تحليل دورة الخلية الحية من

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس مرحلة دورة الخلية النسبية وحجم الخلية للأنسجة التي تم التلاعب بها وراثيا وتصنيفها باستخدام GFP أو RFP في ذبابة الفاكهة. قم أولا بإعداد التهجين الجيني لتوليد ذرية تحتوي على خلايا مصنفة بالبروتينات الفلورية المرغوبة ومع التلاعب الجيني المطلوب في نسيج معين أو مجموعة معينة من الخلايا. قيد الدراسة ، قم بعزل الأنسجة المرغوبة بشكل نظيف من ذرية مرحلة النمو المناسبة ، ثم فصل الأنسجة إلى معلق خلية واحدة وصمة عار بصبغة DNA قابلة للحياة لقياس محتوى الحمض النووي.

تحليل العينات الملطخة المنفصلة عن طريق قياس التدفق الخلوي. في النهاية ، تقيس النتائج في الجسم الحي التغيرات في حجم الخلية ومرحلة دورة الخلية الناتجة عن التلاعب الجيني قيد الدراسة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية لقياس التدفق الخلوي على أنسجة ذبابة الفاكهة الحية باستخدام أصباغ الأشعة فوق البنفسجية هي أن صبغة الصبغة البنفسجية متوافقة مع مقاييس الخلوية الأقل تكلفة التي تحتوي على ليزر بنفسجي 4 0 5 ، والذي يمكن شراؤه بميزانية صغيرة وصيانته على مقياس مختبر واحد.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال دورة الخلية من خلال توفير معلومات عن مرحلة دورة الخلية وحجم الخلية أكثر تفصيلا من مجرد قياس الحجم الكلي للأنسجة ومعدل التكاثر. سيظهر الإجراء كاجل ودان صن ، طلاب الدراسات العليا من مختبري وأولغا جوكو. يقوم الفني لدينا بجمع اليرقات الناضجة في اليرقة الثالثة في حوالي 110 إلى 120 ساعة بعد وضع البيض لتشريح اليرقات.

التدريج الدقيق للتلميذ ضروريا للدراسات أثناء التحول لهذا الحصاد قبل الخادرة البيضاء في بداية التحول إذا لزم الأمر ، أنا طبق بتري مختوم من الشرانة أو قارورة من اليرقات في حمام مائي 37 درجة مئوية لتنشيط الحرارة. قاعدة تشاك فليب لاستنساخ تتبع النسب. بعد فتح طبق بتري ، ضعه في حاضنة للشيخوخة إلى المرحلة التنموية المرغوبة لتشريح التلاميذ.

أمسك الخادرة برفق من الطرف الأمامي لعلبة التلميذ حيث توجد فقاعة هواء لتجنب إتلاف الخادرة داخل وضع الخادرة العائمة للإمساك الصحيح. ثم باستخدام مقص صغير ، قم بقطع الطرف الخلفي للخادرة بزاوية طفيفة باتجاه الجزء الظهري من لتحرير الضغط الداخلي دون إجبار دهون الثقاب على الأنسجة المرغوبة في الصدر وقطع الرأس بعناية على طول الوسط الظهري ، وتجنب إتلاف الأجنحة وغسل مركب الدماغ الأمامي للعين لإزالة دهونه. ثم قم بإزالة التلميذ من علبة التلميذ عن طريق الإمساك بالحافة الخلفية لبشرة التلميذ بالملقط وسحبها من علبة التلميذ.

انقل الخادرة المقطعة إلى طبق تشريح نظيف. اصنع ثقبا صغيرا في بشرة مقدمة مركب دماغ العين باستخدام ملقط. باستخدام ماصة باستي زجاجية مع لمبة مطاطية.

اغسل محلول تشريح PBS برفق من خلال الخادرة التي تم تشريحها جزئيا لإزالة أي دهون متبقية وأنسجة الأمعاء. للحصول على أجنحة التلميذ ، أمسك الخادرة من الرأس بملقط واحد باستخدام ملقط ثان. أمسك الطرف الخلفي لبشرة الجناح ، واسحبه وأزله من جانب الذبيحة.

ثم قم بقص أو سحب الجناح الموجود في المفصلة لإزالته من الجسم ووضعه في كومة بعيدا عن الجثث والمواد الأخرى للحصول على عيون التلميذ أو الدماغ. اغسل الخادرة حتى يتم إزاحة مركب دماغ العين والتخلص من الخادرة. باستخدام ملقط ، اسحب عين التلميذ برفق بعيدا عن الدماغ واحتفظ بالأنسجة المرغوبة باستخدام ماصة سابقة مشحمة ، انقل الأنسجة المقطوعة بعناية.

احتضان الأنابيب مع الاهتزاز عند 23 درجة مئوية عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 70 دقيقة. ثم قم بالدوامة برفق لمدة خمس ثوان بسرعة متوسطة وأعد العينات إلى شاكر لمدة 15 إلى 20 دقيقة إضافية. عينات دوامة مرة أخرى لمدة خمس ثوان بسرعة متوسطة للأدمغة وعيون التلاميذ.

أقدم من 36 ساعة. يقوم PF بفصل الأنسجة في محلول صبغة الحمض النووي عند 23 درجة مئوية عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 45 إلى 60 دقيقة. ثم قم بفصل قطع كبيرة من الأنسجة يدويا واحدا تلو الآخر عن طريق نقلها إلى طبق تشريح مع حوالي 50 ميكرولترا من محلول صبغة الحمض النووي.

قم بسحب الماصة بسرعة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مسحوبة يدويا بفتحة تتراوح من 100 إلى 150 ميكرومتر تقريبا. تجمع العينات المنفصلة في أنبوب خمسة ملليلتر. احتضن 30 دقيقة إضافية عند 23 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 500 دورة في الدقيقة.

تحقق بصريا من أن العينات منفصلة تماما. ضع في اعتبارك أن بشرة جناح التلميذ الشفافة اللاخلوية لن ترتبط. ابدأ تحليل الفاكس عن طريق تحميل العينة على مقياس الخلوي.

ثم حدد القنوات للكشف عن التشتت الأمامي والمبعثر الجانبي الذي يشير إلى حجم الخلية وتعقيد الغشاء. للكشف عن تلطيخ الحمض النووي البنفسجي بالدورة D ، ستحتاج إلى قياس ارتفاع VL وعرض ومساحة واحدة من إثارة الليزر البنفسجي. حدد أيضا قناة الليزر الزرقاء منطقة واحدة لقياس تألق GFP.

لتحليل RFP ، نستخدم قناة الليزر الزرقاء ثلاثة. تم تحسين هذه القناة الموجودة على الtune لاكتشاف RFP. اضبط البوابات من أجل قصر التحليل على السكان المختارين والحد من الحطام وبيع الكتل من التحليل الذي يولد مخططات توقف مع البوابة الأولى ، واستبعاد الحطام والكتل في مخطط SSC مقابل FSC في مخطط VL منطقة واحدة مقابل VL واحد مع استخدام GA اثنين لاستبعاد الخلايا غير الملوثة الفرعية G واحدة الخلايا المبرمج وكتل الخلايا بناء على تحديد المفردات.

GA three الخلايا داخل البوابات الأولى والثانية التي تكون سلبية GFP على مخطط التألق مقابل محتوى الحمض النووي بناء على ارتفاع VE L واحد. تشمل المشية الرابعة التالية الخلايا داخل البوابات الأولى والثانية التي تكون إيجابية GFP على مخطط التألق مقابل محتوى الحمض النووي. يمكن للمرء أيضا إنشاء البوابات الخامسة والسادسة من المخططات النقطية لحجم الخلية كما تم قياسها بواسطة GFP مقابل التشتت الأمامي.

لفحص مراحل دورة الخلية ، استخدم الرسومين التكراريين اللذين يرسمان محتوى الحمض النووي على المحور x وعدد الخلايا على Y ais للمجموعات السكانية المحددة بواسطة البوابة الثالثة والبوابة الرابعة. بالنسبة لحجم الخلية ، تقوم الرسوم البيانية بتعيين المجموعات السكانية على البوابات الخامسة والسادسة ورسم FSC على المحور x والعد على المحور Y عند تشغيل العينات ، وضبط التسجيل على التوقف عند 10،000. حددت الأحداث الإيجابية ل GFP أيضا حجم الاستحواذ ل 300 ميكرولتر.

يتم تضمين إعدادات العتبة والجهد المناسبة في القوالب المتوفرة. قم بتشغيل العينات بحساسية قياسية أو عالية 100 ميكرولتر في الدقيقة وتسجيلها. ملفات البيانات المسجلة التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج Attune بتنسيق FCS ، وهو متوافق مع معظم برامج نمذجة دورة الخلية.

تظهر مساحة العمل التمثيلية هذه التي تحتوي على أربع مخططات نقطية واثنين من الرسوم البيانية عينة جناح اليرقة تعبر عن GFP و Cyclin D في الجناح الخلفي ، مدفوعة بجين Grailed gal four. القطعة النقطية الأولى من حجم الخلية مع مشية واحدة يستثني الحطام والتكتلات. تميز مخططة النقطة الثانية المفردات مع المشية الثانية لاستبعاد الخلايا غير الملطخة بمحتوى G 1D NA والتكتلات في مؤامرة GFP مقابل محتوى الحمض النووي.

يمكن تمييز الخلايا السالبة والموجبة ل GFP ويتضح اثنان من محتوى N و أربعة NDNA بناء على الموضع على طول المحور x. يتم استخدام مخطط حجم الخلية هذا كما تم قياسه بواسطة GFP مقابل التشتت الأمامي لإنشاء البوابات الخامسة والسادسة. تؤدي التحليلات الناتجة إلى الرسوم البيانية لمحتوى الحمض النووي مقابل تعداد السكان السلبيين ل GFP أو RFP بالإضافة إلى الخلايا الإيجابية ل GFP أو RFP.

استخدام قالب طلب تقديم العروض المقدم. يتم الحصول على نتائج مماثلة بنفس نوع الأنسجة ونمط التعبير. بالنسبة لطلب تقديم العروض ، فإن القوالب والفولتية المتوفرة مناسبة لتحليل عيون اليرقات والأدمغة والأجنحة ، بالإضافة إلى عيون التلاميذ وأدمغتها وأجنحةها.

في البرنامج المتناغم. يسمح استخدام ميزة التحجيم التلقائي لدورة الخلية أو الرسوم البيانية لحجم الخلية بتحديد الحد الأقصى العالمي لكل مجموعة سكانية. تمثل ملفات تعريف دورة الخلية هذه الخلايا الإيجابية والسالبة ل GFP في عيون اليرقة التي تعبر عن GFP في الخلف.

باستخدام GMR GAL أربعة U-A-S-G-F-P الجينات المعدلة وراثيا ، يكشف التراكب عن الاختلافات في مراحل دورة الخلية للخلايا الشفبرة عن GFP الخلفية. يمكن أيضا رسم التغيير النسبي في حجم الخلية بين الخلايا الموجبة والسالبة ل GFP. تم اشتقاق ملف تعريف دورة الخلية هذا من أدمغة التلاميذ في 46 ساعة A PF. الخلايا الإيجابية ل GFP هي استنساخ لتتبع النسب تعبر عن منظم G one S ، cyclin D و E two F ، والتي تعطل السكون وتؤدي إلى دخول المرحلة S.

هذا على النقيض من الخلايا السلبية ل GFP غير المعبرة ، والتي يتم القبض عليها عادة في هذه المرحلة. في G one ، ينشئ برنامج attune مناطق يحددها المستخدم على الرسوم البيانية ، ويحدد G مرحلتين و G على مرحلتين. يحدد جدول الإحصائيات لكل تشغيل الأعداد المطلقة للخلايا داخل المناطق والنسب المئوية المحددة من قبل المستخدم.

بدلا من ذلك ، يمكن استخدام برامج النمذجة مثل mod fit لتقدير النسب المئوية في كل مرحلة بالإضافة إلى الخلايا المبرمجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وتسمية العديد من الأنسجة من ذبابة الفاكهة لتحليل دورة الخلية.