رواية عالية الدقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على صور عالية الدقة لخلايا مفردة من الخلايا السلفية المشتقة من نخاع العظم، وذلك لتتبع أنماط تجنيدها إلى الأوعية الدموية في الدماغ الطبيعي والأوعية المرتبطة بأورام الدماغ بمرور الوقت. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة عظم الظنبوب وعظم الفخذ من الفئران المانحة للحصول على خلايا سلفية فلورية من نخاع العظم، ومن ثم حقن هذه الخلايا في فئران مستقبلة تعرضت للإشعاع. تتمثل الخطوة الثانية في توليد طعوم غريبة من الورم الأرومي الدبقي (GBM) داخل القحف في الفئران الخيمرية داخل غرفة نافذة قحفية.

بعد ذلك، تخضع الفئران لمجموعة متنوعة من أنظمة العلاج بما في ذلك الإشعاع الموجه بالتوجيه المجسم. وتتمثل الخطوة النهائية في تصوير الفئران باستخدام مجهر بؤري ثنائي الفوتون. وفي نهاية المطاف، يمكن استخدام هذه المنهجية لدراسة آليات التوعي داخل الجمجمة ديناميكيًا في مجموعة متنوعة من النماذج.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الفحص الهيستوباثولوجي للأنسجة خارج الجسم، في قدرتنا على دراسة المعلومات الديناميكية الحرجة المتعلقة بتكوّن الأوعية في الدماغ. وبناءً على ذلك، يمكننا الإجابة على تساؤلات جوهرية تحيط بآليات تكوّن الأوعية الدموية الجديدة داخل القحف. وعلى الرغم من إمكانية استخدام هذه الطريقة لتقديم رؤى حول تكوّن الأوعية الدموية الجديدة داخل القحف، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة وعمليات مرضية أخرى في الدماغ، مثل نقص التروية داخل القحف أو السكتة الدماغية، والأمراض التنكسية العصبية، وآليات انتقال الخلايا الورمية إلى الدماغ.

لأغراض هذا الفيديو، تعذر علينا اتباع تقنية التعقيم الصارمة. وبناءً على ذلك، فإن فتحة غطاء السلامة البيولوجية تزيد عن 12 بوصة، كما أن الحيوانات غير مغطاة بالستائر الجراحية، وذلك لإتاحة صورة أوضح للمشاهد وتسهيل التعرف على توجيهات الإجراءات الخاصة بالعمل التجريبي. يجب اتباع تقنية التعقيم بدقة.

ابدأ هذا الإجراء بالتأكد من التعبير الفلوري للفأر المانح لـ GFP، ثم قم بقتله رحيمًا وفقًا لإرشادات لجنة رعاية الحيوان المؤسسية. بعد ذلك، قم بتنظيف كلا الطرفين الخلفيين واستخرج عظم الظنبوب وعظم الفخذ أثناء العمل في ظروف معقمة. قم بإزالة جميع الأنسجة الزائدة من العظام.

ثم قم بإزالة الصفائح الطرفية من كلا طرفي العظام الأربع المستخرجة. اغسلها باستخدام إبرة عيار 22 و 1 mL من PBS المعقم. ستصبح العظام شفافة بمجرد غسل نخاع العظام بالكامل.

بعد ذلك، اخلط معلق نخاع العظم المستخلص. يجب أن يحتوي المعلق على 20 million خلية تقريبًا، وهو ما يكفي لإعادة بناء نخاع العظم لثلاثة فئران مستقبلة. بعد ذلك، جهز 3 إبر توبيركولين بمقاس 27 gauge واسحب 300 µL من معلق نخاع العظم في كل منها.

بينما يكون الفأر في وضعية التثبيت، قم بوضع علامة على السطح الظهري للذيل لتحديد الاتجاه. بعد ذلك، احقن المعلق في الوريد الجانبي للذيل لثلاثة من الفئران التي سبق تعريضها للإشعاع.

يتم استخدام فئران Nod skid في هذا الإجراء بالعمل تحت ظروف معقمة. قم بتخدير فئران Nod skid الكيميرية ذات نخاع العظم، وقم بإعطاء مسكنات الألم الوقائية المعتمدة من iacuc. ضع جل الدموع لمنع جفاف القرنية.

نظف الرأس أولاً بمحلول Betadine، ثم بالكحول وقم بإزالة الشعر الزائد. بعد ذلك، قم بتنظيف فروة الرأس الأساسية بشكل إضافي باستخدام الكحول. قم بإجراء شق جراحي من منتصف الأذنين وصولاً إلى المنطقة التي تعلو العينين مباشرة.

قم بإزالة فروة الرأس من كلا جانبي الشق الأول للكشف عن حوالي 5 mm من الجمجمة الكامنة. بعد ذلك، حدد المعالم التشريحية لسطح الجمجمة. ثم قم بتحديد السمحاق ورفعه عن طريق حقن محلول lidocaine بتركيز 2% مع epinephrine.

بعد ذلك، قم بتشريح السمحاق وفصله عن سطح الجمجمة باستخدام أداة حادة. ثم استخدم مثقاب TR refine بقطر 2.7 millimeter لإضعاف سديلة عظمية دائرية بقطر 2.7 millimeter في نصف الكرة الأيمن من الجمجمة على مسافة متساوية من كل من Lambda و bgma. لا تخترق العظم بالمثقاب من أجل حماية الأم الجافية والأنسجة الموجودة أسفلها.

الآن، قم بإزالة السديلة العظمية الضعيفة باستخدام أدوات التشريح والملقط والخطاف السني بقوة مدروسة ومنضبطة. بعد ذلك، املأ حقنة Hamilton عيار 30 بـ 10 µL من معلق الخلايا وثبّت الإبرة على الإطار المجسم. ثم ضع الفأر على الإطار المجسم.

قم بمحاذاة الإبرة مع النقطة المركزية للنافذة الناتجة، ثم اخفض الإبرة حتى تلامس السطح القشري. بعد ذلك، قم بإعادة ضبط الإحداثيات الرقمية. الآن، اخفض الإبرة بمقدار 3.2 millimeters داخل النسيج القشري.

بعد ذلك، يتم سحب الإبرة بمقدار 0.2 millimeters ثم الحقن على عمق ثلاثة millimeters. يجب إجراء الحقن العميق بمعدل 10 microliters في الدقيقة. وعند اكتمال عملية الحقن، تُترك الإبرة في مكانها لمدة دقيقة واحدة قبل سحبها ببطء.

ثم قم بإزالة الفأر من الإطار. بعد ذلك، حافظ على ترطيب سطح الدماغ باستخدام قطرات من PBS المعقم.

ضع غطاءً زجاجياً بسمك 3 mm على سطح الدماغ لإغلاق النافذة التي يبلغ قطرها 2.7 mm. ثم جفف عظام الجمجمة المحيطة. بعد ذلك، ضع غراء vet bond لصق أنسجة فروة الرأس بعظمة الجمجمة وتثبيت الغطاء الزجاجي في مكانه.

تجنب وضع كمية زائدة لأنها ستتسرب أسفل الزجاج وتقلل من جودة التصوير. بعد ذلك، اخلط مسحوق الأكريليك السني والمحلول الطازج داخل خزانة سحب الغازات، ثم ضع الخليط فوق الرابط البيطري (vet bond) باستخدام إبرة قياس 22. ولضمان إحكام الغلق، ضع الأكريليك بحيث يتداخل قليلاً مع حافة غطاء الشريحة الزجاجية، ولكن دون أن يغطي الغطاء الزجاجي نفسه.

في هذه الخطوة، يتم وضع فأر مخدّر في مثبت رأس مخصص داخل جهاز التشعيع التجسيمي XAD 2 25 المصمم داخلياً. يتم إجراء مسح مقطعي محوسب بالحزمة المخروطية (cone beam CT) بزاوية 360 درجة، مع تشغيل أنبوب الأشعة السينية بجهد ذروة يبلغ 40 peak kilo voltage وتيار قدره 0.05 milliamps عبر مرشح ألومنيوم بسمك 2 millimeter. تُستخدم الصورة الناتجة لضبط وضعية المنصة بحيث يتم توجيه المركز المتساوي الإشعاعي (ISO center) نحو النصف الأيمن من الدماغ ويكون مركزياً في الاتجاه الظهري البطني.

تتوفر مجموعة واسعة من الموازيات (collimators) لتوجيه الإشعاع، مما يبرهن على مرونة هذا النموذج. وفي هذه الحالة، نستخدم موازياً بأبعاد 8 millimeter × 11 millimeter للإشعاع نصف الكروي. قم بتركيب الموازي نصف الكروي في جهاز الإشعاع المجسم X RAD 2 25.

احصل على صور CT متعامدة مفردة من الأعلى والأسفل عبر الموازِي لضمان التموضع الصحيح للرأس، وذلك بتحديد البنى العظمية التشريحية والضبط الدقيق اليدوي لموضع المنصة على الشاشة. استبدل مرشح الألومنيوم في جهاز XAD 2 25 IRRADIATOR بمرشح معالجة نحاسي بسمك 0.93 millimeter. بعد ذلك، قم بتشغيل برنامج أنبوب الأشعة السينية بجهد ذروة 225 peak illa voltage وتيار 13 milliamps، وقم بإعطاء نصف جرعة الإشعاع من الأعلى في اتجاه AP.

أعِد القنطرة إلى الموضع السفلي وقدم النصف الثاني من جرعة الإشعاع من الأسفل في اتجاه خلفي أمامي (PA). في هذا الإجراء، قم بتخدير فأر النافذة داخل الجمجمة الذي تم إنشاؤه مسبقاً ونظف النافذة باستخدام بخاخ الكحول. قم بضبط القنوات في المجهر البؤري (confocal microscope) وفقاً لما تحدده الفلوروكرومات المدمجة في الفأر الخيمري الذي تم إنشاؤه.

بدلاً من ذلك، يمكن إعادة استخدام الإعدادات السابقة لتقليل التباين بين جلسات التصوير. قم بحقن أي علامات مطلوبة للتصوير في الوريد الذيلي الجانبي، وفي هذه الحالة، يتم حقن dextran لتصوير الأوعية الدموية. ضع الفأر مقلوباً على مثبت الرأس المصمم خصيصاً، مع تدعيمه بالبلاستيسين القابل للتشكيل، مع التأكد من أن الرأس متعامد مع الليزر، ثم ضع المثبت بشكل مسطح على منصة المجهر المتحركة.

قم بتشغيل ليزر القناة الأولى ووضعه في مركز النافذة داخل القحف من خلال النظر مباشرة إلى نقطة تقاطع شعاع الليزر على نافذة الغرفة. التقط صورة لكل قناة للنافذة بأكملها باستخدام عدسة 5x واستخدمها كخريطة للصور الأخرى ذات الدقة الأعلى باستخدام عدسات المدى الطويل 10x و 20x. يبرز هذا المخطط الأخطاء التقنية المرتبطة بالعملية الجراحية ويوضح التأثير الذي سيحدثه كل منها على الصور الناتجة.

سيظهر الهواء المحبوس تحت النافذة على شكل فقاعات في الصور. يكون تراكم الأكريليك على الزجاج ذاتي الفلورية في القناة الحمراء البعيدة، مما سيؤدي إلى حجب جزء من مجال الرؤية. وبالمثل، تظهر الأوساخ الموجودة على النافذة أثناء التصوير على شكل وميض ذاتي الفلورية في الصور.

حتى النافذة داخل القحف المثالية قد تواجه مشكلات بمجرد وضعها تحت المجهر؛ إذ تؤدي آثار التنفس إلى ظهور خطوط في الصور، بينما يؤدي الوضع غير الصحيح للفأر على الإطار إلى الحصول على صورة مجزأة. وبما أن الليزر يمر عبر جزء فقط من النسيج، فمن الممكن، من خلال معالجة الصور اللاحقة، إضافة قناة إضافية للخلايا الموسومة بـ CFP، حيث يمكن طرح صور GFP من صور CFP للكشف عن إشارة CFP الحقيقية.

بالإضافة إلى ذلك، ومن خلال الاستفادة من خاصية التألق الذاتي لتوليد التوافقي الثاني لألياف الكولاجين من النوع الرابع، يمكننا تصوير الغشاء القاعدي للأوعية الدموية. كما تتيح توفر خمس قنوات فلورية للمستخدم قدرًا كبيرًا من المرونة والقابلية للتكيف مع نموذج الانعكاس المبتكر الموصوف في هذه الورقة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم وضع المواد الخطرة المستخدمة أثناء العمليات الجراحية في الاعتبار.

كما أنه من الضروري توخي الدقة وإيلاء اهتمام خاص بالتفاصيل لضمان بقاء أنسجة الدماغ غير تالفة طوال فترة التصوير طويل الأمد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء فأر خيمري يحتوي على خلايا سلفية فلورية، وبالتالي تكون قادراً على التقاط صور عالية الدقة وفي الوقت الحقيقي للأوعية الدموية داخل الجمجمة بعد زرع الخلايا الورمية، سواء مع التدخل العلاجي أو بدونه.