مقدمة إلى صلب غشاء المعتمدة واستنادا الكهربية

الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على الغشاء المدعومة باختصار الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM. إنه نهج فيزيولوجي كهربي جديد. إنه يوفر لعدد من التطبيقات تحسنا كبيرا مقارنة بالطرق التقليدية.

الأداة الرئيسية للفيزيولوجيا الكهربية التقليدية هي قطب الجسيمات الدقيقة المملوء بالكهرباء ، بينما يكتشف الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على M نقل الشحنة عبر قطب غشائي صلب مدعوم. إنه مفيد للغاية في الحالات التي لا يمكن فيها استخدام الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية ، كما هو الحال في الناقلات البكتيرية ، والتي بصرف النظر عن بعض الاستثناءات النادرة ، لا يمكن التحقيق فيها عن طريق طرق مشبك الجهد أو كاميرا التصحيح. في مثل هذه الحالات ، أثبت الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM نجاحا كبيرا.

يمكن استخدامه أيضا للتحقيق في الناقلات حقيقية النواة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الأغشية داخل الخلايا. هناك العديد من الطرق لإجراء تجارب الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM. في البحث الأساسي ، يمكن تطبيقه لتحديد المعلمات الحركية وتوضيح آلية النقل ، لكن متانته وإمكاناته في الأتمتة يجعله مثاليا لفحص التطبيقات في اكتشاف المسار.

يحمل قطب SSM نظاما غشائيا مركبا يتكون من SSM الأساسي والبروتيازومات أو شظايا الغشاء التي تحتوي على بروتين النقل الخاص بك. يمكن وصف الخصائص الكهربائية للغشاء المركب بواسطة دائرة مكافئة تشكل فيها الأغشية نظاما مقترنا بالسعة. لاحظ أن السلوك الكهربائي للنظام هو نفسه بشكل أساسي سواء تم استخدام شظايا الغشاء أو الجسيمات الشحمية البروتيا.

تنتقل إزاحة الشحنة في بروتين النقل إلى دائرة القياس عبر سعة غشاء المثانة. مبدأ كشف يسمى الاقتران السعوي. في تجربة نموذجية ، يوفر التبادل السريع للمحلول في VSSM الركيزة لبروتين النقل V الذي يولد نشاط النقل الكهربائي للبروتين تيارا مقترنا بنظام القياس عبر سعة SSM.

في الوقت نفسه ، يشحن نشاط البروتين الكهربائي تدريجيا الغشاء الشحمي مما يؤدي إلى تثبيط بروتين النقل والتيار المتناقص في دائرة التسجيل ، والتيار المقاس هو نتيجة لتفاعلات النقل المتزامنة لملايين الجسيمات الشحمية البروتيا التي يتم امتصاصها في Enzo. يحتوي كل منها على حوالي 100 ناقل. يتكون الإعداد من قفص فاراداي مع مسار حل ، ودوائر خارجية للتحكم في الصمام ، وتضخيم الإشارة ، بالإضافة إلى الحصول على البيانات وتحليلها.

يشتمل قفص EC على حاويات وصمامات وأنابيب مطلوبة للتحكم في تدفق المحلول ، بالإضافة إلى ذراع بشريحة XOR. تحمل شريحة XOR قطب SSM والجسيمات الشحمية البروتية الممتصة. يتم توصيل vete بمكبر الصوت ومولد الوظائف للدائرة الكهربائية الخارجية.

قياسات SSM ، إحداث حريق ، حلان ، أحدهما منشط والآخر غير منشط بصرف النظر عن الركيزة ، والتي توجد فقط في محلول التنشيط. كلا الحلين لهما نفس التركيب في تكوين التبادل الفردي. يتحكم صمامان ثنائي الاتجاه في تدفق المحاليل غير المنشطة والمنشطة.

استخدام الصمام الطرفي ، وهو صمام ثلاثي الاتجاهات مقترن ميكانيكيا ثلاث مرات ، للتبديل بين المحاليل غير المنشطة والتنشيط ، وتوجيه أحد الحلول إلى حاوية النفايات والمحلول الآخر إلى qve. عند تبديل الصمام الطرفي ، يتم إعادة توجيه تدفق المحلول غير المنشط إلى النفايات ويتدفق محلول التنشيط إلى qve. يسمح هذا التكوين بالتدفق المستمر المتزامن لكلا الحلين.

في أي وقت أثناء بروتوكول التدفق ، يمكن تحسين مسار التدفق حسب الحاجة. ومع ذلك ، يجب على المرء أن يضع في اعتباره أن المسافة بين SSM وتقاطع المحاليل غير المنشطة والتنشيط يجب أن تظل قصيرة قدر الإمكان. لأنه يحدد حل المؤقت لتبادل الحل.

يتم توصيل مكبر الصوت الحالي خارج قفص سطح الطاقة بشريحة مستشعر. عادة ، يتم ضبط هذا على تضخيم 10 أس ثمانية إلى 10 ، إلى قوة تسعة فولت لكل أمبير ووقت راحة من واحد إلى 10 مللي ثانية. يتم توصيل مولد الوظائف بالقطب المرجعي وجهاز كمبيوتر مزود ببرنامج التحكم في الصمام والحصول على البيانات وصندوق واجهة يكمل النظام.

صندوق الواجهة على الحصول على بيانات برامج تشغيل الصمامات ويتم الحفاظ على تدفق حل أجهزة الإخراج الرقمي بواسطة الهواء المضغوط البالغ oh 0.22. يتم مراقبة ضغط بار واحد باستخدام ملليمتر رقمي. يمكن صيانته عن طريق ملء حاوية فولاذية مثبتة بين إمداد الهواء وحاويات المحلول في قفص EC عبر صمام إبرة.

يتكون CVIC من أربعة أجزاء. يتم وضع شريحة زن بين قاعدة الطبيب البيطري ورأس الطبيب البيطري. يتم تثبيت موصل مخرج أسطواني برأس الطبيب البيطري ويحمل مجموعة القطب المرجعي.

يتكون القطب المرجعي من سلك فضي مكلور مع موصل SMC مصغر ويتم عزله عن مسار التدفق بواسطة جسر ملح هلام بولي أكري. غير قيد الاستخدام ، يتم تخزين مجموعة جسر الهلام في محلول 100 مللي مولار من فوسفات البوتاسيوم الأس الهيدروجيني السابع يحتوي على 100 مللي مولار كلوريد البوتاسيوم. أولا ، يجب تركيب القطب المرجعي في مجموعة القطب المرجعي التي تحتوي على الجسر الجغرافي.

من المهم تجنب فقاعات الهواء أثناء تثبيت القطب المرجعي. الآن يتم توصيل هذا الجزء من vete بموصل المخرج ، والذي تم تعبئته مسبقا بمحلول عازل. يجب أن تكون جميع التوصيلات مختومة بحلقات O.

يتكون هذا SM على شريحة zor ، وهو مصباح زجاجي مطلي بالماعز. يبلغ طول هذا الطريق الجسمي ملليمتر واحد وقطره وهو متصل بلوحة التلامس عبر شريط تلامس أبيض OH 0.2 ملم. يخلق دبوس التلامس الزنبركي اتصالا بمكبر الصوت.

يتم تخزين شريحة زن في الظلام في محلول إيثانول ثيول 10 LAR Okta Deccan. للحفاظ على هذه الطبقة الغامضة لإزالة جزيئات Okta deccan الفيروسية ، التي لم يتم امتصاصها ، يتم شطف القطب بالإيثانول النقي وتجفيف القطب الكهربائي في غاز النيتروجين. الآن يمكن تجميع طبقة الفوسفوكولين الأحادي.

يحتوي محلول الدهون على 15 ملليغرام في المليلتر DFI الكولين و 250 ميكروغرام في المليلتر. منجم Okta two A في الاضمحلال ويتم تخزينه عند درجة حرارة 20 درجة تحت الصفر. يتم الآن وضع القطب بدقة على قاعدة ذراع SA.

يضاف ميكرولتر واحد من المحلول إلى قطب SSM دون لمس الطبقة الذهبية. مباشرة بعد إضافة محلول الدهون ، يمكن تجميع vete. حجم vete المختوم بحلقة O أسطواني بحجم داخلي يبلغ 17 ميكرولتر عند تركيبه.

يجب أن يكون SSM متمركزا تحت تجويف المدخل. قبل توصيل الطبيب البيطري ، يجب ملء نظام السوائل مسبقا بمحلول عازلة لفوسفات البوتاسيوم 100 مللي مولار. من المهم التأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الأنابيب والصمامات.

الآن يمكن تركيب الطبيب البيطري في قفص الغدة الدرقية النهاري ، وتوصيل مكبر الصوت ، ومدخل ومخرج مسار تدفق المحلول ومولد الوظيفة. أخيرا ، يمكن شطف الذراع بمخزن مؤقت من فوسفات البوتاسيوم 100 ملم. هذا يؤدي إلى تكوين SSM تلقائيا للتحقق من جودة SSM.

يتم قياس السعة والتوصيل باستخدام مولد الوظيفة لقياس الموصلية 100 مللي فولت يتم استخدام جهد تيار مستمر. يظهر الاضمحلال الحالي شحن المكثف الغشائي بعد شحن المكثف بالكامل. ينتج عن التيار المقاس الموصلية الغشائية باستخدام قانون M'S.

هنا نلاحظ موصلية أوه 0.17 نانو سيمنز. يمكن قياس السعة باستخدام جهد تيار متردد مثلثي من ذروة 50 مللي فولت إلى ذروة السعة وتردد أوه 0.5 هرتز. يمثل اتساع تيار الموجة المربعة الناتج تيار الحكم على المكثف.

السعة تساوي الشحنة المنقولة مقسومة على الجهد المفروض يظهر هذا الغشاء سعة 2.3 نانو ، ويشير الموصلية العالية والسعة المنخفضة إلى أن SSM لم يتم تشكيله بشكل صحيح. في هذه الحالات ، يجب التخلص من الغشاء وإعداد SSM آخر باستخدام شريحة قطب كهربائي جديدة.

عادة ما يتم تخزين الجسيمات الشحمية البروتينية المجمدة عند 80 تحت الصفر. TRE th العينة على صوتنة الجليد ضرورية لأن عينة مجمعة تمتص البكرة إلى SSM للحصول على تعليق شحمي بروتي متجانس. يتم تبديل ثلاث دورات صوتنة مدتها عشر ثوان مع فترات تبريد عشر ثوان على الجليد.

اشطف SSM بمحلول غير منشط. ثم قم بفك موصل المخرج مع عينة القطب المرجعي. باستخدام ماصة ، قم بحقن 30 ميكرولترا من عينة البروتين من خلال مخرج vete في حجم ette.

قم أولا بتركيب طرف الماصة على تجويف المخرج. ثم افتح الدليل أعلاه في المسار غير المنشط وقم بحقن الجسيمات الشحمية البروتيا. قبل تخفيض رأس الماصة.

أغلق الدليل أعلاه لمنع المزيد من تدفق الحلول. اسمح للجسيمات الشحمية البروتيا بامتصاص SSM لمدة حضانة من ساعة إلى ساعتين. استخدم نافذة بروتوكول التدفق الخاصة ببرنامج التحكم في الصمام والحصول على البيانات لتحديد بروتوكول التدفق الخاص بك.

إذا كنت ترغب في القياس في ظل ظروف متماثلة ، مثل تحديد خصوصية الركيزة أو قيمة KM أو اعتماد الأس الهيدروجيني ، فاختر بروتوكول تبادل المحلول الفردي. اضبط مدة التدفق لكل حل على oh 0.5 إلى ثانية واحدة. يتم تسجيل التيار في جميع أنحاء بروتوكول التدفق بأكمله.

عادة ما يتم ضبط التضخيم على 10 أس تسعة، وبالنسبة لمعدل العينة، نختار 2000 نقطة بيانات في الثانية. أخيرا ، احفظ البروتوكول الجديد الخاص بك تحت العنوان NA a و a. في النقر الثاني على نافذة بروتوكول التدفق ، يمكنك تحديد الحالة المفتوحة أو المغلقة لصمامات معينة للتحكم في تدفق المحلول غير المنشط أو المنشط من خلال الكيوبت.

نوضح هنا قياس الجسيمات الشحمية البروتيا ، استيراد بروتون السكر مثل Y من E قولونية. يحتوي المحلول المنشط على اللاكتوز الركيزة المنقولة ، بينما يحتوي المحلول غير المنشط على نفس كمية الجلوكوز غير المنقول كمركب تعويضي. بالإضافة إلى السكريات ، تحتوي المحاليل على 100 مللي مولار من فوسفات البوتاسيوم عند درجة الحموضة 7.6 و DTT واحد ملليمول.

بعد تغيير المحاليل ، استخدم الصمام اليدوي للتأكد من إزالة فقاعات الهواء. قبل البدء في بروتوكول التدفق ، اضبط الضغط قبل بدء القياس مباشرة. نستخدم بشكل روتيني ضغط O 0.6 بار ، والذي ينتج عنه معدل تدفق يبلغ حوالي مليلتر واحد في الثانية.

ثم حدد بروتوكول التدفق الآمن هنا ، بروتوكول NAA ، واضغط على زر البدء لبدء كل قياس. خلال القياسات القليلة الأولى التي يتم امتصاصها بشكل فضفاض ، تتم إزالة الجسيمات الشحمية البروتيا وبالتالي قد ينخفض تيار الذروة. كرر القياس حتى يظل تيار الذروة ثابتا.

خلال المرحلة الأولى من تدفق المحلول غير المنشط ، يكون التيار صفرا. يؤدي التبادل من محلول عدم التنشيط إلى المحلول المنشط ، والذي يحتوي على اللاكتوز ، إلى نشاط النقل الكهربائي للغشاء. تتراكم الشحنة الموجبة للبروتين داخل الجسيمات الشحمية البروتينية ويكتشف مكبر الصوت تيارا عابرا موجبا بسبب الاقتران الإيجابي عبر SSM.

يسمى هذا التيار المقترن إيجابيا بتبادل إشارة V من محلول التنشيط. العودة إلى المحلول غير المنشط يحفز نقل رمز سكر البروتون خارج الجسيمات الشحمية. في هذه الحالة ، يتم عرض تيار سالب مقترن ب LY ما يسمى بإشارة إيقاف التشغيل لتحليل حركية البروتين.

يتم استخدام إشارة التشغيل فقط نظرا لأن إشارة الإيقاف غير محددة بشكل سيئ بسبب حالة شحن تبديل صمام الغشاء يخلق تحفا ميكانيكية وكهربائية. لحسن الحظ ، تقتصر هذه على نطاق زمني قبل ملاحظة الإشارات المستحثة بالبروتين. لاحظ أن تأخير 50 مللي ثانية بين القطع الأثرية لتبديل الصمام وإشارات الناقل هو الوقت الذي يحتاجه الحل للانتشار من الصمام الطرفي إلى سطح تبادل الحل السريع SSM ، مثل ذلك الذي يتم إجراؤه على SSM يمثل تجربة استرخاء نموذجية.

في مثل هذه التجارب ، يرتاح التيار من خلال مرحلة ما قبل الحالة المستقرة المعتمدة على الوقت إلى حالة ثابتة ثابتة. يمكن اشتقاق التفاصيل الحركية الحالية لدورة التفاعل من شكل وحجم تيار الحالة المستقرة المسبقة. بينما يوفر تيار الحالة المستقرة معلومات حول الدوران المستمر لبروتين الغشاء.

في النظام المقترن حيث يتم امتصاص الجسيمات الشحمية البروتيا إلى SSM ، فإن تيارات الحالة المستقرة قبل الثبات لم تتغير تقريبا. في حين أنه لا يتم الحصول على تيار ثابت للحالة المستقرة أبدا ، بدلا من ذلك بسبب شحن الجسيمات الشحمية ، ينخفض التيار المقاس تدريجيا. يمكن حساب تيار الناقل من التيار المقترن المقاس عن طريق تحليل الدائرة.

نوضح هنا النتائج التمثيلية باستخدام ناقل بروتون السكر المشترك ، مثل Y في نطاق PA بين 8.5 و 7.6. يهيمن على تيار الناقل تفاعل كهربائي في وقت متأخر من دورة التفاعل. في ظل هذه الظروف ، يتكون وجه الحالة المستقرة من ارتفاع تيار بسيط إلى قيمة الحالة المستقرة.

ثم يتحلل هذا بسبب الاقتران السعوي. نحن مهتمون بتيار النقل في الحالة المستقرة. في حالة عدم وجود إمكانات غشاء ، يتم تمثيل هذا إلى تقريب جيد من خلال ذروة التيار.

لذلك يمكن تحليل حركية علي مين عن طريق نشاف تيارات الذروة لتركيزات الركيزة المختلفة ، ولكن ضع في اعتبارك أنه لا يمكن مقارنة اتساع ذروة التيار بدقة إلا إذا تم الحصول عليها من جهاز استشعار واحد في تجربة واحدة. أحد الأسباب هو تباين كفاءة الامتصاص. عندما يتم تقليل الرقم الهيدروجيني بشكل أكبر ، تصبح الإشارة أحادية الطور ثنائية الطور.

وأخيرا ، يبقى عابر سريع لنقص النقل تأخر Y متحول. يتبع العابر السريع مكون سلبي صغير أبطأ. المكون السالب هو سمة مميزة للتيارات العابرة السريعة التي يتم قياسها في الأنظمة المقترنة وينتج عن تفريغ سعة الغشاء.

هنا ، لا يمثل تيار الذروة انتقالا في الحالة المستقرة ، بل يمثل تأكيدا إلكتريانيا للانتقال في وقت مبكر من دورة الأيونات ، والذي يصبح واضحا لأن طفرة la y لا تظهر أي نقل في الحالة المستقرة ، وبالنسبة لتأخر النوع البري ، يتم تثبيط نقل الحالة المستقرة بواسطة درجة حموضة منخفضة. يوفر الدليل التجريبي تفسيرا ميكانيكيا لنقل الشحنة في دورة تفاعل التأخر y ، وهو ما يظهر في النموذج الحركي. يرجع العابر السريع الذي لوحظ للطفرة الناقصة في النقل ، أو في حالة تأخر النوع البري Y في الظروف الحمضية إلى تفاعل كهربائي أسبوعي سريع بعد ارتباط اللاكتوز عند قيم الأس الهيدروجيني الأعلى ، ويهيمن على الإشارة التفاعل الكهربائي الرئيسي في وقت متأخر من دورة التفاعل ، والذي تم اقتراحه لتمثيل إطلاق البروتون البلازمي الزائف في النظام المقترن بالسعة.

هذا يؤدي إلى تيارات عابرة تمثل انتقال الحالة المستقرة ل Lag y بسبب التفاعل القوي للUtes. باستخدام SSM ، يتم إنشاء القطع الأثرية الكهربائية عند تبادل المحاليل ذات التركيبة المختلفة. تأكد من أن المحاليل غير المنشطة والنشطة متشابهة قدر الإمكان ، خاصة فيما يتعلق بدرجة الحموضة والقوة الأيونية.

يجب أن يتم التحكم لأن الركائز يمكن أن تنتج أيضا القطع الأثرية. اختبر دائما نظام المخزن المؤقت وبروتوكول التدفق الخاص بك بحثا عن القطع الأثرية باستخدام SSM العاري قبل إضافة عينة البروتين. بعد إضافة عينة البروتين ، يمكن إجراء قياسات التحكم في عينة البروتين باستخدام المحاليل التي تحتوي على ركائز غير ، والتي تشبه هيكليا الركيزة.

علاوة على ذلك ، هناك إمكانية لاختبار الركيزة بحثا عن القطع الأثرية باستخدام الجسيمات الشحمية أو شظايا الغشاء بدون البروتين المهم. يمكنك أيضا إضافة مثبطات إلى المحاليل أو ماصتها. بعد التجربة مباشرة إلى مخرج vete لقياس تثبيط إشارة الناقل ، ستختفي الإشارات الخاصة بالبروتين ، تاركة فقط القطع الأثرية لتبادل المحلول.

بعد ذلك تصحيح إشارة البروتين بسهولة. تأكد من أن فقدان البروتين الممتص أو الجسيمات الشحمية أو تدهور البروتين لا يؤثر على قياسك. من خلال إجراء قياسات التحكم المتكررة في ظل ظروف متطابقة ، يكون متهدم الإشارة بنسبة تصل إلى 20٪ مقبولا ويمكن تصحيحه بافتراض اعتماد الوقت الخطي للمتهدم.

هذا الإعداد هو نتيجة 20 عاما من التطوير التقني في مختبرنا. أيضا ، تتوفر أنظمة متخصصة ذات حل مؤقت أعلى للتحليل الحركي واستهلاك أقل للمحلول للركائز باهظة الثمن. لفحص الأدوية ، نستخدم إعدادات تلقائية بالكامل بإنتاجية أعلى.

حتى الآن ، تم تمييز أكثر من 20 ناقلة باستخدام هذه الطريقة. وتشمل هذه APAs للنقل ، ومجمعات سلسلة الجهاز التنفسي ، والناقلات الباردة ، والمبادلات ، وحتى القنوات الحديدية. لذلك عندما لا تتمكن من حل مشكلتك عن طريق الفيزيولوجيا الكهربية القياسية ، فكر في استخدام الفيزيولوجيا الكهربية SS Mase بدلا من ذلك.