رواية خارج الحي الطريقة الثقافة لالجنينية القلب

الهدف العام من هذا الإجراء هو استئصال القلب الجنيني لزراعة خارج الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق استعادة قرن الرحم أولا من أنثى فأرة حامل. بعد ذلك ، يتم استرداد الجنين وإعداده للتشريح.

ثم يتم فتح جدار الصدر الجنيني لتصور القلب. أخيرا ، يتم استئصال القلب ووضعه في مزرعة تحتوي على مادة ماتريجيل مخففة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر قلبا حيا صحيا من خلال المشاهدة تحت مجهر المجال الساطع.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى مثل الثقافات الهزازة ، هي أنه يمكن علاج القلب إما بعوامل محلية مثل البروتين المترافق مع الخرزة ، أو بعوامل عالمية ، مثل إضافة جزيء صغير إلى matrigel. الآثار المترتبة على هذه التقنية ، تمتد نحو علاج أمراض القلب والأوعية الدموية لأنها تسمح بفحص الأحداث داخل أجزاء متخصصة من القلب في سياق العضو السليم بأكمله. بعد القتل الرحيم لفأر حامل في الوقت المناسب في اليوم الجنيني المطلوب ، باستخدام تقنية معتمدة من قبل معهدك ، قم برش الأنثى بكمية 70٪ من الإيثانول قبل فتح تجويف البطن واستعادة قرن الرحم واستئصاله.

ضع قرن الرحم في طبق بتري يحتوي على طبق بارد XPBS واشطفه. ضع الطبق على الثلج حتى يصبح جاهزا للتشريح. ثم افتح قرن الرحم عبر خط الوسط لفضح الأكياس الجنينية المرفقة.

اقطع كيسا جنينيا وضع جنينا في طبق بتري ثان مع PBS بارد. ضع الطبق مع قرن الرحم على الثلج. بعد قطع رأس الجنين ، ضع الجنين على ظهره واقطعه.

افتح جدار الصدر لتصور القلب والرئتين. اعتمادا على المرحلة ، قد يكون جدار الصدر شفافا. إذا كان سيتم إجراء التنميط الجيني ، فاحفظ ذيل الجنين.

باستخدام الملقط ، ارفع القلب بعناية واقطع الأوعية السفلية. ثم اقطع فوق الأوعية الكبيرة لتحرير القلب. إذا لزم الأمر ، قم بإزالة الأنسجة الدخيلة.

ضع القلب في بئر واحد من طبق 24 جيدا مليء ب PBS البارد والجلوس على الثلج. كرر التشريح لعزل جميع القلوب الجنينية. في غطاء التدفق الرقائقي ، امزج بين جل ماتري البارد ووسط الثقافة المطلوب بنسبة واحد إلى واحد مع الحفاظ على جل ماتري المخفف على الثلج.

ماصة 500 إلى 1000 ميكرولتر من المحلول في آبار ثقافة 24 بئر. طبق ذلك على الثلج. اختر القلوب المقطوعة بعناية وضعها في الآبار الفردية لطبق الاستزراع الذي يحتوي على matrigel.

إذا كان اتجاه القلب المدمج أمرا بالغ الأهمية ، فاستخدم 70٪ من الإيثانول لرش المجهر المقلوب والمساحة المحيطة به. ثم بعد العمل في غطاء المحرك لوضع القلب في بئر حصيرة هلام على الجليد. ضع اللوحة على مرحلة المجهر وقم بتوجيه القلب بسرعة حيث يبدأ جل الحصيرة في التصلب.

ضع طبق الاستزراع في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واترك جل ماتري يتماسك لمدة 30 دقيقة تقريبا. أضف ملليلترا واحدا من الثقافة الدافئة مسبقا ، متوسطة لكل بئر تحتوي على قلب. يمكن أن تبقى القلوب في الثقافة لمدة أربعة أيام على الأقل.

إذا رغبت في ذلك ، أضف قالب خلية حية فلورية ، مثل cyto 16. لتصور القلب الحي ، سيقتصر التصوير الفوتوغرافي على جانب القلب المرئي بناء على الموضع الذي تم تضمينه فيه. إذا تم إجراء تصوير أو تقسيم كامل للتثبيت ، فقم بإزالة وسط الثقافة.

استبدله بفورمالديهايد بارد 4٪ ، وضع الطبق على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد أن يذوب matrigel ، استبدل المثبت والماتريجيل بالفورمالديهايد الطازج وقم بإصلاح القلوب طوال الليل عند أربع درجات مئوية. اغسل القلوب باستخدام PBS أو Triss واحفظها على أربع درجات مئوية حتى مزيد من التحليلات.

عند استزراعها خارج الجسم الحي لمدة 24 ساعة ، تبدو الأوعية الدموية التاجية مشابهة للقلب الذي تم استئصاله من جنين مماثل العمر تم الاحتفاظ به في الرحم كما هو موضح هنا. يوضح تحليل Hemat و toin و eoin للقلوب المستقرة في E 16.5 واستزراعها خارج الجسم الحي لمدة أربعة أيام أن التشكل العام ، بما في ذلك جدران الشرايين الكبيرة وعضلة القلب الحاجز البطيني والبطيني في القلب لا يزال سليما على الرغم من نقص الدورة الدموية. تظهر عظم الشريان التاجي كما هو موضح في رأس السهم.

ومع ذلك ، فإن تجزئة الحمض النووي المشار إليها بالسهام والتي لوحظت مع كل من h و d و DAPI واضحة في عضلة القلب المضغوطة وحول الأوعية الكبيرة. علاوة على ذلك ، فإن عضلة القلب أقل كثافة مقارنة بقلب من جنين E 18.5 الذي تطور في الرحم على الرغم من أن القلب المزروع خارج الجسم الحي كان لا يزال ينبض. وبالتالي ، هناك قيود على طول الفترة الزمنية أو المرحلة التي يمكن فيها الحفاظ على هذه القلوب.

يمكن أيضا استخدام تقنية الاستزراع هذه لتسمية القلوب بالفلورسنت بينما في الثقافة بعد الحضانة باستخدام صبغة فلورية بطانة محددة ، يتم زراعة القلوب لمدة 48 ساعة. في هذه الحالة ، يكون التصور محدودا بناء على اتجاه القلب وعتامة الأنسجة. تؤكد الأقسام النسيجية اللاحقة من خلال عضلة القلب البطينية أن cyto 16 يمكن أن يخترق طبقات الخلية الخارجية لتسمية الأوعية النخابية الفرعية داخل البطينين ويتوطين مع هو selectin كما هو موضح هنا بعد زراعة خارج الجسم الحي لمدة 30 ساعة ، يظهر القلب المستأصل من جنين E 14.5 انقباضا ثابتا وتيرة بين الأذينين والبطينين.

عند تنفيذ هذه التقنية ، من المهم أن تكون لطيفا وحذرا عند استئصال القلب. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استئصال واستزراع قلب الفأر الجنيني.