RNA تنبؤ هيكل الثانوية باستخدام الشكل عالي الإنتاجية

الهدف العام من هذا الإجراء هو التنبؤ بالهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي بدقة النوكليوتيدات الفردية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعديل الكيميائي أولا للحمض النووي الريبي المطوي باستخدام كاشف محب للكهرباء يعزل S مناطق مفردة أو مرنة من الحمض النووي الريبي. الخطوة الثانية هي استخدام النسخ العكسي للكشف عن مواقع الحمض النووي الريبي التي تم تعديلها كيميائيا.

بعد ذلك ، يتم تجزئة منتجات CD NA للنسخ العكسي عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري. الخطوة الأخيرة هي معالجة البيانات والتطبيع. في النهاية ، يتم استخدام برنامج هيكل الحمض النووي الريبي للتنبؤ بالبنية الثانوية للحمض النووي الريبي باستخدام قيود الطاقة الحرة الزائفة المشتقة من تحليل الشكل.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الجزيئية ، مثل كيفية تحكم بنية الحمض النووي الريبي لوظائف الحمض النووي الريبي التحفيزي وغير الحالي ، وكيف تنظم جينومات الحمض النووي الريبي الفيروسية الوظائف المتعددة لجينوماتها. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاجنا وتشخيصنا للأمراض الفيروسية أو السرطان لأن اكتساب نظرة ثاقبة للهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي قد يساعد في تصميم الأدوية القائمة على الهيكل. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة لبنية الحمض النووي الريبي التي تنتجها النسخ في المختبر ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا في الجسم الحي لأن كواشف الشكل نفاذية للخلية.

قبل البدء في هذا الإجراء ، قم بإعداد الحمض النووي الريبي عن طريق النسخ في المختبر. باستخدام مجموعة نسخ تجارية. يجب تخزين الحمض النووي الريبي في مخزن مؤقت TE بين سالب 20 و 80 درجة مئوية تحت الصفر في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 ميكرولتر.

قم بتخفيف 12 مولة بيكو من الحمض النووي الريبي إلى 18 ميكرولتر بالماء وأضف ميكرولترين من مزيج المخزن المؤقت للطبيعة 10 × عن طريق النقر على الأنبوب متبوعا بدوران قصير ، قم بتسخين الخليط في الأنبوب إلى 85 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، ثم تبرد إلى أربع درجات مئوية بمعدل 0.1 درجة مئوية في الثانية. أضف 100 ميكرولتر من الماء و 30 ميكرولترا من خمسة × مخزن مؤقت قابل للطي إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير. بعد ذلك ، احتضان محتويات الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة اعتمادا على الطي الحمض النووي الريبي.

بشكل عام ، يتطلب الطي المعتمد على المغنيسيوم للحمض النووي الريبي الأطول والأكثر تنظيما أوقات حضانة أطول انقل حصة 72 ميكرولتر إلى كل من أنبوبي الطرد المركزي الدقيقة سعة 0.5 مليلتر ، والتي يجب تصنيفها على أنها معدلة وتحكم على التوالي. الخطوة التالية هي إضافة ثمانية ميكرولترات من ثنائي ميثيل سلفوكسيد اللامائي إلى مزيج التحكم وتركها جانبا. ثم أضف ثمانية ميكرولترات من 10 × و MIA إلى المزيج المعدل.

احتضان المزيج المعدل والتحكم عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. أضف ثمانية ميكرولترات من ثلاثة أسيتات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 5.28 ميكرولتر من 100 ملليمولار EDTA ، و 240 ميكرولتر من الإيثانول البارد ، وميكرولتر واحد من 10 ملليغرام لكل مليلتر. الجليكوجين إلى الأنبوب المختلط المعدل لترسيب الحمض النووي الريبي المعدل يبرد محتويات الأنبوب لمدة ساعتين عند 20 درجة مئوية تحت الصفر ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 14،000 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

ثم اغسل الحبيبات مرتين بالطرد المركزي الإيثانول البارد بنسبة 70٪ لمدة خمس دقائق. بعد كل غسلة ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام الماصة الدقيقة وجفف الحبيبات بالهواء لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإعداد العينات المعدلة والمراقبة للنسخ العكسي في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 0.5 ملليلتر.

بالنسبة للتفاعل المعدل ، امزج خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي المعدل ، وستة ميكرولترات من الماء ، وميكرولتر واحد من محلول تمهيدي 10 ميكرومولار ، وخمسة ميكرومولار. لتفاعل التحكم ، امزج خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي للتحكم وستة ميكرولتر من الماء وميكرولتر واحد من محلول أولي 10 ميكرومولار sci 5.5. ضع الأنابيب في جهاز تدوير حراري وقم بالركوع التمهيدي على الحمض النووي الريبي.

أثناء الركوع ، قم بإعداد مزيج 2.5 × RT. لكل تفاعل RT ، اخلطي جيدا واحتضنيه عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق قبل إضافته إلى تفاعلات الركوع. بمجرد أن تصل درجة حرارة تفاعلات الركوع إلى 50 درجة مئوية ، أضف ثمانية ميكرولترات من 2.5 XRT.

تخلط وتحتضن لمدة 50 دقيقة عند 50 درجة مئوية. بعد ذلك ، تحلل الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من أربعة هيدروكسيد الصوديوم المولي والتسخين إلى 90 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. قم بتبريد التفاعلات على الجليد ثم قم بتحييدها بإضافة ميكرولترين من حمض الهيدروكلوريك المولاري.

الآن اجمع بين التفاعلات المعدلة والتحكم وأضف 0.1 حجم أو واحد على عشر من إجمالي حجم التفاعل لثلاثة أسيتات الصوديوم المولارية و 100 ملليمولر EDTA 1.5 حجم من الإيثانول البارد وميكرولتر واحد من 10 ملليغرام لكل ملليلتر. الجليكوجين. ينتج عن هذا ترسيب CDNA خارج المحلول. ضعي المحلول في الثلاجة لمدة ساعتين ، ثم جهاز الطرد المركزي على حرارة 14،000 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

اغسل الحبيبات مرتين بتعليق الإيثانول البارد ، 70٪ ، القرص المضغوط NA المحبب في 40 ميكرولتر من أميد الشكل منزوع الأيونات عن طريق التسخين إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، متبوعا بدوامة قوية لمدة 30 دقيقة على الأقل لتحضير تفاعل التسلسل في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل يمزج 40 ميكرولتر من مزيج إنهاء DDA. خمسة مولات PICA من قالب الحمض النووي ، 4.6 ميكرولتر من 10 × عازلة للزيج و 10 ميكرولتر من برايمر D جيد القراءة. أضف إلى هذا الخليط 4.6 ميكرولتر من QUIN A وخففه بالماء ليصل الحجم الإجمالي إلى 82 ميكرولترا.

قم بإعداد تفاعل تسلسل ثان بنفس الطريقة باستخدام مادة ال دي.دي.تي والليكور IR 800 التمهيدي بدلا من ذلك. بعد ذلك ، انتقل إلى تضخيم PCR باستخدام شروط USB الموصى بها. أضف 16 ميكرولترا من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولارية درجة الحموضة 5.2 16 ميكرولتر من 100 ملليمولر EDTA ، وميكرولتر واحد من 10 ملليغرام لكل مليلتر جليكوجين ، و 480 ميكرولتر من 95٪ إيثانول لترسيب الحمض النووي ثم يحتضن عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة وجهاز الطرد المركزي عند 14 ، 000 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

أعد تعليق القرص المضغوط NA المحبب في 100 ميكرولتر من أميد الشكل منزوع الأيونات عن طريق التسخين إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، متبوعا بدوامة قوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد ذلك ، قم بخلط 40 ميكرولترا من عينات الشكل المجمعة مع 10 ميكرولترات من سلالم التسلسل المجمعة والماصة الحجم الإجمالي للعينة إلى 96 لوحة عينة بئر وقم بإعداد أداة الرحلان الكهربائي الشعري وبدء التشغيل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يتم إنتاج الآثار الأربعة المشفرة بالألوان المتداخلة عن طريق ترحيل المجموعات الأربع من منتجات التفاعل عبر الشعيرات الدموية على النحو التالي ، يظهر التتبع الأزرق منتجات النسخ العكسي الناتجة عن النسخ العكسي للحمض النووي الريبي المعدل NMIA.

يظهر Green Trace منتجات النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي المطوي ولكن غير المعدل. يظهر Black Trace سلم تسلسل D-N-A-D-D-G ويظهر Red Trace سلم تسلسل ال دي.دي.تي. يتم فصل آثار الرحلان الكهربائي الشعري الخام ومعالجتها ومحاذاتها ودمجها باستخدام برنامج البحث عن الشكل.

يبدأ تحليل البيانات باستيراد المخططات الكهربائية من نظام الرحلان الكهربائي الشعري إلى مكتشف الشكل. توفر نافذة عرض البيانات المركزية ملاحظات رسومية حول كل خطوة من خطوات معالجة البيانات. تعرض نافذة أداة inspector الموجودة في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة معلمات للأدوات المحددة في عارض البرمجة النصية.

يعرض مفتش البرمجة النصية في الجزء العلوي من الشاشة تلك الأدوات التي تم تطبيقها على البيانات ، وضبط المخططات الكهربائية لتصحيح خلفية الفلورسنت ، والتداخل الطيفي بين قنوات الفلورسنت ، وتحولات التنقل ، المنقولة من خلال بادئات ذات علامات مختلفة ، واضمحلال إشارة الناتج عن الإنهاء المبكر للنسخ العكسي والاختلافات في شدة التألق للمنتجات الشائعة المصنفة بمصابيح فلوروفورية مختلفة في مكتشفات الشكل لمحاذاة ودمج الأداة. استخدم وظيفة الإعداد لتعيين الهويات تلقائيا إلى القمم الفردية وربط هذه المعلومات بتسلسل الحمض النووي الريبي كما هو محدد بواسطة إدخال المستخدم وسلمي التسلسل لدمج ملفات تعريف تفاعل النيوكليوتيدات في خوارزمية البنية الثانوية التي يستخدمها برنامج بنية الحمض النووي الريبي 5.3 و أو لمقارنة ملفات تعريف الحمض النووي الريبي وثيقة الصلة. تطبيع بيانات الشكل بطريقة موحدة.

للقيام بذلك ، استبعاد القيم المتطرفة من الحسابات اللاحقة. حدد الحد الأقصى للتفاعل الفعال وتطبيعه بقسمة جميع قيم التفاعل على الحد الأقصى الفعال. يستخدم برنامج هيكل الحمض النووي الريبي للتنبؤ بالهياكل الثانوية للحمض النووي الريبي المدعومة تجريبيا باستخدام قيود الطاقة الحرة الزائفة من تحليل الشكل.

يوفر البرنامج تمثيلات رسومية لأقل طاقة لهياكل DRNA ، بالإضافة إلى تمثيل نصي لهذه الهياكل. في تدوين قوس النقطة ، يجب استيراد التسلسل والتعليق التوضيحي لقوس النقطة في عارض هيكل الحمض النووي الريبي الموضح هنا هو الهيكل ثنائي الأبعاد لحلقة جذعية عنصر استجابة فيروس نقص المناعة البشرية لمراجعة فيروس نقص المناعة البشرية منطقتين تم إنشاؤهما في بنية الحمض النووي الريبي 5.3 باستخدام ملفات تعريف التفاعل المشتقة من الشكل وتصورها باستخدام تطبيق Java خفيف الوزن. النيوكليوتيدات الملونة باللون الأزرق لها تفاعل منخفض ، في حين أن النيوكليوتيدات الملونة باللون الأحمر لها تفاعل أعلى بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يجب تفسير نموذج الحمض النووي الريبي الناتج بعناية قبل الوصول إلى استنتاجات نهائية حول الهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل استخدام التحقيق الجذري الهيدروكسي من خلال طرق الانقسام الفضائي من أجل توضيح التفاعلات الثلاثية المعقدة والسماح للباحثين في النهاية بتحديد هياكل هذه الحمض النووي الريبي في ثلاثة أبعاد.