التصوير المباشر من الكالسيوم مع ER-المستهدفة استريز المستحثة صبغ تحميل (TED)

الهدف العام من التجربة التالية هو تصور ديناميكيات الكالسيوم مباشرة في تجويف الشبكة الإندوبلازمية للخلايا الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحويل الخلايا بالصبغة المستحثة من الإستراز المستهدف أو بنية ناقل TED للإفراط في التعبير عن استرازة CS اثنين في الشبكة الإندوبلازمية. بعد ذلك ، يتم تحضين الخلايا بمؤشر الكالسيوم أسيتو ميثيل إستر إنفلونزا أوه خمسة NA ، والذي ينتشر عبر أغشية البلازما والإنترناشيونال.

ثم يشق كربوكسيل إستراز. تطلق مجموعة الإستر المؤشر الحساس للكالسيوم في ER. تتشكل مجمعات الكالسيوم التجويف والفلورسنت.

تم الحصول على النتائج التي تظهر التغيرات في تركيز الكالسيوم الحر في غرفة الطوارئ بناء على تصوير الخلايا الحية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بتنظيم توازن الكالسيوم الخلوي. تتم مراقبة إشارات الكالسيوم بشكل متكرر في العصارة الخلوية ، لذلك لا يمكن تمييزها بسهولة حيث يتدفق الكالسيوم إلى العصارة الخلوية من الفضاء خارج الخلية أو من مخزن الكالسيوم داخل

للتغلب على هذا القيد ، قمنا بتطوير تنزيل مستهدف مستحث عن الإسترايز. بهذه الطريقة ، تتم مراقبة الكالسيوم المنطلق من غرفة الطوارئ مباشرة. النهج غير معرقل.

يظل غشاء البلازما سليما ويتم الحفاظ على شلالات الإشارات داخل الخلايا. بشكل عام ، سوف يكافح الأفراد والطريقة لأنهم بحاجة إلى الخبرة. في تعبير TED Vector ، قمنا بتطوير تركيبات متجهة تعبر عن بروتين سنت مدمج في Carboxylase CES اثنين.

يتيح لنا ذلك التعرف بسهولة على الخلايا المناسبة لتصوير الكالسيوم AR أثناء التجارب ، والتي ستؤدي إلى الخلايا التي تتميز بالتألق الأحمر القوي والتألق المعتدل إلى القوي فقط لمؤشر الكالسيوم المعتدل إلى القوي. يجب توزيع ملصقات الفلورسنت هذه بالتساوي في جميع أنحاء الشبكة الإندوبلازمية وهي غائبة في المنطقة النووية. قبل البدء.

تحضير السائل النخاعي الدماغي الاصطناعي أو السائل النخاعي الدماغي والإنفلونزا أوه خمسة NAM وفقا لبروتوكول النص. قم بتسخين السائل الدماغي النخاعي A إلى درجة حرارة الغرفة وأضف الجلوكوز العميق لتهوية السائل الدماغي النخاعي A مع الكربوجين لمدة خمس دقائق. ثم أضف محاليل مخزون مولية واحدة من كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم إلى التركيزات النهائية التي تبلغ مللي مولار لكل منهما.

بعد بدء مجهر التصوير المباشر وبرنامج الكمبيوتر ، ابدأ الوفرة في غرفة التصوير الوهمية وقم بموازنة نظام الأنبوب مسبقا لتسخين سخان المحلول المضمن وغرفة التصوير على مرحلة المجهر وقم بموازنة النظام إلى 32 إلى 37 درجة مئوية. قبل البدء في إجراء التنزيل لتحميل الصبغة في الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من السائل الدماغي النخاعي الدافئ مسبقا إلى 0.5 ميكرولتر من خمسة مليمولار إنفلونزا أوه خمسة NAM ، وقم بإذابة المحلول في حمام مائي صوتي لمدة 90 ثانية ، انقل 400 ميكرولتر من محلول التصوير الدافئ إلى بئر واحد من أربعة أو 24 لوحة بئر. أضف المحلول D إلى نفس البئر لإنتاج 500 ميكرولتر من محلول خمسة ميكرومولار.

بعد ذلك ، ضع بعناية زلة غطاء مع الخلايا في حضانة البئر لفترة زمنية مناسبة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية DI يعتمد وقت التحميل وتركيز D على نوع الخلية كثافة الخلية والاحتياجات الخاصة للتجارب. قد تضر أوقات الحضانة الطويلة بالخلايا ، وخاصة الفروق الدقيقة الأولية والخلايا الدبقية ، وهذا أمر بالغ الأهمية للاستجابة للمنبهات الفسيولوجية. سيكون الحضانة لأكثر من 30 دقيقة مفيدا فقط لتجارب توطين الكالسيوم في ER للتحقيق في توزيع الكالسيوم ER في المجالات الدقيقة الصغيرة ، على سبيل المثال ، MUEs للعمود الفقري مباشرة بعد الحضانة ، ينزلق الغطاء إلى ثقافة خلية أخرى تحتوي على محلول تصوير.

للتحضير لتركيب الخلايا في غرفة التصوير ، استخدم فرشاة طلاء لتطبيق الشحوم عالية التفريغ على غرفة التصوير. نستخدم غرف تصوير ذاتية الصنع لزلات غطاء من 10 إلى 12 ملم بحجم صغير ، مما يسمح بسرعات نضح عالية تصل إلى 15 ضعفا في الدقيقة. التقط زلة الغطاء مع الأنفلونزا والخلايا المحملة وأضف قطرة صغيرة من محلول التصوير لإبقائه رطبا.

ثم اقلب زلة الغطاء رأسا على عقب وقم بتركيب الخلايا في غرفة التصوير. استخدم قطعة قطن للضغط على زلة الغطاء في غراء السيليكون ومسح المخزن المؤقت المتبقي من أسفل زلة الغطاء الزجاجي. بعد ذلك ، استبدل غرفة التصوير الوهمية بغرفة التصوير التجريبية.

اغسل الخلايا لمدة خمس إلى 10 دقائق عن طريق التروية المستمرة لاختيار الخلايا. استخدم الحد الأدنى من إضاءة الليزر لمنع التبييض السريع للصور من الأنفلونزا أوه خمسة والكالسيوم اثنين في غرفة الطوارئ ، ومعدل مسح مرتفع من اثنين إلى أربعة هرتز ، وحجم صورة صغير وكسب مرتفع تم إعداده في المجهر. وفقا لتجربة النبات.

في بداية التجربة ، قم بتوثيق التوزيع الخلوي للأنفلونزا أوه خمسة وملصق الكالسيوم وملصق الفلورسنت الأحمر لبناء carbox cel esterase الأحمر. في الخلية التي تهمك هنا ، تقوم الخلايا العصبية التمثيلية بواسطة مكدسات صور X و YZ عالية الدقة بإجراء تصوير XYT لمراقبة ديناميكيات الكالسيوم ER في ظل الظروف التجريبية المحددة. الإعدادات النموذجية لنظامنا مذكورة في الجدول الثاني من بروتوكول النص: مراقبة التغييرات في الكالسيوم ER تحت التروية المستمرة مع محلول التصوير ، ومعدلات التبادل العازلة هي 1.5 ملليلتر في الدقيقة لغسل الخلايا واستنفاد المخزن عن طريق منع الشبكة الإندوبلازمية ساركو والكالسيوم اثنان من TPAs وثلاثة ملليلتر في الدقيقة للتحفيز بواسطة TP و DHPG وناهض لمستقبلات الغلوتامات الأيضية.

هنا يتم تحفيز الخلايا الدبقية ب 200 ميكرومولار A TP لمدة 10 ثوان. لمعالجة الصور ، افتح مكدس الصور في برنامج Image J للتصوير متعدد الألوان. قم بتقسيم قنوات RBG عندما يطلب البرنامج ذلك.

تحديد مناطق الاهتمام. اعتمادا على الغرض ، ارسم مناطق الاهتمام حول التقارير الإلكترونية الكاملة أو مناطق صغيرة من غرفة الطوارئ. استخدم المكون الإضافي لمحلل السلاسل الزمنية لقراءة متوسط كثافة البكسل في منطقة الاهتمام.

احسب التغيرات النسبية المصححة في الخلفية في التألق بواسطة دلتا F على F صفر باستخدام هذه الصيغة. التغيرات النسبية الحالية في التألق كأثر مع دلتا F فوق F صفر للمحور Y ووقت المحور x. في هذا الشكل ، تعبر الخلايا النجمية القشرية والخلايا العصبية في الحصين عن ناقل TED الفلوري الأحمر ويتم تصنيفها بمؤشر الكالسيوم منخفض التقارب.

الأنفلونزا أوه خمسة N.يتم توطين مركب مؤشر الكالسيوم الفلوري في الشبكة الإندوبلازمية لجميع أنواع الخلايا. يوضح هذا الشكل الأنفلونزا أوه خمس خلايا دبقية مسماة N. أثناء علاج CIN ، يظهر وضع علامات العصارة الخلوية الساطع في حالة تلف غشاء البلازما للخلية قبل وبعد العلاج ب CIN.

يكشف هذا أن الأنفلونزا أوه خمسة N يتم إطلاقها أيضا في العصارة الخلوية عن طريق الاستيرازات الذاتية. في هذه التجربة بعد وضع العلامات على TED مع الأنفلونزا أوه خمسة N er يحدث استنفاد الكالسيوم في الخلايا العصبية الحصين المستنبتة بسبب حاصرات circa cyclonic acid. لاحظ أن التغيير الهائل في متوسط كثافة التألق لكل منطقة ذات أهمية موضح هنا هو سلسلة فاصل زمني مع خلايا GL كورتيكو الفأر التي يتم تحفيزها باستخدام TP. يسقط التألق فجأة ويتعافى مما يمثل إطلاق الكالسيوم ER وإعادة تعبئته في الوقت نفسه ، ينخفض تألق بروتين الفلورسنت الأحمر بشكل هامشي نتيجة لمخططات تبييض الأردواز التي تظهر التغيير في شدة التألق بمرور الوقت في بعض التجارب ، ولكن ليس جميعها.

لا تعود قيم التألق إلى مستويات شدة التألق الأولية لأن بعض مجمعات الأنفلونزا أوه خمسة N تفقد أثناء التحفيز. يظهر هذا الفيلم خليتين مصابين من الكربوكسيلاز BHK 21 بدقة عالية تم تصنيفهما بواسطة الأنفلونزا أوه خمسة مجمعات الكالسيوم N ويتم تحفيزهما باستخدام TP. لاحظ أن إطلاق الكالسيوم الناجم عن TP وإعادة تعبئة مخزن الكالسيوم ER يتم تصورها في الهياكل الدقيقة لأنابيب ER. أثناء حضور هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الخلايا السليمة تماما فقط هي التي تظهر استجابات فسيولوجية للكالسيوم.

لذلك نوصي بإجراء سلسلة من تجارب توازن الكالسيوم المترابطة في يوم واحد بنفس دفعة الخلية. بناء على تجربتنا ، فإن صبغة إنفلونزا خمسة N تعمل بشكل أفضل ، لكن مؤشر الكالسيوم هذا ليس مقاوما للخرق. لذلك ، ستستفيد هذه الطريقة من تطوير مؤشرات الكالسيوم منخفضة التقارب الأكثر مقاومة للتبييض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير الكالسيوم العابر E مع مؤشرات الكالسيوم الاصطناعية منخفضة التقارب. تمكنك هذه المؤشرات من مراقبة ديناميكيات الكالسيوم الإلكترونية بدقة زمنية عالية. لهذا السبب ، قد تكون طريقتنا مفيدة للتحقيق في شلالات إشارات الكالسيوم المشاركة في اللدونة المشبكية ولمراقبة التغيرات في توازن الكالسيوم في النماذج الخلوية للأمراض التنكسية العصبية.