الميكروسكوب المتلازم لتحليل الهيكلية 3D من التفاعلات الدينامية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات استخدام ضوء الفلورسنت المترابط وطريقة المجهر الإلكتروني بالتبريد من خلال تصوير جسيمات فيروس نقص المناعة البشرية الصغيرة الديناميكية التي تتفاعل مع خلايا هيلا المضيفة. يتم تحقيق ذلك عن طريق الطلاء الأول وزراعة خلايا الكعب على شبكة EM لمكتشف الذهب في طبق ثقافة زجاجي القاع وإصابة خلايا الكعب بجسيمات GFP المسماة فيروس نقص المناعة البشرية واحد. تتمثل الخطوة الثانية في جمع الصور البؤرية ثلاثية الأبعاد عالية السرعة للخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية ، وتحليل الصور عن طريق تتبع الجسيمات ثلاثية الأبعاد الآلي لديناميكيات الجسيمات المفردة بعد التزجيج.

العينة ، وهي نفس الجسيمات الفيروسية من بيانات تصوير الخلايا الحية في صور الفلورسنت بالتبريد لمزيد من تحليل التصوير المقطعي بالتبريد عالي الدقة 3D Electron. تتمثل الخطوة الأخيرة في جمع سلسلة إسقاط EM المائلة لجميع المواضع المحددة التي تحتوي على جسيمات فيروس نقص المناعة البشرية وإعادة بناء 3D toms باستخدام خوارزمية إسقاط خلفية مرجحة باستخدام برنامج imad. في نهاية المطاف ، يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري ثلاثي الأبعاد للخلايا الحية المترابطة ثلاثية الأبعاد والتصوير المقطعي عالي الدقة للإلكترون بالتبريد لتصور الحيود الديناميكي والجزيئات الفيروسية المحدودة وتفاعلاتها مع الخلايا المضيفة مباشرة.

يهدف عملنا إلى تطوير طريقة ارتباط تسمح بالتصور المباشر لأحداث الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية فقط من خلال الجمع بين الفلورسنت الحي مثل الفحص المجهري والفحص المجهري الفلوري بالتبريد والتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد بهذه الطريقة ، يمكن استخدام إشارات الخلايا الحية والفلورسنت بالتبريد لتوجيه أخذ العينات بشكل كبير في التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. علاوة على ذلك ، يمكن استكمال المعلومات الهيكلية التي تم الحصول عليها من التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد بالبيانات الوظيفية الديناميكية المتاحة من خلال تصوير نمط الحياة للأهداف المصنفة بالفلورسنت. الميزة الرئيسية لهذه التقنية أو الطريقة الحالية هي أن التصوير المتقدم ثلاثي الأبعاد لنمط الحياة عالي السرعة مع نهج التصوير المقطعي الإلكتروني المرجاني ثلاثي الأبعاد عالي الدقة يتم تطبيقه لدراسة الأحداث الديناميكية التي يصعب اكتشافها بطبيعتها ، مثل فيروس نقص المناعة البشرية من النوع الأول وتفاعلات الخلايا المضيفة في المرحلة المبكرة من الإصابة.

لإعداد الشبكة لتوهج ثقافة الخلية ، قم بتفريغ جانب الكربون من 200 شبكة R اثنتين على رقائق كمية ، شبكة مكتشف EM ذهبية أقل من 25 مللي أمبير لمدة 25 ثانية. قم بتغطية شبكة EM بالألياف nin عن طريق تعويم جانب الكربون لأسفل على قطرة 40 ميكرولتر من 50 ميكروغرام لكل مليلتر من محلول الألياف nin. اتركه في غطاء مزرعة الأنسجة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعتين لتطهير خلايا هيلا على الشبكة بكثافة اثنين في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل مليلتر في طبق ثقافة القاع الزجاجي.

في DMEM مع المكملات الغذائية المناسبة ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 18 ساعة تقريبا قبل الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية ، وإضافة متتبع الخلايا الفلورية إلى خلايا hela في طبق الثقافة الزجاجي القاع واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للسماح بامتصاص صبغة الفلورسنت ، اغسل الخلايا باستخدام PBS وأضف 50 ميكرولترا من الوسط الطازج الدافئ. ضع الطبق في حجرة الخلية الحية عند 37 درجة مئوية من مجهر ماسح ضوئي متحد البؤر للمجال المكتسح. نظرا لأن cryo EM يتطلب مناطق رقيقة نسبيا من العينة.

حدد حقول متعددة تحتوي على خلية واحدة إلى ثلاث خلية لكل مربع مع الخلايا بين مرحلتين من الانقسام عندما تكون أكثر انتشارا وقم بتخزين هذه المواضع بشكل مسطح باستخدام برنامج عنصر NIS للتصوير في المستقبل. بعد ذلك ، قم بإصابة الخلايا ب VSVG ، وجسيمات فيروس نقص المناعة البشرية الزائفة التي تحتوي على G-F-P-V-P-R وجزيئات الفيروس في أسفل البئر من الطبق ، مع الحرص على عدم إزعاج شبكة EM. نظرا لأن مواضع التصوير قد تم تحديدها بالفعل وتخزينها فور إضافة المتغيرات ، فإن المتغيرات تجمع صورا متحدة البؤر ثلاثية الأبعاد عالية السرعة بفاصل زمني في المواضع المحددة مسبقا لمدة 20 إلى 40 دقيقة.

مباشرة بعد تصوير الخلايا الحية متحد البؤر ، ضع طبق الثقافة على كتلة نحاسية مبردة بالثلج وانقله إلى غرفة تحضير عينات cryo EM. قم بتحميل شبكة EM على الملقط المتخصص ، وقم بمسح وسط الاستزراع المتبقي بسرعة باستخدام ورق الترشيح الذي يوضع على الفور على الشبكة للحصول على ميكرولتر من محلول حبة ذهبية 15 نانومتر ممزوج بكريات فلورية 0.2 ميكرون. تستخدم الكريات المجهرية الفلورية للمساعدة في الارتباط بين الفلورسنت والتبريد EM.

قم بتحميل الملقط على جهاز التزجيج للتجميد الغرق باستخدام معلمات النشاف المحسنة لتحقيق أفضل النتائج. لبدء إجراء الفحص المجهري الضوئي الفلوري بالتبريد ، قم بتوصيل خط غاز النيتروجين الجاف بغلاف يوضع فوق العدسة الموضوعية للحفاظ على دفء العدسة وخالية من الصقيع ، قم بتركيب مرحلة عينة مضان بالتبريد محلية الصنع على مجهر ضوئي مضان مقلوب. قم بتوصيل مدخل النيتروجين السائل لمرحلة عينة التبريد بعامل الضغط الذاتي وضع مخرج الحماية من فيضان النيتروجين السائل في حاوية مناسبة.

ضع شبكة العينة الرطبة المجمدة في خرطوشة عينة EM على الكتلة النحاسية ، وضع حلقة مشبك C مسبقة التبريد في الأعلى للحفاظ على الشبكة في مكانها. ضع الخرطوشة في الغرفة الداخلية للبحث في مرحلة التبريد وابحث عن نفس جزيئات الفيروس من بيانات تصوير الخلايا الحية. نظرا لأن شبكة EM تحتوي على فهرس ، فمن السهل توطين نفس الجسيم على الشبكة في كل من صور الخلايا الحية وصور التألق بالتبريد.

احصل على صور DIC ومضان بالتبريد في المواضع المحددة في ظل ظروف التبريد باستخدام مجهر ضوئي بعدسة موضوعية طويلة العمل. أثناء التصوير الفلوري بالتبريد ، تحقق بشكل دوري من مستوى النيتروجين السائل في مرحلة التبريد وأعد تعبئته بعامل مضغوط ذاتي حسب الحاجة للحفاظ على مرحلة العينة أقل من سالب 170 درجة مئوية للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. قم بتحميل شبكة العينة في محطة نقل التبريد لمجهر إلكتروني مزود بمسدس انبعاث ميداني في وضع البحث عن جرعة منخفضة بتكبير 140 ×.

حدد المناطق أو المربعات الشبكية التي تم فيها الحصول على صور التألق بالتبريد. سجل صورة EM للتكبير المنخفض للمنطقة المرتبطة واحفظ الموضع في ملف مسرحي ضمن وضع البحث عن جرعة منخفضة بتكبير 3,500 ×. أدخل بحثا عن فتحة موضوعية 100 ميكرون واحفظ جميع المواضع المرتبطة بإشارات GFP في ملف المرحلة الثانية.

قم بإعداد معلمات التصوير المقطعي للحصول على سلسلة الإمالة ، بما في ذلك نطاق زاوية الإمالة وجرعة الإلكترون وقيمة إلغاء التركيز البؤري ومخططات الإمالة. احصل على سلسلة إمالة لجميع المواضع المحفوظة لبدء هذا الإجراء. قم بتكوين النافذة الرئيسية بحيث يمكن ضبط عدة مراحل من حساب Tomo Graham أو اتباعها في وقت واحد ، وتعديل المعلمات الضرورية وتنفيذ البرامج المحددة التي تتطلبها كل خطوة معالجة.

في المرحلة النهائية، قم بإنشاء مكدس محاذاة بالكامل مع خطأ متبقي رئيسي أقل من 0.6 وأعد إنشاء Toms باستخدام خوارزمية إسقاط خلفية مرجحة. في Im mod لتوصيف السلوك الديناميكي لجزيئات الفيروس. تم تصوير خلايا هيلا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية عن طريق الفحص المجهري للخلايا الحية متحد البؤر عالية السرعة وتم تحليل حركات الجسيمات عن طريق تتبع الجسيمات ثلاثية الأبعاد الآلي.

في هذا الشكل التمثيلي ، تم تتبع جسيم فيروسي فلوري أخضر واحد يشير إليه رأس السهم الأصفر في مداخن متحد البؤر ثلاثية الأبعاد مع فاصل زمني مدته ثلاث دقائق بين الإطارات لتجنب الفاصل الزمني لعدة دقائق. يمكن أن يحدث ذلك بين جمع آخر صورة خلية حية متحدة البؤر والتجميد الغرق. تم تصميم وبناء مرحلة الفحص المجهري الضوئي الفلوري بالتبريد لتصوير العينات الرطبة المجمدة داخل خراطيش cryo EM.

على المجاهر الضوئية لوحة A تظهر فاعلا ذاتي الضغط مملوءا بالنيتروجين السائل الذي يستخدم لتبريد مرحلة عينة التبريد النحاسي. تظهر اللوحة B المنظر الداخلي العلوي لمرحلة عينة التبريد مع الإشارة إلى الغرفة الداخلية برأس السهم الأبيض. يتم وضع شبكة العينة على خرطوشة عينة E EM ، والتي تقع في وسط منصة كتلة نحاسية يشار إليها بالسهم الأسود.

تمت إضافة هذه المنصة للاستخدام مع المجاهر الإلكترونية غير القطبية. بمجرد تحميلها بشبكة العينة ، يتم نقل الخراطيش إلى الغرفة الداخلية لضوء تألق البكاء. تظهر لوحات الفحص المجهري C و D على التوالي خرطوشة العينة قبل وبعد وضع حلقة نحاسية للحفاظ على الشبكة في مكانها للاستخدام مع مجهر إلكتروني بالتبريد غير القطبي.

يتم توضيح فائدة الإجراء للفحص المجهري المتقدم لخلايا الحياة المترابطة والتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد من خلال التصور المباشر لجسيمات فيروس نقص المناعة البشرية V المصنفة بالفلورسنت والتي تتفاعل مع خلية الكعب المضيف. صورة DIC المسجلة بمرحلة الفحص المجهري للضوء بالتبريد الموضحة في اللوحة A متراكبة بصورة مضان بالتبريد للجسيمات الموسومة ب GFP الموضحة في اللوحة B. الألواح الحمراء C و D و E هي صور منخفضة الجرعة من cryo-EM للمنطقة تحتوي على جسيم فلوري محاط بدائرة في اللوحات B و C عند 140 × 3 و 500 × و 27 و 500 × على التوالي.

الجزء الداخلي في اللوحة E عبارة عن عرض مكبر تم تسجيله بعد الحصول على لوحات سلسلة الإمالة المقطعية ، تظهر FG و H ثلاث شرائح مقطعية بسمك أربعة نانومتر مفصولة بمسافة 21 نانومتر في الاتجاه Z. يشار إلى الوصلات بين الجسيم وغشاء الخلية المروحية بواسطة أسهم في كل من صورة الإسقاط في الأجزاء الداخلية واللوحة E والشرائح المقطعية. في اللوحات F و g.

لقد قدمنا مجموعة مباشرة من البروتوكولات لتوفير نهج مترابط متقدم لتحليل الفيروسات الديناميكية والتفاعلات المعقمة باستخدام التصوير الفلوري لخلايا الدهون متحد البؤر بفاصل زمني متبوعا بالتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الارتباط الدقيق والموثوق بين صورة الفلورسنت وصورة المجهر الإلكتروني أمر بالغ الأهمية للحصول على التصوير المقطعي الإلكتروني للغراب بنجاح. ستكون البيانات الموصوفة بهذا الإجراء مفيدة للعديد من التطبيقات التي تنطوي على عمليات خلوية ديناميكية في بيولوجيا الخلية مثل استيعاب مستقبلات سطح إشارات الخلية.