بحكم الرحم الصعق الكهربائي وإإكسبلنتس نصف الكرة المجموع: طريقة بسيطة للدراسات التجريبية التنمية القشرية في وقت مبكر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير مستأصل لنصف الكرة المخية كاملاً لدراسة التطور القشري المبكر. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حصاد أجنة الفئران في اليوم الجنيني 13. بعد ذلك، يتم حقن خليط DNA البلازميدي في البطين الدماغي وإجراء عملية التثقيب الكهربائي خارج الرحم.

بعد ذلك، يتم تحضير مستأصل لنصف كرة كاملة من الجنين الذي خضع للتثقيب الكهربائي. وتتمثل الخطوة النهائية في تثبيت وتقطيع المستأصل لنصف الكرة الكاملة لإجراء التحليلات النسيجية. وفي الختام، يمكن تقييم تأثير الطفرة أو التعرض للسموم على تطور العصبونات القشرية من خلال التحليلات المناعية النسيجية للعصبونات التي تعبر عن GFP.

اسمي إريك أولسون، وأعمل في قسم علوم الأعصاب والفيزيولوجيا هنا في جامعة SUNY Upstate الطبية في سيراكيوز، وسنعرض لكم اليوم طريقة قمنا بتطويرها تسمى استئصال نصف الكرة المخية الكامل (whole Hemisphere X explan). تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل استئصال الشريحة (slice explan)، في أن استئصال نصف الكرة المخية الكامل سهل التحضير ويوفر نمواً نسيجياً عضوياً لمدة يومين.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التطور العصبي، مثل كيفية تسبب طفرة معينة أو سم معين في تعطيل التطور القشري المبكر. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن تحضير استخراج نصف الكرة المخية بالكامل دون إتلاف السحايا قد يتطلب بعض التدريب. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم خطوات التشريح ونقل المستخلص نظراً لحساسية الأنسجة للاضطراب الميكانيكي.

سوف تقوم الدكتورة ثيريزا أوزي، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبري، بشرح الإجراء. استخدم في هذا البروتوكول طقم تنقية متاح تجارياً لتنقية البلازميدات. قم بتحضير DNA البلازميد بتركيز 0.33 milligrams per milliliter في الماء، وأضف صبغة fast green كمتتبع للحقن بتركيز حوالي 0.02%Weight by volume. احرص دائماً على تعقيم الأدوات الجراحية، ومساحة العمل، والمجهر.

باستخدام ethanol بنسبة 70%، ثم يتم التضحية بالعدد المطلوب من أمهات Swiss Webster في اليوم الجنيني E 13 عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون. عند إزالة الأجنة، توضع في طبق قطر 10 سنتيمتر يحتوي على HBSS مبرد بالثلج، مع الحفاظ على الطبق مبرداً بالثلج. يتم تشريح كل جنين بعناية لفصله عن الأغشية الجنينية المحيطة.

الآن، انقل كل جنين على حدة إلى طبق نظيف يحتوي على HBSS مبرد بالثلج. وباستخدام حقنة Hamilton، احقن من 2 إلى 3 µL من الـ DNA المُحضّر في بطين النصف الدماغي الأيسر. تجنب الحقن في أو بالقرب من المنطقة القشرية المخصصة للتحليل المستقبلي.

لإجراء التثقيب الكهربائي للحمض النووي DNA، أمسك الجنين بلطف باستخدام الملقط وضع القطب الموجب لقطب الملقط برفق على الخط الناصف الظهري للرأس. ضع القطب السالب برفق تحت ذقن الجنين. قم بتشغيل برنامج يتكون من خمس نبضات بقوة 30 فولت، مدة كل منها 50 ملي ثانية على فترات زمنية مدتها ثانية واحدة باستخدام جهاز BTX 830 أو يمكن ضبط الأنظمة الأخرى وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

أعِد كل جنين إلى محلول HBSS المبرد بالثلج، ثم ابدأ بتحضير نصف الكرة المخية الكامل (whole hemisphere Explan) تحت مجهر تشريحي باستخدام ملقطين من نوع jewelers مقاس 5. قم بإزالة الجلد والجمجمة الغضروفية من رأس الجنين. بعد ذلك، مرر الملقط من تحت الدماغ.

لإخراج الدماغ السليم من الجمجمة، قم بتشريح النصف الكروي الذي خضع للتثقيب الكهربائي، بما في ذلك أنسجة الدماغ المتوسط المتصلة به. احذر من إتلاف السحايا التي تغطي النصف الكروي القشري الذي تم تشريحه. لقد وجدنا أن الخطوة الأكثر صعوبة في الإتقان هي تشريح وإزالة النصف الكروي الذي خضع للتثقيب الكهربائي دون إتلاف السحايا.

بمجرد الانتهاء من التشريح، انقل كل نصف كرة إلى 5 mL من محلول HBSS المبرد بالثلج باستخدام رأس ماصة سعة 1 mL تم توسيعه. وإذا لزم الأمر، يمكن الاحتفاظ بالأجنة في آبار منفصلة في طبق زراعة أنسجة يحتوي على 12 بئراً. بعد ذلك، انقل بلطف ما يصل إلى ستة أنصاف كرات إلى وسط زراعة مغطى بالكولاجين بقطر 24 mm.

أدخل القطعة المخصصة للزراعة ورتبها بحيث يكون الجانب الإنسي لأسفل. الآن، املأ بئراً بحجم 35 مليمتر من طبق يحتوي على ستة آبار بـ 2.7 مليلتر من الوسط الغذائي المدعم. أزل أي فائض من محلول HBSS من القطعة المخصصة للزراعة وضعها في البئر الذي يحتوي على الوسط الغذائي، ثم استخدم الماصة لوضع بضع قطرات من الوسط الغذائي الموجود في البئر فوق كل قطعة نسيجية.

لا تزيد حجم الوسط الغذائي. لقد وجدنا أنه من الضروري وضع بضع قطرات من الوسط الزراعي فوق المستأصلات X، بحيث لا يتم تغطية المستأصلات X بالوسط الغذائي بشكل كامل. قد يعني هذا إضافة ما يصل إلى 400 µL إلى الـ 2.7 mils من الوسط الغذائي فوق المستأصل X.

انقل الطبق إلى غرفة بيلوبس روثنبرج (Billups Rothenberg chamber) تحتوي على طبق ترطيب مائي وتم تزويدها بـ 95% oxygen لمدة دقيقة واحدة على الأقل. أغلق الغرفة بإحكام وافصل أنبوب إمداد الغاز. ضع الغرفة في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة يومين، وبحلول ذلك الوقت سيكون قد حدث انقسام الخلايا الأولية (prepl splitting).

في مرحلة التحضير. قم بتجهيز الوسادات الخاصة بتضمين الشرح. قم بتحضير محلول جيلاتين جلد العجل بتركيز 10% عند درجة حرارة 60 °C.

بمجرد الإذابة، صب ما يقرب من 10 milliliters من المحلول في طبق قطره 10 centimeter. احتفظ بالمحلول المتبقي عند 60 درجة Celsius للاستخدام لاحقاً. اترك الوسادات لمدة نصف ساعة لتتصلب إذا لزم الأمر.

يمكن تخزينها عند درجة حرارة 4 °C لعدة أيام، ولكن يجب تدفئتها لتصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. في يوم التثبيت، قم بتحضير محلول Pagano والمثبت ومحلول pagano بدون مثبت داخل خزانة استخلاص الغازات. قم بتدفئة محلول التثبيت إلى 37 °C.

استخرج الأجزاء النباتية من الحاضنة بعناية وبسرعة دون تعريض الأنسجة لأي اضطراب. تخلص من معظم الوسط الغذائي واستبدله بخمسة مليلترات (5 mL) من المثبت الدافئ. تأكد من غمر كل جزء نباتي بالكامل.

قم بتثبيت الأنسجة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم أزل المثبت واستبدله بمحلول Pagano. بدون مثبت.

أضف بضع قطرات من أزيد الصوديوم بتركيز 10% إلى كل بئر. يمكن الآن تخزين الأنسجة عند درجة حرارة 4 °C حتى يتم تضمينها على وسادة تضمين. ارسم شبكة على قاع الطبق باستخدام مسطرة.

قم بتشكيل مربعات بحجم اثنين إلى ثلاثة سنتيمترات. انقل الأجزاء النباتية المستأصلة المنفصلة إلى وسادة التضمين. اسحب أي محلول متبقٍ باستخدام الماصة وغطِّ كل جزء مستأصل بمحلول جيلاتين دافئ بتركيز 10%.

اتركه ليتصلب. وبمجرد أن يتصلب، أضف المزيد من محلول الجيلاتين ببطء حتى يحيط بكل قطعة من المستأصلات بالكامل. تجنب صهر الوسادة، وهو أمر قد يحدث إذا تمت إضافة الكثير من الجيلاتين دفعة واحدة.

الآن، اترك الجيلاتين ليتصلب لمدة ساعة تقريبًا. وبمجرد أن يتصلب، يمكن قطع كل explan إلى مكعبات صغيرة من الجيلاتين قبل عملية التقطيع. ومن المهم تثبيت المكعبات لاحقًا في مثبت Pagano لمدة يوم أو يومين.

عند إجراء عملية التقطيع، ضع المستنبتات بحيث تكون البصلة الشمية للأعلى، ثم قم بالتقطيع في المستوى الإكليلي بسمك 100 µm. اجمع المقاطع في محلول PBS مبرد يحتوي على 0.1% sodium azide.

تُخزن المقاطع عند درجة حرارة 4 °C حتى يتم صبغها باستخدام التقنية الموضحة. تم تحضير مستنبتات لنصف الكرة المخية كاملاً في اليوم الجنيني E 13 قبل عملية تقسيم الصفائح. في القشرة الجديدة الظهرية.

احتوى النسيج على جين ناقل يشير إلى الخلايا العصبية غير الناضجة من السلالة القشرية الاستثارية. تم تثبيت المستنبتات القشرية من نفس البطن بالتنقيط بالتتابع على مدار يومين في المختبر (in vitro) ومعالجتها لإجراء التحليل النسيجي اللاحق. في نقطة التحليل الزمنية الأولية DIV zero، لم يحدث بعد انقسام السلائف في الحقل one by one.DIV.

أصبح الصفيحة القشرية (CP) واضحًا واستمر في النمو حتى اليوم الرابع من الزرع ثنائي الأبعاد (2D IV). وبذلك، فإن مستنبتات نصف الكرة المخية كاملةً، والتي تم استزراعها في البداية في اليوم الجنيني 13 (E 13)، دعمت نضوج القشرة المخية لمدة يومين ورصدت الانقسام المبكر في القشرة الحديثة الظهرية لتأكيد التطور النسيجي الطبيعي في القشرة الحديثة الظهرية. تم إجراء صبغ مناعي لمستنبتات 2D IV للكشف عن كبريتات chondroitin، والـ protag glycans، ومكونات المصفوفة خارج الخلوية. وقد أشارت حزمتان من التفاعل المناعي في القشرة الظهرية إلى الانقسام المناسب للـ PPP إلى MZ و SP خلال فترة الزرع في المختبر.

تم تقسيم الـ PP بواسطة L إلى ستة عصبونات قشرية تعبر عن CTIP two وTBR R one. ويؤكد نمط الصبغ المناعي لهذه العلامات التعبير المناسب لعوامل النسخ هذه في الـ cp المتكون حديثاً. وتؤكد هذه التحاليل مجتمعة حدوث تطور قشري مبكر ORGANOTYPIC في كامل شق hemispere explan باستخدام البروتوكول الموصوف بالكامل، حيث تم حقن البطين الأيسر لأجنة E 13 سليمة.

يمكن ملاحظة تعبير GFP في السلائف العصبية في المنطقة البطينية (vz) بعد التثقيب الكهربائي والمعالجة. وبينما لوحظت خلايا تعبر عن GFP بشكل مكثف في المنطقة المتوسطة (IZ) واللوحة القشرية (cp)، فمن المهم ملاحظة وجود العديد من الخلايا العصبية الموجبة لـ GFP والمشار إليها برؤوس السهام عند الجزء العلوي من اللوحة القشرية (CP) الآخذة في التكون، مع ظهور الزوائد الشجيرية والمحاوير. وتشير الطبقة المتميزة عند الواجهة بين اللوحة القشرية (CP) والمنطقة السطحية (MZ) إلى حدوث الهجرة والتوقف والترقيق الطبقي بشكل مناسب.

امتدت الزوائد الشجيرية إلى المنطقة الحدية (MZ)، بينما امتدت المحاور العصبية القشرية تحت الصفيحة السطحية (CP) وإلى المنطقة الوسطى (iz) أدناه. كانت الخلايا المتمايزة عبارة عن خلايا موجبة لبروتين GFP في حالات مختلفة من النضج، بما في ذلك عصبونات ذات شكل ثنائي القطب مجاورة للألياف الدبقية الشعاعية، وأسفلها عصبونات متعددة الأقطاب في المنطقة الوسطى (iz). كما امتدت الزوائد الشجيرية إلى المنطقة الحدية (MZ) حيث تم تحديد الموقع المناعي لبروتين reelin الموجود في المصفوفة خارج الخلوية (ECM).

وبذلك، تتيح ظروف التثقيب الكهربائي والاستئصال التطور الطبيعي للعصبونات القشرية. وكما كان متوقعاً، استوطنت العصبونات الموجبة لـ GFP بعد الانقسام القشري (cp) الآخذ في التكوين. وبناءً عليه، يمكن لهذا البروتوكول استهداف العصبونات القشرية من الطبقة السادسة (L six) بشكل موثوق لدراسة هجرتها ونضجها.

أدى الاستخدام المكثف لهذا الإجراء إلى تحقيق معدل نجاح بنسبة 79%. حيث كانت 195 محاولة من أصل 248 محاولة مناسبة للتصوير والتحليل. وجاء نصف حالات الفشل نتيجة لعدم التعبير عن GFP أو عدم استهداف GFP بشكل صحيح بمجرد إتقان العملية.

يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون 90 دقيقة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر ممارسة عمليات التشريح لضمان إمكانية استزراع نصف الكرات المخية التي خضعت للتثقيب الكهربائي مع بقاء السحايا سليمة بعد هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المجهر بنظام التصوير المتقطع (time lapse microscopy) للإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية تسبب الطفرات محل الاهتمام في تعطيل الهجرة العصبية أو تكوين التغصنات الشجرية.