات والسكريات خارج الليبوزومات. وفي هذه الحالة، يظهر تيار مقترن سلبيًا وهو ما يسمى إشارة الإيقاف (off signal) المستخدمة في تحليل حركية البروتين.

يُستخدم فقط إشارة التشغيل (on signal)، حيث إن إشارة الإيقاف (off signal) غير محددة بدقة بسبب حالة الشحن، كما أن تبديل الصمام الغشائي يؤدي إلى ظهور تداخلات ميكانيكية وكهربائية. ولحسن الحظ، تقتصر هذه التداخلات على نطاق زمني يسبق ظهور الإشارات التي يحفزها البروتين. يرجى ملاحظة أن التأخير الزمني البالغ 50 milliseconds بين تداخلات تبديل الصمام وإشارات الناقل هو الوقت الذي يحتاجه المحلول للانتقال من الصمام الطرفي إلى سطح نظام SSM Rapid Solution Exchange، ومثل هذه العملية التي تُجرى على SSM تمثل تجربة استرخاء نمطية.

في مثل هذه التجارب، يسترخي التيار عبر مرحلة ما قبل الحالة المستقرة المعتمدة على الزمن وصولاً إلى حالة مستقرة ثابتة. ويمكن اشتقاق التفاصيل الحركية الحالية لدورة التفاعل من شكل ومقدار تيار ما قبل الحالة المستقرة، بينما يوفر تيار الحالة المستقرة معلومات حول الدوران المستمر لبروتين الغشاء.

في النظام المقترن عبر الليبيد حيث تُمتص ليبوزومات البروتين إلى غشائها SSM، تظل تيارات ما قبل الحالة المستقرة غير متغيرة تقريبًا. وبينما لا يتم الحصول على تيار حالة مستقرة ثابت أبدًا، وبدلاً من ذلك وبسبب شحن الليبوزومات، يتناقص التيار المقاس تدريجيًا. ويمكن حساب تيار الناقل من التيار المقترن عبر الليبيد المقاس بواسطة تحليل الدائرة الكهربائية.

نستعرض هنا نتائج ممثلة باستخدام الناقل المشترك لبروتونات السكر، مثل Y في نطاق pH بين 8.5 و7.6. ويهيمن على تيار الناقل تفاعل توليد كهربائي في مرحلة متأخرة من دورة التفاعل. وفي ظل هذه الظروف، تتكون مرحلة ما قبل الحالة المستقرة من ارتفاع بسيط في التيار حتى يصل إلى قيمته في الحالة المستقرة.

ثم يتلاشى هذا بسبب الاقتران السعوي. ونحن مهتمون بتيار النقل في الحالة المستقرة. وفي حالة غياب جهد الغشاء، يُمثل هذا التيار بتقريب جيد من خلال تيار الذروة.

وبناءً على ذلك، يمكن تحليل حركية Ali Mein عن طريق رسم التيارات الذروية لتراكيز مختلفة من الركيزة، ولكن يجب مراعاة أن سعات التيار الذروي لا يمكن مقارنتها بدقة إلا إذا تم الحصول عليها من مستشعر واحد في تجربة واحدة. وأحد الأسباب في ذلك هو تباين كفاءة الامتصاص. وعندما يتم خفض قيمة pH بشكل أكبر، تتحول الإشارة أحادية الطور إلى إشارة ثنائية الطور.

وأخيراً، تظل هناك استجابة عابرة سريعة لطفرة lag Y التي تعاني من نقص في النقل. وتلي هذه الاستجابة العابرة السريعة مكون سلبي صغير وأبطأ. ويعد هذا المكون السلبي مميزاً لتيارات الاستجابة العابرة السريعة التي يتم قياسها في الأنظمة المقترنة بالليبيدات، وينتج عن تفريغ سعة الغشاء.

هنا، لا يمثل تيار الذروة نقل الحالة المستقرة، بل يمثل تأكيدًا كهربائيًا للتنقل في مرحلة مبكرة من الدورة الأيونية، وهو ما يتضح لأن الطفرة y لا تظهر نقلًا في الحالة المستقرة، وبالنسبة لـ lag y من النوع البري، يتم تثبيط نقل الحالة المستقرة بواسطة pH منخفض. توفر الأدلة التجريبية تفسيرًا ميكانيكيًا لنقل الشحنة في دورة تفاعل lag y، وهو ما يظهر في النموذج الحركي. إن العبور السريع الملاحظ للطفرة التي تعاني من نقص في النقل، أو في حالة lag Y من النوع البري في الظروف الحمضية، يرجع إلى تفاعل كهربائي ضعيف وسريع يتبع ارتباط اللاكتوز؛ أما عند قيم pH أعلى، فإن الإشارة يسيطر عليها التفاعل الكهربائي الرئيسي في مرحلة متأخرة من دورة التفاعل، والذي اقترح أنه يمثل تحرر البروتونات في السيتوبلازم الكاذب في النظام المقترن سعويًا.

يؤدي هذا إلى تيارات عابرة تمثل نقل Lag y في الحالة المستقرة نتيجة التفاعل القوي لـ Utes. ومع استخدام SSM، تتولد تداخلات كهربائية عند تبادل محاليل ذات تركيبات مختلفة. تأكد من أن المحاليل غير المنشطة والمنشطة متشابهة قدر الإمكان، خاصة فيما يتعلق بـ pH وقوة الأيونات.

يجب إجراء تجارب الضبط لأن الركائز قد تنتج أيضًا تداخلات اصطناعية. اختبر دائمًا نظام المحلول المنظم وبروتوكول التدفق الخاص بك للكشف عن التداخلات الاصطناعية باستخدام مستشعر SSM المجرد قبل إضافة عينة البروتين. بعد إضافة عينة البروتين، يمكن إجراء قياسات الضبط باستخدام محاليل تحتوي على مواد غير ركيزة، تكون مشابهة هيكليًا للركيزة.

علاوة على ذلك، هناك إمكانية لاختبار الركيزة للبحث عن الشوائب الاصطناعية باستخدام الليبوزومات أو شظايا الغشاء بدون البروتين المستهدف. يمكنك أيضاً إضافة المثبطات إلى محاليلك أو سحبها بالماصة بعد التجربة مباشرة إلى مخرج الفتحة لقياس تثبيط إشارة الناقل، وعندئذٍ ستختفي الإشارات الخاصة بالبروتين، مما يترك فقط الشوائب الاصطناعية الناتجة عن تبادل المحاليل.

بعد ذلك، يمكن تصحيح إشارة البروتين بسهولة. تأكد من أن فقدان البروتين الممتص، أو الليبوزومات، أو تحلل البروتين لا يؤثر على قياساتك. ومن خلال إجراء قياسات ضابطة متكررة في ظل ظروف متطابقة، يُعتبر تراجع الإشارة بنسبة تصل إلى 20% مقبولاً، ويمكن تصحيحه بافتراض وجود اعتماد زمني خطي لهذا التراجع.

يعتبر هذا الإعداد ثمرة 20 عاماً من التطوير التقني في مختبرنا. كما تتوفر أنظمة متخصصة توفر حلولاً زمنية أدق للتحليل الحركي واستهلاكاً أقل للمحاليل عند استخدام ركائز باهظة الثمن. أما بالنسبة لفحص العقاقير، فنحن نستخدم إعدادات أوتوماتيكية بالكامل ذات إنتاجية أعلى.

حتى الآن، تم توصيف أكثر من 20 ناقلاً باستخدام هذه الطريقة. وتشمل هذه الناقلات البروتينات الغشائية النشطة (APAs)، ومعقدات السلسلة التنفسية، والنواقل المبردة، والمبادلات، وحتى قنوات الحديد. لذا، عندما تعجز عن حل مشكلتك باستخدام الفيزيولوجيا الكهربائية القياسية، فكر في استخدام الفيزيولوجيا الكهربائية بتقنية SS Mase بدلاً من ذلك.