تحضير العينات النسيجية للمجهر الضوئي
علم الأنسجة هو دراسة الخلايا والأنسجة، والتي يتم الاستعانة فيها عادةً باستخدام المجهر الضوئي. يمكن أن تختلف عملية تحضير العينات النسيجية بشكل كبير بنا…
علم الأنسجة هو مصطلح يشير إلى دراسة التشريح المجهري للأنسجة والخلايا. ويعد التحضير النسيجي السليم للعينات المخصصة للمجهر الضوئي أمراً ضرورياً للحصول على نتائج عالية الجودة من عينات الأنسجة.
هناك 3 خطوات رئيسية مشتركة في جميع الإجراءات النسيجية تقريباً. أولاً، يتم تثبيت العينة من أجل حفظ النسيج وإبطاء عملية تحلله. بعد ذلك، تُغمر العينة في مادة، أو وسائط تطميس، تمتلك خصائص ميكانيكية مشابهة لخصائص العينة نفسها. وبمجرد إتمام عملية التطميس، يتم تقطيع العينة إلى شرائح رقيقة باستخدام أداة قطع دقيقة تُعرف باسم الميكروتوم. يصف هذا الفيديو هذه الخطوات العامة وبعض المفاهيم المتعلقة بها.
يعد تثبيت الأنسجة خطوة حاسمة تعمل على حفظ مكونات الخلايا والأنسجة والحفاظ على بنيتها. فبعد موت الخلية، تتحرر الإنزيمات الموجودة بشكل طبيعي من العضيات الخلوية وتبدأ في تفكيك البروتينات في جميع أنحاء الخلية والمصفوفة خارج الخلية، مما يؤدي إلى تدمير بنية الخلية. ويمنع التثبيت هذا التحلل عن طريق تثبيط قدرة هذه الإنزيمات على هضم البروتين بشكل مباشر وجعل مواقع انقسام الإنزيمات غير قابلة للتعرف عليها.
الآليتان الرئيسيتان للتثبيت هما الربط التشابكي والتخثير. يتضمن الربط التشابكي تكوين روابط تساهمية سواء داخل البروتينات أو بينها، مما يؤدي إلى تصلب الأنسجة وبالتالي مقاومة التحلل. أما التخثير فينتج عن نزع الماء من البروتينات باستخدام الكحولات أو الأسيتون، مما يؤدي إلى تشويه البنية الثالثية للبروتين، بحيث تنتقل المناطق الكارهة للماء، أو النافرة للماء، إلى سطح البروتين. ويمكن أن يساعد التثبيت بالتخثير في تغلغل أوساط الطمر، مثل شمع البارافين، داخل الأنسجة.
أحد أكثر المثبتات استخداماً هو الفورمالين، وهو عبارة عن فورمالدهيد مذاب في الماء. أثناء عملية التثبيت، يرتبط الفورمالدهيد بالأمينات الأولية، مثل تلك الموجودة في السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية لايسين وغلوتامين، لتكوين رابطة تشابكية مستقرة تسمى جسر الميثيلين. وتعتبر هذه العملية بطيئة بطبيعتها وقد تستغرق من 1-2 يوم.
يجب مراعاة بعض الاعتبارات قبل البدء في عملية التثبيت. أولاً، ضع في اعتبارك قدرة العينة على الانتشار. حيث تنتشر المثبتات لمسافة معينة عبر الأنسجة بمعدل يرتبط بمعامل الانتشار للمثبت مضروباً في الجذر التربيعي للزمن. فالمثبت الذي يستغرق ساعة واحدة للتغلغل لمسافة 1 mm داخل العينة سيستغرق 25 ساعة للتغلغل لمسافة 5 mm. وبمجرد وصول الفورمالين إلى مركز النسيج، يظل تفاعل الربط التشابكي بحاجة إلى الحدوث. لذا، يجب ألا يتجاوز سمك العينة 4 mm لضمان التثبيت الشامل في فترة زمنية معقولة.
ثانياً، ضع في اعتبارك حجم والرقم الهيدروجيني pH للمثبت. يجب أن تكون نسبة حجم المثبت إلى حجم العينة 40:1 على الأقل حتى لا ينفد الكاشف بسهولة بمرور الوقت. وبينما صُمم بعض المثبتات لتعمل عند pH حمضي، فإن الفورمالين يعمل بشكل أفضل عندما يكون مُنظماً بالفوسفات للحفاظ على pH متعادل، وذلك لتجنب إنتاج حمض زائد، والذي يتسبب في ظهور عيوب اصطناعية في الأنسجة.
الخطوة التالية في التحضير النسيجي هي الطمر، وهي تتضمن دعم العينات في وسائط ذات صلابة ميكانيكية مشابهة لصلابة العينة نفسها. ويعد اختيار وسط الطمر المناسب أمراً بالغ الأهمية، لأنه إذا كان صلباً جداً أو ضعيفاً جداً، فقد تحدث عيوب أثناء عملية التقطيع. وتعتبر شمع البارافين أكثر الوسائط استخداماً للطمر حتى الآن.
قبل الطمر بالبارافين، يجب تجفيف العينات عن طريق استبدال الماء في النسيج بالإيثانول أولاً، ثم بالكسيلين، وأخيراً بشمع البارافين الدافئ. وبمجرد تغلغل الشمع في العينة، يتم وضعها بعناية وإحاطتها بمزيد من الشمع باستخدام قالب لتكوين كتلة. بعد ذلك، يتم تثبيت العينات في كاسيت أنسجة لغرض التقطيع.
التقطيع هو عملية قص شرائح رقيقة من العينة الموجودة في كتلة الطمر. وعادة ما يتراوح سمك هذه المقاطع ما بين 4-10 µm لاستخدامها في المجهر الضوئي.
لقص المقاطع، يتم أولاً تثبيت شفرة معدنية أو زجاجية أو ماسية على الميكروتوم. ثم توضع العينة في حامل العينات. بعد ذلك، يتم دفع العينة نحو سطح القطع وسحبها عبر الشفرة لإنشاء شريحة بالسُمك المطلوب. ستتجمع المقاطع على شكل شرائط رقيقة يمكن وضعها على شرائح زجاجية.
بعد التقطيع، توضع العينات على الشرائح. وبالنسبة للعينات المطمرة بالبارافين، توضع الشرائح أولاً في حمام مائي دافئ، ثم تُرفع من الماء إلى الشريحة وتترك لتجف.
تتمتع الأنسجة البيولوجية بتباين ذاتي منخفض للغاية، لذا فإنه بعد إجراء الفحص النسيجي، تُصبغ الشرائح عادةً بصبغات أو أجسام مضادة تبرز المورفولوجيا أو بروتينات معينة. والصبغة الأكثر شيوعاً هي صبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين، أو H&E. ونظراً لشيوعها الكبير، تم تصنيع العديد من الأجهزة الآلية لصبغ مقاطع عديدة بصبغة H&E بشكل قابل للتكرار. يصبغ الهيماتوكسيلين نويات الخلايا باللون الأزرق، بينما يصبغ الإيوزين السيتوبلازم باللون الوردي، مما يكشف عن المورفولوجيا الخلوية للأنسجة.
أحد عيوب التثبيت هو أن التشابك البروتيني يمكن أن يجعل من الصعب على الأجسام المضادة الملحقة العثور على مواقع ارتباطها. وبدلاً من استخدام التثبيت لحفظ العينات، يمكن استخدام التجميد السريع للأنسجة، أو التجميد المفاجئ، والذي يليه تقنية تقطيع تسمى التقطيع بالتجميد (cryosectioning).
يتم غمر عينات الأنسجة وتوجيهها في وسط تجميد خاص يسمى OCT، أو وسط درجة حرارة القطع المثلى، ثم يتم تجميدها بسرعة. ومثل وسائط الغمر الأخرى، يتوافق OCT مع صلابة العينة.
يُستخدم الميكروتوم المجمد (cryomicrotome) أو الكرايوستات (cryostat) لقطع المقاطع المجمدة، ويحافظ هذا الجهاز على درجة حرارة داخلية تبلغ -20°C لإبقاء شفرة القطع والعينات باردة. وبخلاف المقاطع المغمورة في البارافين، يمكن نقل المقاطع المجمدة مباشرة إلى شريحة زجاجية مشحونة إيجابياً فور الانتهاء من التقطيع.
هناك طريقة أخرى لتجنب التثبيت وهي الغمر في الآجار، حيث تُغطى العينات بآجاروز سائل مُحضّر حديثاً. ومع تبريد الآجاروز، يتم تثبيت النسيج في مكانه، ويمكن تشذيب الآجاروز الزائد.
تمتلك أجهزة الفايبروتوم (Vibrotomes)، وهي بديل آخر للميكروتوم، شفرة تهتز وتتحرك عبر العينة المغمورة في الآجاروز. تُستخدم أجهزة الفايبروتوم لإنشاء مقاطع سميكة تتراوح ما بين 50-1000 µm من العينات المغمورة في الآجاروز.
عادةً ما يتم إخراج العينات من الآجاروز قبل الصبغ، ثم توضع على شريحة محاطة بمادة مثل شحم الفراغ (vacuum grease) الذي يمنع غطاء الشريحة من سحق العينة. ويُفضل فحصها باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy) من أجل الحصول على صور عالية الدقة لكل مقطع سميك.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول تحضير العينات النسيجية للفحص بالمجهر الضوئي.
يُفترض أنك أصبحت الآن مدركاً للخطوات المتبعة في تحضير العينات للوصول من قطعة نسيجية إلى مقطع قابل للصبغ. وكما هو الحال دائماً، نشكركم على المشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
علم الأنسجة هو مصطلح يشير إلى دراسة التشريح المجهري للأنسجة والخلايا. ويعد التحضير النسيجي السليم للعينات المخصصة للمجهر الضوئي أمراً ضرورياً للحصول على نتائج عالية الجودة من عينات الأنسجة.
هناك 3 خطوات رئيسية مشتركة في جميع الإجراءات النسيجية تقريباً. أولاً، يتم تثبيت العينة من أجل حفظ النسيج وإبطاء عملية تحلله. بعد ذلك، تُغمر العينة في مادة، أو وسائط تطميس، تمتلك خصائص ميكانيكية مشابهة لخصائص العينة نفسها. وبمجرد إتمام عملية التطميس، يتم تقطيع العينة إلى شرائح رقيقة باستخدام أداة قطع دقيقة تُعرف باسم الميكروتوم. يصف هذا الفيديو هذه الخطوات العامة وبعض المفاهيم المتعلقة بها.
يعد تثبيت الأنسجة خطوة حاسمة تعمل على حفظ مكونات الخلايا والأنسجة والحفاظ على بنيتها. فبعد موت الخلية، تتحرر الإنزيمات الموجودة بشكل طبيعي من العضيات الخلوية وتبدأ في تفكيك البروتينات في جميع أنحاء الخلية والمصفوفة خارج الخلية، مما يؤدي إلى تدمير بنية الخلية. ويمنع التثبيت هذا التحلل عن طريق تثبيط قدرة هذه الإنزيمات على هضم البروتين بشكل مباشر وجعل مواقع انقسام الإنزيمات غير قابلة للتعرف عليها.
الآليتان الرئيسيتان للتثبيت هما الربط التشابكي والتخثير. يتضمن الربط التشابكي تكوين روابط تساهمية سواء داخل البروتينات أو بينها، مما يؤدي إلى تصلب الأنسجة وبالتالي مقاومة التحلل. أما التخثير فينتج عن نزع الماء من البروتينات باستخدام الكحولات أو الأسيتون، مما يؤدي إلى تشويه البنية الثالثية للبروتين، بحيث تنتقل المناطق الكارهة للماء، أو النافرة للماء، إلى سطح البروتين. ويمكن أن يساعد التثبيت بالتخثير في تغلغل أوساط الطمر، مثل شمع البارافين، داخل الأنسجة.
أحد أكثر المثبتات استخداماً هو الفورمالين، وهو عبارة عن فورمالدهيد مذاب في الماء. أثناء عملية التثبيت، يرتبط الفورمالدهيد بالأمينات الأولية، مثل تلك الموجودة في السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية لايسين وغلوتامين، لتكوين رابطة تشابكية مستقرة تسمى جسر الميثيلين. وتعتبر هذه العملية بطيئة بطبيعتها وقد تستغرق من 1-2 يوم.
يجب مراعاة بعض الاعتبارات قبل البدء في عملية التثبيت. أولاً، ضع في اعتبارك قدرة العينة على الانتشار. حيث تنتشر المثبتات لمسافة معينة عبر الأنسجة بمعدل يرتبط بمعامل الانتشار للمثبت مضروباً في الجذر التربيعي للزمن. فالمثبت الذي يستغرق ساعة واحدة للتغلغل لمسافة 1 mm داخل العينة سيستغرق 25 ساعة للتغلغل لمسافة 5 mm. وبمجرد وصول الفورمالين إلى مركز النسيج، يظل تفاعل الربط التشابكي بحاجة إلى الحدوث. لذا، يجب ألا يتجاوز سمك العينة 4 mm لضمان التثبيت الشامل في فترة زمنية معقولة.
ثانياً، ضع في اعتبارك حجم والرقم الهيدروجيني pH للمثبت. يجب أن تكون نسبة حجم المثبت إلى حجم العينة 40:1 على الأقل حتى لا ينفد الكاشف بسهولة بمرور الوقت. وبينما صُمم بعض المثبتات لتعمل عند pH حمضي، فإن الفورمالين يعمل بشكل أفضل عندما يكون مُنظماً بالفوسفات للحفاظ على pH متعادل، وذلك لتجنب إنتاج حمض زائد، والذي يتسبب في ظهور عيوب اصطناعية في الأنسجة.
الخطوة التالية في التحضير النسيجي هي الطمر، وهي تتضمن دعم العينات في وسائط ذات صلابة ميكانيكية مشابهة لصلابة العينة نفسها. ويعد اختيار وسط الطمر المناسب أمراً بالغ الأهمية، لأنه إذا كان صلباً جداً أو ضعيفاً جداً، فقد تحدث عيوب أثناء عملية التقطيع. وتعتبر شمع البارافين أكثر الوسائط استخداماً للطمر حتى الآن.
قبل الطمر بالبارافين، يجب تجفيف العينات عن طريق استبدال الماء في النسيج بالإيثانول أولاً، ثم بالكسيلين، وأخيراً بشمع البارافين الدافئ. وبمجرد تغلغل الشمع في العينة، يتم وضعها بعناية وإحاطتها بمزيد من الشمع باستخدام قالب لتكوين كتلة. بعد ذلك، يتم تثبيت العينات في كاسيت أنسجة لغرض التقطيع.
التقطيع هو عملية قص شرائح رقيقة من العينة الموجودة في كتلة الطمر. وعادة ما يتراوح سمك هذه المقاطع ما بين 4-10 µm لاستخدامها في المجهر الضوئي.
لقص المقاطع، يتم أولاً تثبيت شفرة معدنية أو زجاجية أو ماسية على الميكروتوم. ثم توضع العينة في حامل العينات. بعد ذلك، يتم دفع العينة نحو سطح القطع وسحبها عبر الشفرة لإنشاء شريحة بالسُمك المطلوب. ستتجمع المقاطع على شكل شرائط رقيقة يمكن وضعها على شرائح زجاجية.
بعد التقطيع، توضع العينات على الشرائح. وبالنسبة للعينات المطمرة بالبارافين، توضع الشرائح أولاً في حمام مائي دافئ، ثم تُرفع من الماء إلى الشريحة وتترك لتجف.
تتمتع الأنسجة البيولوجية بتباين ذاتي منخفض للغاية، لذا فإنه بعد إجراء الفحص النسيجي، تُصبغ الشرائح عادةً بصبغات أو أجسام مضادة تبرز المورفولوجيا أو بروتينات معينة. والصبغة الأكثر شيوعاً هي صبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين، أو H&E. ونظراً لشيوعها الكبير، تم تصنيع العديد من الأجهزة الآلية لصبغ مقاطع عديدة بصبغة H&E بشكل قابل للتكرار. يصبغ الهيماتوكسيلين نويات الخلايا باللون الأزرق، بينما يصبغ الإيوزين السيتوبلازم باللون الوردي، مما يكشف عن المورفولوجيا الخلوية للأنسجة.
أحد عيوب التثبيت هو أن التشابك البروتيني يمكن أن يجعل من الصعب على الأجسام المضادة الملحقة العثور على مواقع ارتباطها. وبدلاً من استخدام التثبيت لحفظ العينات، يمكن استخدام التجميد السريع للأنسجة، أو التجميد المفاجئ، والذي يليه تقنية تقطيع تسمى التقطيع بالتجميد (cryosectioning).
يتم غمر عينات الأنسجة وتوجيهها في وسط تجميد خاص يسمى OCT، أو وسط درجة حرارة القطع المثلى، ثم يتم تجميدها بسرعة. ومثل وسائط الغمر الأخرى، يتوافق OCT مع صلابة العينة.
يُستخدم الميكروتوم المجمد (cryomicrotome) أو الكرايوستات (cryostat) لقطع المقاطع المجمدة، ويحافظ هذا الجهاز على درجة حرارة داخلية تبلغ -20°C لإبقاء شفرة القطع والعينات باردة. وبخلاف المقاطع المغمورة في البارافين، يمكن نقل المقاطع المجمدة مباشرة إلى شريحة زجاجية مشحونة إيجابياً فور الانتهاء من التقطيع.
هناك طريقة أخرى لتجنب التثبيت وهي الغمر في الآجار، حيث تُغطى العينات بآجاروز سائل مُحضّر حديثاً. ومع تبريد الآجاروز، يتم تثبيت النسيج في مكانه، ويمكن تشذيب الآجاروز الزائد.
تمتلك أجهزة الفايبروتوم (Vibrotomes)، وهي بديل آخر للميكروتوم، شفرة تهتز وتتحرك عبر العينة المغمورة في الآجاروز. تُستخدم أجهزة الفايبروتوم لإنشاء مقاطع سميكة تتراوح ما بين 50-1000 µm من العينات المغمورة في الآجاروز.
عادةً ما يتم إخراج العينات من الآجاروز قبل الصبغ، ثم توضع على شريحة محاطة بمادة مثل شحم الفراغ (vacuum grease) الذي يمنع غطاء الشريحة من سحق العينة. ويُفضل فحصها باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy) من أجل الحصول على صور عالية الدقة لكل مقطع سميك.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول تحضير العينات النسيجية للفحص بالمجهر الضوئي.
يُفترض أنك أصبحت الآن مدركاً للخطوات المتبعة في تحضير العينات للوصول من قطعة نسيجية إلى مقطع قابل للصبغ. وكما هو الحال دائماً، نشكركم على المشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is tissue fixation necessary in histological sample preparation?
Tissue fixation preserves cell and tissue structure by preventing degradation caused by naturally occurring enzymes released after cell death. Fixation inhibits enzyme activity and makes protein cleavage sites unrecognizable. The two main mechanisms are cross-linking, which forms covalent bonds to stiffen tissue, and coagulation, which dehydrates proteins using alcohols or acetone to deform their structure.
Q2: What are the two main mechanisms of tissue fixation?
Cross-linking involves covalent bond formation within and between proteins, causing tissue to stiffen and resist degradation. Coagulation dehydrates proteins through alcohols or acetone, deforming their tertiary structure so hydrophobic regions move to the protein surface. Coagulative fixation helps embedding media like paraffin wax penetrate tissue more effectively.
Q3: How does formalin work as a fixative in tissue preparation?
Formalin, formaldehyde dissolved in water, attaches to primary amines on amino acid side chains like lysine and glutamine, forming stable crosslinks called methylene bridges. This cross-linking process is inherently slow, requiring 1-2 days for completion. Formalin works best when buffered with phosphate to maintain neutral pH and prevent tissue artifacts.
Q4: What factors should be considered before tissue fixation begins?
Consider sample diffusivity: fixatives penetrate tissue at rates related to diffusion coefficient and time, so samples should be limited to 4 mm thickness for thorough fixation. Also consider fixative volume and pH. The fixative-to-sample ratio should be at least 40:1 to prevent reagent depletion. Formalin should be buffered with phosphate to maintain neutral pH and avoid tissue artifacts.
Q5: What is the purpose of embedding media in histological preparation?
Embedding media supports specimens with mechanical rigidity similar to the tissue itself. Paraffin wax is the most common embedding medium. Choosing appropriate embedding media is critical because media that is too stiff or too weak causes sectioning defects. Prior to paraffin embedding, samples must be dehydrated by replacing water with ethanol, then xylenes, and finally warmed paraffin wax.
Q6: How does cryosectioning differ from traditional paraffin-embedded sectioning?
Cryosectioning avoids fixation by rapidly freezing tissue in OCT (optimal cutting temperature) medium, then sectioning with a cryomicrotome maintained at -20°C. Unlike paraffin sections that require water bath treatment, frozen sections are directly lifted onto positively charged glass slides immediately after sectioning. This method preserves protein structure better for antibody labeling since cross-linking does not occur.
Q7: What are alternative embedding methods to paraffin wax?
Agar embedding covers samples with freshly prepared liquid agarose that locks tissue in place as it cools. Vibrotomes with vibrating blades cut thick sections of 50-1000 µm from agarose-embedded samples. Samples are typically removed from agarose before staining and mounted on slides with vacuum grease. Thick agarose sections are best viewed using light microscopy principle instrumentation and applications for high-resolution imaging.