في الوقت الحقيقي التصوير من التفاعلات صفائح الدم، العدلات غيروي على البطانة الوعائية التهاب المنشط خلال تشكيل خثرة في والفئران الحية

نحن هنا نورد التجريبي لتقنية المجهر مضان intravital لتصور غيروي الصفائح الدموية العدلات التفاعلات على البطانة الوعائية التهاب تنشيط خلال تشكيل خثرة في والفئران حية. وهذه التكنولوجيا المجهرية تكون ذات قيمة لدراسة الآلية الجزيئية لأمراض الأوعية الدموية وكلاء الدوائية لاختبار في ظل ظروف المرضية في جسم المريض.

الهدف العام من التجربة التالية هو تصور التفاعل النموذجي بين الصفائح الدموية والعدلات على البطانة المنشطة أثناء أمراض الأوعية الدموية. يتم تحقيق ذلك عن طريق الفحص المجهري الحيوي الفلوري في الوقت الفعلي في الفئران الحية لتصور الأوعية الدموية الدقيقة داخل عضلة الكريماستر. كخطوة ثانية ، يتم حقن الأجسام المضادة المصنفة بالفلورسنت ويبدأ التهاب أو إصابة في الولايات لتسهيل التصور المباشر لتفاعلات عدلات الصفائح الدموية النمطية الناتجة.

بعد ذلك ، يتم تحليل البيانات المحفوظة من أجل تحديد عدد الخلايا وديناميكياتها. في النهاية ، يمكن تقييم التفاعلات النموذجية المباشرة بين الصفائح الدموية والعدلات على البطانة المنشطة بناء على إشارة الفلورسنت للأجسام المضادة المنقوعة في الفحص المجهري داخل الحيوية في الوقت الفعلي. يمكن أن توفر تقنيتنا المجهرية داخل الحيوية نظرة ثاقبة للتفاعلات في الوقت الفعلي بين الصفائح الدموية والعدلات على البطانة المنشطة أثناء التهاب الأوعية الدموية وتكوين الجلطة.

يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على أنظمة أخرى مثل تقييم تفاعلات الخلايا السرطانية وخلايا الدم. قبل بدء التجربة ، قم بتشغيل نظام المجهر لنموذج التهاب الأوعية الدموية. حقن داخل النمو انعكاس عامل نخر الورم ألفا قبل ثلاث ساعات من حقن IP للتخدير.

بمجرد تأكيد التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم ، قم بتدوير أنبوب PE 90 في القصبة الهوائية للفأر للتخلص من أي صعوبات في التنفس. بعد ذلك ، قم بتحريض أنبوب PE 10 في الوريد الوداجي الأيسر لضخ الأجسام المضادة المصنفة بالفلورسنت ومواد التخدير الإضافية. ثم اسحب جلد كيس الصفن برفق وقم بتحريكه أفقيا واستخدم المخزن المؤقت الدافئ مسبقا فوق المجال الجراحي.

الآن الضغط على أسفل البطن ملقط واحد ، واسحب الخصية بعناية مع الملقط الآخر في الحجم ، والسيارة الرئيسية العضلية عموديا وتسطيح العضلات فوق غطاء زجاجي على صينية مجهر داخل قارورة عن طريق تثبيت الأنسجة المحيطية على الدرج. ابدأ هذه الخطوة بغرس الأجسام المضادة المترافقة DITE 4 88 ، والقرص المضغوط المضاد للفأر 42 C و Alexa floor 6 47 المترافق المضاد للفأر GR واحد من خلال القنية الوداجية التي تم تعيينها مسبقا. ثم في مجموعة مرشحات المجهر ، حدد خانة الاختيار للقنوات التي سيتم عرضها واضبط وقت التعرض لكل التقاط محدد بفاصل زمني.

لتعيين عدد النقاط الزمنية إلى 1000 إلى 1500 بفاصل زمني قدره 200 مللي ثانية لإجمالي الوقت المنقضي خمس دقائق. بمجرد تعيين جميع المعلمات في التقاط الصورة، حدد البدء لبدء التقاط الالتقاط بتكبير 60 × مع نافذة 157 ميكرومتر × 118 ميكرومتر. راقب الصفائح الدموية الحاكمة والملتصقة في العدلات لمدة خمس دقائق في النصف العلوي من مكان الكريماستر الملتهب.

لتحليل تكوين الجلطة الصفائح الدموية ، انتقل إلى قناع وحدد إنشاء. ثم أسفل أداة تحديد الإطار في العرض الرئيسي ، انقر فوق رمز القلم الرصاص الكبير. استخدم القلم الرصاص لتلوين منطقة خارج الوعاء في المنظر الرئيسي.

لتعيين قناع في الخلفية، انتقل إلى قناع، وانقر فوق نسخ هذا المستوى، وانقر فوق نسخ القناع. في النقطة الزمنية الحالية ، حدد جميع النقاط الزمنية وانقر فوق موافق. لحساب إشارة الخلفية، انتقل إلى الإحصائيات وانقر فوق إحصائيات القناع.

ثم في نطاق الصورة ، انقر فوق اللقطات المتتابعة ثنائية الأبعاد الحالية ، أو أربع صور D في نطاق القناع ، حدد القناع بالكامل في الميزات. ضمن تاريخ الالتقاط، حدد وقت الانتهاء. ضمن هندسة الشكل، حدد المنطقة بالبكسل وتحت الكثافة حدد الحد الأقصى للكثافة.

الآن انقر فوق تصدير. افتح الملف النصي في برنامج جداول البيانات واحسب متوسط قيمة إشارة الخلفية طوال فترة التسجيل. لتحديد شدة مضان الخلفية.

بعد حساب شدة مضان الخلفية أثناء الجلطة الدموية كما هو موضح للتو في نموذج التهاب الأوعية الدموية ، انتقل إلى القناع ، وانقر فوق المقطع ، وحدد fit e ، والقناة ، وأدخل متوسط قيمة إشارة الخلفية عند النقر المنخفض تطبيق وموافق. ثم انتقل إلى الإحصائيات وانقر فوق إحصائيات القناع. الآن في نطاق الصورة ، انقر فوق الفاصل الزمني 2D الحالي أو أربع صور D في نطاق القناع ، وحدد القناع بأكمله في الميزات ضمن تاريخ الالتقاط ، وحدد الوقت المنقضي ضمن هندسة التحول ، وحدد المنطقة بالبكسل وتحت الكثافة ، حدد بعض الكثافة.

ثم انقر فوق تصدير. افتح الملف النصي في برنامج جدول البيانات واحسب شدة تألق الجلطة الدموية. لتحليل تجلط الدم الشرياني ، ابدأ بغرس DITE 4 88 مترافق مضاد للفأر CD 42 C ANDOR 6 47 مترافق مضاد للفأر GR واحد الأجسام المضادة كما هو موضح للتو.

بعد النقر فوق ابدأ لبدء عملية التقاط الصورة ، انقر نقرا مزدوجا فوق بقعة من اثنين إلى ثلاثة ميكرومترات داخليا من جدار الوعاء لإطلاق الليزر. تتسبب إصابة الخلايا البطانية الشريانية في حدوث تغيير بصري في الشكل يجب أن يكون واضحا في صورة المجال الساطع متبوعا بتراكم الصفائح الدموية. بعد خمس دقائق من إصابة الليزر ، توقف مؤقتا وقم بإلغاء الالتقاط.

ابدأ بعد ذلك الالتقاط ب 2 ، 400 نقطة زمنية بفاصل زمني قدره 500 مللي ثانية لتسجيل الصفائح الدموية الملتصقة والعدلات المتدحرجة والملتصقة لمدة 20 دقيقة. بعد حساب شدة مضان الخلفية أثناء الجلطة الدموية بطريقة مماثلة كما هو الحال في نموذج التهاب الوحدة ، انتقل إلى القناع ، وانقر فوق المقطع ، وحدد fite و channel وأدخل متوسط قيمة إشارة الخلفية عند النقر المنخفض تطبيق وموافق. الآن في نطاق الصورة ، انقر فوق الفاصل الزمني 2D الحالي أو 40 D في نطاق القناع ، وحدد القناع بأكمله في الميزات ضمن تاريخ الالتقاط حدد الوقت المنقضي ضمن منطقة تحديد Morpho بالبكسل وتحت الكثافة ، حدد بعض الكثافة.

ثم انقر فوق تصدير. افتح الملف النصي في برنامج جدول البيانات واحسب شدة تألق الجلطة الدموية. لتحديد كمية العدلات المتدحرجة والملتصقة ، قم بتشغيل الفاصل الزمني واحسب عدد الخلايا التي تتدحرج بشكل واضح.

تعرف الجلطة الدموية على مدى 20 دقيقة على أنها انخفاض في سرعة العدلات أثناء التفاعل مع الجلطة الصفائحية لمدة ثانيتين على الأقل. تعرف العدلات الملتصقة بأنها أي عدلات تظل ملتصقة بجلطة الصفائح الدموية لمدة دقيقتين على الأقل. هنا ، صور تمثيلية لظهور إشارات الفلورسنت المرتبطة بالعدلات باللون الأحمر والصفائح الدموية باللون الأخضر.

أثناء عرض التهاب الكلية ، يظهر السهم اتجاه تدفق الدم في الوعاء الدموي. تم تحديد عدد العدلات المتدحرجة والملتصقة على الخلايا البطانية الملتهبة ليكون 0.25 خلية في الدقيقة و 18.5 خلية في خمس دقائق على التوالي. تمثل البيانات متوسط زائد أو ناقص الخطأ المعياري لمتوسط 30 Es مختلفا في أربعة فئران من النوع البري.

هنا يتم رسم إشارة الفلورسنت المتكاملة المتوسطة للصفائح الدموية كدالة للوقت. وجد أن معظم الصفائح الدموية باللون الأحمر تلتصق بالعدلات الملتصقة والزاحفة باللون الأخضر بدلا من جدار الوعاء الملتهب. ننتقل الآن إلى تفاعلات الصفائح الدموية العدلات بعد إصابة الشرايين الناجمة عن الليزر.

توضح هذه الصور عدلة واحدة باللون الأحمر ويشار إليها بالسهم الأصفر المتداول فوق جلطة الصفائح الدموية باللون الأخضر مع عدلات ثانية باللون الأحمر ويشار إليها بالسهم الأبيض الذي يتدحرج بسرعة فوق الخلايا البطانية الشريانية ، كلاهما خلال فترة التقاط مدتها خمس ثوان هنا ، يظهر عدلة واحدة مرة أخرى باللون الأحمر وهي تتدحرج وتلتصق بخثرة الصفائح الدموية باللون الأخضر على مدى فترة 15 ثانية. يحدد رأس السهم العدلات المتدحرجة والملتصقة ويشير السهم الرمادي السميك إلى اتجاه تدفق الدم. هنا ، يتم رسم إشارة الفلورسنت المتكاملة المتوسطة للصفائح الدموية كدالة للوقت.

تم تحديد عدد العدلات المتدحرجة والملتصقة ليكون 21.5 و 1.6 خلية على مدار 20 دقيقة على التوالي. حدث التدحرج السريع الأولي للعدلات على الخلايا البطانية. بمجرد أن تلامس العدلات جلطة الصفائح الدموية ، تم تغيير سرعة التدحرج للعدلات على الجلطة الصفائحية الدموية بمدى 8.2 ميكرومتر في الثانية ويتم التوسط فيها من خلال تفاعل البكتين و psgl L واحد.

تمثل البيانات متوسط زائد أو ناقص ، وهو الخطأ المعياري لمتوسط 14 جلطة مختلفة في سبعة فئران من النوع البري بعد خمس دقائق من إصابة الليزر. يظل حجم الجلطة الصفائحية ثابتا نسبيا أثناء التصوير ، وتتدحرج العدلات على الجلطة وتلتصق بها. إشارة الفلورسنت من الصفائح الدموية المتداولة لا تكاد تذكر.

بالمقارنة مع ذلك من الجلطة الصفائح الدموية, بعد مشاهدة هذا الفيديو, يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد نظام المجهر داخل الحياة مع الفئران الحية, مما يسمح لك بتصور في الوقت الفعلي التفاعلات النمطية غير المتجانسة بين الصفائح الدموية والعدلات على البطانة المنشطة داخل الأوعية الدموية الدقيقة.