بحكم الرحم الصعق الكهربائي وإإكسبلنتس نصف الكرة المجموع: طريقة بسيطة للدراسات التجريبية التنمية القشرية في وقت مبكر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير نصف الكرة المخية الكامل لدراسة تطور القشرة المبكر. ويتم ذلك عن طريق أولا حصاد أجنة الفئران في اليوم الجنيني الثالث عشر. بعد ذلك، حقن خليط الحمض النووي البلازميدي في البطين الدماغي وإجراء عملية التوصيل الكهربائي خارج الرحم.

ثم تحضير نصف كرة كاملة من الجنين الذي تم التوصيل الكهربائي له. والخطوة الأخيرة هي تثبيت وقطع نصف الكرة المخية بالكامل لتحليل الأنسجة. في النهاية، يمكن تقييم أثر الطفرة أو التعرض للسموم على تطور الخلايا العصبية القشرية عن طريق التحليل المناعي النسيجي للخلايا العصبية التي تعبر عن GFP.

اسمي إريك أولسون. أنا في قسم علم الأعصاب وعلم وظائف الأعضاء هنا في جامعة ولاية نيويورك الطبية العليا في سيراكيوز، واليوم سنوضح لك طريقة قمنا بتطويرها تسمى نصف الكرة المخية الكامل X explan. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الموجودة مثل شريحة explan، هي أن نصف الكرة المخية الكامل X explan بسيطة في التحضير وتوفر يومين من النمو العضوي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تطور الجهاز العصبي، مثل كيفية تأثير طفرة معينة أو السموم على تطور القشرة المبكر. بشكل عام، الأفراد الجدد لهذه الطريقة سيواجهون صعوبة لأن تحضير نصف الكرة المخية الكامل دون إلحاق الضرر بالصفيحات يمكن أن يتطلب بعض الممارسة. العرض المرئي لهذه الطريقة ضروري لأن الخطوات الخاصة بالتقطيع ونقل الزرع صعبة التعلم بسبب حساسية الأنسجة للتعطيل الميكانيكي.

سيقوم الدكتورة تيريزا أوزي، وهي باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبري، بتوضيح الإجراء. لاستخدام هذا البروتوكول، استخدم مجموعة متاحة تجاريا لتنقية البلازميدات. قم بتحضير الحمض النووي البلازميدي بتركيز 0.33 ملليجرام لكل مليلتر في الماء وأضف صبغة خضراء سريعة كمتتبع للحقن بحوالي 0.02٪ من الوزن بالحجم. قم دائما بتطهير الأدوات الجراحية ومساحة العمل والميكرسكوب باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪.

ثم قم بذبح العدد المطلوب من إناث الفئران السويسرية في اليوم 13 عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون. عند إزالة الأجنة، ضعها في طبق بقطر 10 سم يحتوي على محلول HBSS بارد على الجليد في طبق مبرد. قم بتقطيع كل جنين بعناية من الأغشية الجنينية المحيطة.

الآن قم بنقل كل جنين بشكل فردي إلى طبق نظيف يحتوي على HBSS بارد على الجليد. باستخدام حقنة Hamilton، قم بحقن ما بين اثنين وثلاثة ميكروليترات من الحمض النووي المحضر في البطين في نصف الكرة المخية الأيسر. لا تقم بالحقن في المنطقة القشرية المخصصة للتحليل في المستقبل أو بالقرب منها.

لكي يتم التوصيل الكهربائي للحمض النووي، احمل الجنين بلطف باستخدام الملقط وضع بلطف مشبك التيار الموجب على الخط الأوسط الظهري للرأس. قم بوضع بلطف مشبك التيار السالب تحت ذقن الجنين. قم بتشغيل برنامج من خمس دفعات بقوة 30 فولت، كل منها لمدة 50 مللي ثانية مع فترات زمنية تبلغ ثانية واحدة باستخدام نموذج BTX 830 أو يمكن ضبط الأنظمة الأخرى وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بإرجاع كل جنين إلى HBSS البارد وتابع بتحضير نصف الكرة المخية الكامل Explan باستخدام مجهر تقطيع وملقط رقم خمسة. قم بإزالة الجلد والهيكل العظمي الغضروفي من رأس الجنين. ثم قم بتمرير الملقط أسفل الدماغ.

لكي تزيل الدماغ السليم من الجمجمة، قم بتقطيع نصف الكرة المخية الموصل كهربائيًا، بما في ذلك الأنسجة المتوسطة المرتبطة. احرص على عدم إتلاف الصفائح الغشائية التي تغطي نصف الكرة المخية القشرية المقطوعة. وجدنا أن الخطوة الأكثر صعوبة في السيطرة هي تقطيع وإزالة نصف الكرة المخية الموصل كهربائيًا دون إلحاق الضرر بالصفائح الغشائية.

بمجرد التقطيع، قم بنقل كل نصف كرة إلى خمسة ملليلترات من HBSS البارد باستخدام قنية واسعة بطرف ملليمتر واحد. إذا لزم الأمر، يمكن وضع الأجنة في آبار منفصلة في طبق زراعة أنسجة 12 بئرًا. بعد ذلك، قم بنقل ما يصل إلى ستة أقسام بلطف إلى زراعة مغلفة بالكولاجين قطرها 24 ملليمترًا.

أدخل ورتب الجانب الداخلي لأسفل. الآن قم بملء بئر بحجم 35 ملليمتر في طبق سداسي بـ 2.7 ملليلتر من الوسط المضاف. قم بإزالة أي فائض من HBSS من المدخل ووضع المدخل في البئر مع وسيط قم بتوزيع بضع قطرات من الوسط من البئر على الجزء العلوي من كل x explan.

لا تقم بزيادة حجم الوسط. وجدنا أنه من المهم وضع بضع قطرات من وسط الزراعة على الجزء العلوي من X explan، بحيث لا يتم تغطية X explants تمامًا بالوسط. قد يعني ذلك إضافة ما يصل إلى 400 ميكرولتر إلى 2.7 ملليلتر من الوسط على الجزء العلوي من x explan.

قم بتحريك الطبق إلى غرفة billups rothenberg التي تحتوي على طبق ترطيب مملوء بالماء وتم حقنها بالأكسجين بنسبة 95٪ لمدة دقيقة على الأقل. قم بإغلاق الغرفة بإحكام وفصل أنبوب إمداد الغاز. قم بوضع الغرفة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة يومين، وفي هذا الوقت سيتم تقسيم prepl.

في التحضير. قم بصنع ضمادات لتضمين الزرع. قم بصنع محلول جيلاتين بشرة العجل بنسبة 10٪ عند 60 درجة مئوية.

بمجرد الذوبان، اسكب حوالي 10 ملليلترات من المحلول في طبق بقطر 10 سم. احتفظ بالمحلول المتبقي عند 60 درجة مئوية لاستخدامه لاحقًا. اترك الضمادات لمدة نصف ساعة لتتصلب إذا لزم الأمر.

يمكن تخزينها عند 4 درجات مئوية لعدة أيام، ولكن يجب تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. في يوم التثبيت في غطاء التهوية، قم بتحضير محلول Pagano والتثبيت ومحلول pagano بدون تثبيت. قم بتسخين محلول التثبيت إلى 37 درجة مئوية.

قم باسترجاع الزرع من الحاضنة دون إزعاج الأنسجة بعناية وبسرعة. قم بإزالة معظم الوسط واستبداله بخمسة ملليلترات من التثبيت المدفأ. تأكد من أن كل زرع مغمور بالكامل.

قم بتثبيت الأنسجة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة التثبيت واستبدله بمحلول Pagano. بدون تثبيت.

أضف بضع قطرات من 10٪ من أزيد الصوديوم إلى كل بئر. يمكن الآن تخزين الأنسجة عند 4 درجات مئوية حتى يتم تضمينها في لوحة تثبيت. ارسم شبكة على قاع الطبق بمساعدة مسطرة.

قم بصنع مربعات بحجم سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات. قم بنقل الزرع الفردي إلى لوحة التثبيت. قم بسحب أي محلول متبقي وقم بتغطية كل زرع بحل 10٪ من الجيلاتين الدافئ.

اتركها لتتصلب. بمجرد التصلب ببطء، قم بإضافة المزيد من محلول الجيلاتين حتى يتم تحيط كل زرع بالكامل. تجنب إذابة اللوحة، والتي يمكن أن تحدث إذا تمت إضافة الكثير من الجيلاتين دفعة واحدة.

الآن، اترك الجيلاتين يتصلب لمدة ساعة تقريبًا. بمجرد التصلب، يمكن قطع الزرع الفردي إلى كتل صغيرة من الجيلاتين قبل التقطيع. من المهم أن يتم تثبيت الكتل في محلول Pagano لمدة يوم أو يومين.

عند التقطيع. قم بوضع الزرع بحيث يكون البصلة الشمية للأعلى وقم بالتقطيع في المستوى الإكليلي بسمك 100 ميكرومتر. قم بجمع الشرائح في محلول PBS بارد يحتوي على 0.1٪ من أزيد الصوديوم.