تحضير العينات النسيجية للمجهر الضوئي

علم الأنسجة هو مصطلح يشير إلى دراسة التشريح المجهري للأنسجة والخلايا. ويعد التحضير النسيجي السليم للعينات المخصصة للمجهر الضوئي أمراً ضرورياً للحصول على نتائج عالية الجودة من عينات الأنسجة.

هناك 3 خطوات رئيسية مشتركة في جميع الإجراءات النسيجية تقريباً. أولاً، يتم تثبيت العينة من أجل حفظ النسيج وإبطاء عملية تحلله. بعد ذلك، تُغمر العينة في مادة، أو وسائط تطميس، تمتلك خصائص ميكانيكية مشابهة لخصائص العينة نفسها. وبمجرد إتمام عملية التطميس، يتم تقطيع العينة إلى شرائح رقيقة باستخدام أداة قطع دقيقة تُعرف باسم الميكروتوم. يصف هذا الفيديو هذه الخطوات العامة وبعض المفاهيم المتعلقة بها.

يعد تثبيت الأنسجة خطوة حاسمة تعمل على حفظ مكونات الخلايا والأنسجة والحفاظ على بنيتها. فبعد موت الخلية، تتحرر الإنزيمات الموجودة بشكل طبيعي من العضيات الخلوية وتبدأ في تفكيك البروتينات في جميع أنحاء الخلية والمصفوفة خارج الخلية، مما يؤدي إلى تدمير بنية الخلية. ويمنع التثبيت هذا التحلل عن طريق تثبيط قدرة هذه الإنزيمات على هضم البروتين بشكل مباشر وجعل مواقع انقسام الإنزيمات غير قابلة للتعرف عليها.

الآليتان الرئيسيتان للتثبيت هما الربط التشابكي والتخثير. يتضمن الربط التشابكي تكوين روابط تساهمية سواء داخل البروتينات أو بينها، مما يؤدي إلى تصلب الأنسجة وبالتالي مقاومة التحلل. أما التخثير فينتج عن نزع الماء من البروتينات باستخدام الكحولات أو الأسيتون، مما يؤدي إلى تشويه البنية الثالثية للبروتين، بحيث تنتقل المناطق الكارهة للماء، أو النافرة للماء، إلى سطح البروتين. ويمكن أن يساعد التثبيت بالتخثير في تغلغل أوساط الطمر، مثل شمع البارافين، داخل الأنسجة.

أحد أكثر المثبتات استخداماً هو الفورمالين، وهو عبارة عن فورمالدهيد مذاب في الماء. أثناء عملية التثبيت، يرتبط الفورمالدهيد بالأمينات الأولية، مثل تلك الموجودة في السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية لايسين وغلوتامين، لتكوين رابطة تشابكية مستقرة تسمى جسر الميثيلين. وتعتبر هذه العملية بطيئة بطبيعتها وقد تستغرق من 1-2 يوم.

يجب مراعاة بعض الاعتبارات قبل البدء في عملية التثبيت. أولاً، ضع في اعتبارك قدرة العينة على الانتشار. حيث تنتشر المثبتات لمسافة معينة عبر الأنسجة بمعدل يرتبط بمعامل الانتشار للمثبت مضروباً في الجذر التربيعي للزمن. فالمثبت الذي يستغرق ساعة واحدة للتغلغل لمسافة 1 mm داخل العينة سيستغرق 25 ساعة للتغلغل لمسافة 5 mm. وبمجرد وصول الفورمالين إلى مركز النسيج، يظل تفاعل الربط التشابكي بحاجة إلى الحدوث. لذا، يجب ألا يتجاوز سمك العينة 4 mm لضمان التثبيت الشامل في فترة زمنية معقولة.

ثانياً، ضع في اعتبارك حجم والرقم الهيدروجيني pH للمثبت. يجب أن تكون نسبة حجم المثبت إلى حجم العينة 40:1 على الأقل حتى لا ينفد الكاشف بسهولة بمرور الوقت. وبينما صُمم بعض المثبتات لتعمل عند pH حمضي، فإن الفورمالين يعمل بشكل أفضل عندما يكون مُنظماً بالفوسفات للحفاظ على pH متعادل، وذلك لتجنب إنتاج حمض زائد، والذي يتسبب في ظهور عيوب اصطناعية في الأنسجة.

الخطوة التالية في التحضير النسيجي هي الطمر، وهي تتضمن دعم العينات في وسائط ذات صلابة ميكانيكية مشابهة لصلابة العينة نفسها. ويعد اختيار وسط الطمر المناسب أمراً بالغ الأهمية، لأنه إذا كان صلباً جداً أو ضعيفاً جداً، فقد تحدث عيوب أثناء عملية التقطيع. وتعتبر شمع البارافين أكثر الوسائط استخداماً للطمر حتى الآن.

قبل الطمر بالبارافين، يجب تجفيف العينات عن طريق استبدال الماء في النسيج بالإيثانول أولاً، ثم بالكسيلين، وأخيراً بشمع البارافين الدافئ. وبمجرد تغلغل الشمع في العينة، يتم وضعها بعناية وإحاطتها بمزيد من الشمع باستخدام قالب لتكوين كتلة. بعد ذلك، يتم تثبيت العينات في كاسيت أنسجة لغرض التقطيع.

التقطيع هو عملية قص شرائح رقيقة من العينة الموجودة في كتلة الطمر. وعادة ما يتراوح سمك هذه المقاطع ما بين 4-10 µm لاستخدامها في المجهر الضوئي.

لقص المقاطع، يتم أولاً تثبيت شفرة معدنية أو زجاجية أو ماسية على الميكروتوم. ثم توضع العينة في حامل العينات. بعد ذلك، يتم دفع العينة نحو سطح القطع وسحبها عبر الشفرة لإنشاء شريحة بالسُمك المطلوب. ستتجمع المقاطع على شكل شرائط رقيقة يمكن وضعها على شرائح زجاجية.

بعد التقطيع، توضع العينات على الشرائح. وبالنسبة للعينات المطمرة بالبارافين، توضع الشرائح أولاً في حمام مائي دافئ، ثم تُرفع من الماء إلى الشريحة وتترك لتجف.

تتمتع الأنسجة البيولوجية بتباين ذاتي منخفض للغاية، لذا فإنه بعد إجراء الفحص النسيجي، تُصبغ الشرائح عادةً بصبغات أو أجسام مضادة تبرز المورفولوجيا أو بروتينات معينة. والصبغة الأكثر شيوعاً هي صبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين، أو H&E. ونظراً لشيوعها الكبير، تم تصنيع العديد من الأجهزة الآلية لصبغ مقاطع عديدة بصبغة H&E بشكل قابل للتكرار. يصبغ الهيماتوكسيلين نويات الخلايا باللون الأزرق، بينما يصبغ الإيوزين السيتوبلازم باللون الوردي، مما يكشف عن المورفولوجيا الخلوية للأنسجة.

أحد عيوب التثبيت هو أن التشابك البروتيني يمكن أن يجعل من الصعب على الأجسام المضادة الملحقة العثور على مواقع ارتباطها. وبدلاً من استخدام التثبيت لحفظ العينات، يمكن استخدام التجميد السريع للأنسجة، أو التجميد المفاجئ، والذي يليه تقنية تقطيع تسمى التقطيع بالتجميد (cryosectioning).

يتم غمر عينات الأنسجة وتوجيهها في وسط تجميد خاص يسمى OCT، أو وسط درجة حرارة القطع المثلى، ثم يتم تجميدها بسرعة. ومثل وسائط الغمر الأخرى، يتوافق OCT مع صلابة العينة.

يُستخدم الميكروتوم المجمد (cryomicrotome) أو الكرايوستات (cryostat) لقطع المقاطع المجمدة، ويحافظ هذا الجهاز على درجة حرارة داخلية تبلغ -20°C لإبقاء شفرة القطع والعينات باردة. وبخلاف المقاطع المغمورة في البارافين، يمكن نقل المقاطع المجمدة مباشرة إلى شريحة زجاجية مشحونة إيجابياً فور الانتهاء من التقطيع.

هناك طريقة أخرى لتجنب التثبيت وهي الغمر في الآجار، حيث تُغطى العينات بآجاروز سائل مُحضّر حديثاً. ومع تبريد الآجاروز، يتم تثبيت النسيج في مكانه، ويمكن تشذيب الآجاروز الزائد.

تمتلك أجهزة الفايبروتوم (Vibrotomes)، وهي بديل آخر للميكروتوم، شفرة تهتز وتتحرك عبر العينة المغمورة في الآجاروز. تُستخدم أجهزة الفايبروتوم لإنشاء مقاطع سميكة تتراوح ما بين 50-1000 µm من العينات المغمورة في الآجاروز.

عادةً ما يتم إخراج العينات من الآجاروز قبل الصبغ، ثم توضع على شريحة محاطة بمادة مثل شحم الفراغ (vacuum grease) الذي يمنع غطاء الشريحة من سحق العينة. ويُفضل فحصها باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy) من أجل الحصول على صور عالية الدقة لكل مقطع سميك.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول تحضير العينات النسيجية للفحص بالمجهر الضوئي.

يُفترض أنك أصبحت الآن مدركاً للخطوات المتبعة في تحضير العينات للوصول من قطعة نسيجية إلى مقطع قابل للصبغ. وكما هو الحال دائماً، نشكركم على المشاهدة!