علم الأنسجة هو مصطلح يشير إلى دراسة التشريح المجهري للأنسجة والخلايا. يعد التحضير المناسب للعينة النسيجية للفحص المجهري الضوئي أمرا ضروريا للحصول على نتائج عالية الجودة من عينات الأنسجة.
هناك 3 خطوات رئيسية مشتركة في جميع الإجراءات النسيجية تقريبا. أولا ، يتم إصلاح العينة ، من أجل الحفاظ على الأنسجة وإبطاء تدهور الأنسجة. بعد ذلك ، يتم غمر العينة في مادة ، أو وسائط تضمين ، لها خصائص ميكانيكية مماثلة لنفسها. بمجرد تضمينها ، يتم تقسيم العينة أو تقطيعها إلى شرائح رفيعة باستخدام أداة قطع دقيقة تعرف باسم microtome. يصف هذا الفيديو هذه الخطوات العامة وبعض المفاهيم المتعلقة بها.
يعد تثبيت الأنسجة خطوة حاسمة تحافظ على مكونات الخلايا والأنسجة وتحافظ على بنيتها. بعد موت الخلية ، يتم إطلاق الإنزيمات التي تحدث بشكل طبيعي من العضيات الخلوية وتبدأ في تحلل البروتينات في جميع أنحاء الخلية والمصفوفة خارج الخلية ، وبالتالي تدمير بنية الخلية. يمنع التثبيت مثل هذا التدهور عن طريق تثبيط قدرة هذه الإنزيمات بشكل مباشر على هضم البروتين وجعل مواقع انقسام الإنزيم غير معروفة.
الآليتان الرئيسيتان للتثبيت هما الربط المتبادل والتخثر. يتضمن الربط المتقاطع تكوين رابطة تساهمية داخل البروتينات وبينها ، مما يؤدي إلى تصلب الأنسجة وبالتالي مقاومة التدهور. يحدث التخثر بسبب جفاف البروتينات من خلال استخدام الكحول أو الأسيتون ، مما يؤدي إلى تشويه بنية البروتين الثلاثي ، بحيث تحرك المناطق الكارهة للماء ، أو التي تخشى الماء ، سطح البروتين. يمكن أن يساعد التثبيت التخثري في تضمين الوسائط ، مثل شمع البارافين ، في اختراق الأنسجة.
يعد الفورمالين أحد أكثر المثبتات استخداما ، وهو الفورمالديهايد المذاب في الماء. أثناء التثبيت ، يرتبط الفورمالديهايد بالأمينات الأولية ، مثل تلك الموجودة على السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية ليسين والجلوتامين لتشكيل رابط متقاطع مستقر يسمى جسر الميثيلين. هذه العملية بطيئة بطبيعتها ويمكن أن تستغرق ما يصل إلى 1-2 أيام.
قبل التثبيت ، يجب مراعاة بعض الاعتبارات. أولا ، ضع في اعتبارك انتشار العينة. سوف تنشر المثبتات مسافة عبر الأنسجة بمعدل متعلق بمعامل الانتشار للمثبت مضروبا في الجذر التربيعي للوقت. سيستغرق المثبت الذي يستغرق ساعة واحدة لاختراق 1 مم في العينة 25 ساعة لاختراق 5 مم. بمجرد وصول الفورمالين إلى مركز الأنسجة ، يجب أن تحدث عتبة تفاعل التشابك. وبالتالي ، يجب أن يقتصر حجم العينة على 4 مم في السماكة للتثبيت الشامل في فترة زمنية معقولة.
ثانيا ، ضع في اعتبارك حجم ودرجة الحموضة في المثبت. يجب أن تكون نسبة حجم المثبت إلى العينة 40: 1 على الأقل حتى لا يتم استنفاد الكاشف بسهولة بمرور الوقت. في حين أن بعض المثبتات مصممة للعمل بدرجة حموضة حمضية ، يعمل الفورمالين بشكل أفضل عند تخزينه بالفوسفات للحفاظ على درجة حموضة محايدة ، بحيث لا يتم إنتاج الحمض الزائد ، مما يسبب القطع الأثرية في الأنسجة.
الخطوة التالية في التحضير النسيجي هي التضمين ، والذي يتضمن دعم العينات في الوسائط التي لها صلابة ميكانيكية مماثلة للعينة نفسها. يعد اختيار وسيط التضمين الصحيح أمرا بالغ الأهمية ، لأنه إذا كان شديد الصلابة أو ضعيفا جدا ، فقد تحدث عيوب أثناء التقسيم. إلى حد بعيد ، فإن الوسائط الأكثر شيوعا المستخدمة للتضمين هي شمع البارافين.
قبل تضمين البارافين ، يجب تجفيف العينات عن طريق استبدال الماء الموجود في الأنسجة بالإيثانول ، أولا ، متبوعا بالزيلين ، ثم أخيرا شمع البارافين الدافئ. بمجرد أن يتسلل الشمع إلى العينة ، يتم وضعه بعناية وتحيط به بشمع إضافي باستخدام قالب لتشكيل كتلة. بعد ذلك ، يتم إرفاق العينات بشريط مناديل للتقسيم.
التقسيم هو عملية قطع شرائح رقيقة من عينة من كتلة التضمين. عادة ما تكون الأقسام بسمك 4-10 ميكرومتر للاستخدام مع الفحص المجهري الضوئي.
لقطع المقاطع ، يتم تثبيت شفرة معدنية أو زجاجية أو ماسية أولا على ميكروتوم. ثم يتم وضع العينة في حامل العينة. بعد ذلك ، يتم تقديم العينة إلى سطح القطع وسحبها عبر الشفرة لإنشاء شريحة بالسمك المطلوب. سوف تتراكم الأقسام على شكل شرائط رفيعة يمكن وضعها على شرائح زجاجية.
بعد التقسيم ، يتم وضع العينات على الشرائح. بالنسبة لعينات البارافين المضمنة ، يتم وضع الشرائح أولا في حمام مائي دافئ ثم يتم رفعها من الماء على الشريحة وتركها حتى تجف.
تحتوي الأنسجة البيولوجية على تباين ضئيل جدا ، لذلك بعد علم الأنسجة ، عادة ما تكون الشرائح ملطخة بالأصباغ أو الأجسام المضادة التي تسلط الضوء على التشكل أو بروتينات معينة. البقعة الأكثر شيوعا التي يتم إجراؤها هي الهيماتوكسيلين واليوزين ، أو H & E. نظرا لأنه شائع جدا ، فقد تم تصنيع العديد من الآلات الآلية لتلطيخ العديد من الأقسام بشكل متكرر باستخدام H & E. يلطخ الهيماتوكسيلين نوى الخلايا الزرقاء ويوزين يلطخ السيتوبلازم الوردي ويكشف عن التشكل الخلوي للأنسجة.
أحد عيوب التثبيت هو أن الارتباط المتبادل للبروتينات يمكن أن يجعل من الصعب على وضع العلامات على الأجسام المضادة للعثور على مواقع ارتباطها. بدلا من استخدام التثبيت للحفاظ على العينات ، يمكن استخدام التجميد السريع للأنسجة ، أو التجميد المفاجئ ، والذي يتبعه تقنية التقسيم تسمى التقطيع بالتبريد
يتم تضمين عينات الأنسجة وتوجيهها في وسائط تجميد خاصة تسمى OCT ، أو وسط درجة حرارة القطع المثلى ثم يتم تجميدها بسرعة. مثل وسائط التضمين الأخرى ، يطابق OCT صلابة العينة.
يتم استخدام ميكروتوم التبريد أو cryostate لقطع الأقسام المجمدة وتحافظ هذه الأداة على درجة حرارة داخلية تبلغ -20 درجة مئوية للحفاظ على برودة شفرة القطع والعينات. على عكس الأقسام المدمجة في البارافين ، يمكن رفع الأقسام المجمدة مباشرة على شريحة زجاجية موجبة الشحنة مباشرة بعد التقسيم.
هناك طريقة أخرى لتجنب التثبيت وهي تضمين الأجار ، حيث يتم تغطية العينات بأغروز سائل طازج. عندما يبرد الاغاروز ، فإنه يغلق الأنسجة في مكانها ويمكن تقليم الاغاروز الزائد.
الاهتزازات ، وهي بديل آخر للميكروتوم ، لها شفرة تهتز وتتحرك عبر العينة المضمنة في الاغاروز. تستخدم الاهتزازات لإنشاء أقسام سميكة في حدود 50-1000 ميكرومتر من عينات الاغاروز المدمجة.
عادة ما تتم إزالة العينات من الاغاروز قبل تلطيخها ، ثم توضع على شريحة محاطة بمادة مثل الشحم الفراغي الذي يمنع الغطاء من سحق العينة. من الأفضل عرضها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر من أجل الحصول على صور عالية الدقة لكل قسم سميك.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول إعداد العينة النسيجية للفحص المجهري الضوئي.
يجب أن تفهم الآن الخطوات المتبعة لإعداد العينة لتنقلك من قطعة من الأنسجة إلى قسم قابل للتلطيخ. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
علم الأنسجة هو دراسة الخلايا والأنسجة ، والتي عادة ما تساعدها باستخدام المجهر الضوئي. يمكن أن يختلف تحضير العينات النسيجية اختلافا كبيرا بناء على الخصائص المتأصلة في العينات مثل الحجم والصلابة بالإضافة إلى المعالجة اللاحقة المتوقعة التي تتضمن تقنيات التلوين المخطط لها أو غيرها من التطبيقات النهائية. كما هو موضح في هذا الفيديو ، يبدأ تحضير العينة عادة بإجراء تثبيت لمنع تدهور العينة بواسطة الإنزيمات التي تحدث بشكل طبيعي والتي تطلقها الخلايا عند الموت. بمجرد الإصلاح ، يتم وضع العينات في وسيط تضمين قادر على دعم العينة بشكل كاف. الأكثر شيوعا هو شمع البارافين ، ولكن يتم أيضا استخدام مواد أخرى مثل وسط التجميد القائم على الجلسرين والأجار لإحاطة العينة أثناء التقسيم. ثم يتم التقسيم على ميكروتوم أو جهاز قطع آخر يسمح للمستخدم بحلق العينة إلى شرائح رفيعة يتراوح سمكها من بضعة ميكرونات إلى بضعة ملليمترات. بمجرد القطع ، يتم تثبيت الأقسام على شريحة زجاجية وتلطيخها لإبراز ميزات محددة للعينة قبل تصويرها على المجهر.
علم الأنسجة هو مصطلح يشير إلى دراسة التشريح المجهري للأنسجة والخلايا. يعد التحضير المناسب للعينة النسيجية للفحص المجهري الضوئي أمرا ضروريا للحصول على نتائج عالية الجودة من عينات الأنسجة.
هناك 3 خطوات رئيسية مشتركة في جميع الإجراءات النسيجية تقريبا. أولا ، يتم إصلاح العينة ، من أجل الحفاظ على الأنسجة وإبطاء تدهور الأنسجة. بعد ذلك ، يتم غمر العينة في مادة ، أو وسائط تضمين ، لها خصائص ميكانيكية مماثلة لنفسها. بمجرد تضمينها ، يتم تقسيم العينة أو تقطيعها إلى شرائح رفيعة باستخدام أداة قطع دقيقة تعرف باسم microtome. يصف هذا الفيديو هذه الخطوات العامة وبعض المفاهيم المتعلقة بها.
يعد تثبيت الأنسجة خطوة حاسمة تحافظ على مكونات الخلايا والأنسجة وتحافظ على بنيتها. بعد موت الخلية ، يتم إطلاق الإنزيمات التي تحدث بشكل طبيعي من العضيات الخلوية وتبدأ في تحلل البروتينات في جميع أنحاء الخلية والمصفوفة خارج الخلية ، وبالتالي تدمير بنية الخلية. يمنع التثبيت مثل هذا التدهور عن طريق تثبيط قدرة هذه الإنزيمات بشكل مباشر على هضم البروتين وجعل مواقع انقسام الإنزيم غير معروفة.
الآليتان الرئيسيتان للتثبيت هما الربط المتبادل والتخثر. يتضمن الربط المتقاطع تكوين رابطة تساهمية داخل البروتينات وبينها ، مما يؤدي إلى تصلب الأنسجة وبالتالي مقاومة التدهور. يحدث التخثر بسبب جفاف البروتينات من خلال استخدام الكحول أو الأسيتون ، مما يؤدي إلى تشويه بنية البروتين الثلاثي ، بحيث تحرك المناطق الكارهة للماء ، أو التي تخشى الماء ، سطح البروتين. يمكن أن يساعد التثبيت التخثري في تضمين الوسائط ، مثل شمع البارافين ، في اختراق الأنسجة.
يعد الفورمالين أحد أكثر المثبتات استخداما ، وهو الفورمالديهايد المذاب في الماء. أثناء التثبيت ، يرتبط الفورمالديهايد بالأمينات الأولية ، مثل تلك الموجودة على السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية ليسين والجلوتامين لتشكيل رابط متقاطع مستقر يسمى جسر الميثيلين. هذه العملية بطيئة بطبيعتها ويمكن أن تستغرق ما يصل إلى 1-2 أيام.
قبل التثبيت ، يجب مراعاة بعض الاعتبارات. أولا ، ضع في اعتبارك انتشار العينة. سوف تنشر المثبتات مسافة عبر الأنسجة بمعدل متعلق بمعامل الانتشار للمثبت مضروبا في الجذر التربيعي للوقت. سيستغرق المثبت الذي يستغرق ساعة واحدة لاختراق 1 مم في العينة 25 ساعة لاختراق 5 مم. بمجرد وصول الفورمالين إلى مركز الأنسجة ، يجب أن تحدث عتبة تفاعل التشابك. وبالتالي ، يجب أن يقتصر حجم العينة على 4 مم في السماكة للتثبيت الشامل في فترة زمنية معقولة.
ثانيا ، ضع في اعتبارك حجم ودرجة الحموضة في المثبت. يجب أن تكون نسبة حجم المثبت إلى العينة 40: 1 على الأقل حتى لا يتم استنفاد الكاشف بسهولة بمرور الوقت. في حين أن بعض المثبتات مصممة للعمل بدرجة حموضة حمضية ، يعمل الفورمالين بشكل أفضل عند تخزينه بالفوسفات للحفاظ على درجة حموضة محايدة ، بحيث لا يتم إنتاج الحمض الزائد ، مما يسبب القطع الأثرية في الأنسجة.
الخطوة التالية في التحضير النسيجي هي التضمين ، والذي يتضمن دعم العينات في الوسائط التي لها صلابة ميكانيكية مماثلة للعينة نفسها. يعد اختيار وسيط التضمين الصحيح أمرا بالغ الأهمية ، لأنه إذا كان شديد الصلابة أو ضعيفا جدا ، فقد تحدث عيوب أثناء التقسيم. إلى حد بعيد ، فإن الوسائط الأكثر شيوعا المستخدمة للتضمين هي شمع البارافين.
قبل تضمين البارافين ، يجب تجفيف العينات عن طريق استبدال الماء الموجود في الأنسجة بالإيثانول ، أولا ، متبوعا بالزيلين ، ثم أخيرا شمع البارافين الدافئ. بمجرد أن يتسلل الشمع إلى العينة ، يتم وضعه بعناية وتحيط به بشمع إضافي باستخدام قالب لتشكيل كتلة. بعد ذلك ، يتم إرفاق العينات بشريط مناديل للتقسيم.
التقسيم هو عملية قطع شرائح رقيقة من عينة من كتلة التضمين. عادة ما تكون الأقسام بسمك 4-10 ميكرومتر للاستخدام مع الفحص المجهري الضوئي.
لقطع المقاطع ، يتم تثبيت شفرة معدنية أو زجاجية أو ماسية أولا على ميكروتوم. ثم يتم وضع العينة في حامل العينة. بعد ذلك ، يتم تقديم العينة إلى سطح القطع وسحبها عبر الشفرة لإنشاء شريحة بالسمك المطلوب. سوف تتراكم الأقسام على شكل شرائط رفيعة يمكن وضعها على شرائح زجاجية.
بعد التقسيم ، يتم وضع العينات على الشرائح. بالنسبة لعينات البارافين المضمنة ، يتم وضع الشرائح أولا في حمام مائي دافئ ثم يتم رفعها من الماء على الشريحة وتركها حتى تجف.
تحتوي الأنسجة البيولوجية على تباين ضئيل جدا ، لذلك بعد علم الأنسجة ، عادة ما تكون الشرائح ملطخة بالأصباغ أو الأجسام المضادة التي تسلط الضوء على التشكل أو بروتينات معينة. البقعة الأكثر شيوعا التي يتم إجراؤها هي الهيماتوكسيلين واليوزين ، أو H & E. نظرا لأنه شائع جدا ، فقد تم تصنيع العديد من الآلات الآلية لتلطيخ العديد من الأقسام بشكل متكرر باستخدام H & E. يلطخ الهيماتوكسيلين نوى الخلايا الزرقاء ويوزين يلطخ السيتوبلازم الوردي ويكشف عن التشكل الخلوي للأنسجة.
أحد عيوب التثبيت هو أن الارتباط المتبادل للبروتينات يمكن أن يجعل من الصعب على وضع العلامات على الأجسام المضادة للعثور على مواقع ارتباطها. بدلا من استخدام التثبيت للحفاظ على العينات ، يمكن استخدام التجميد السريع للأنسجة ، أو التجميد المفاجئ ، والذي يتبعه تقنية التقسيم تسمى التقطيع بالتبريد
يتم تضمين عينات الأنسجة وتوجيهها في وسائط تجميد خاصة تسمى OCT ، أو وسط درجة حرارة القطع المثلى ثم يتم تجميدها بسرعة. مثل وسائط التضمين الأخرى ، يطابق OCT صلابة العينة.
يتم استخدام ميكروتوم التبريد أو cryostate لقطع الأقسام المجمدة وتحافظ هذه الأداة على درجة حرارة داخلية تبلغ -20 درجة مئوية للحفاظ على برودة شفرة القطع والعينات. على عكس الأقسام المدمجة في البارافين ، يمكن رفع الأقسام المجمدة مباشرة على شريحة زجاجية موجبة الشحنة مباشرة بعد التقسيم.
هناك طريقة أخرى لتجنب التثبيت وهي تضمين الأجار ، حيث يتم تغطية العينات بأغروز سائل طازج. عندما يبرد الاغاروز ، فإنه يغلق الأنسجة في مكانها ويمكن تقليم الاغاروز الزائد.
الاهتزازات ، وهي بديل آخر للميكروتوم ، لها شفرة تهتز وتتحرك عبر العينة المضمنة في الاغاروز. تستخدم الاهتزازات لإنشاء أقسام سميكة في حدود 50-1000 ميكرومتر من عينات الاغاروز المدمجة.
عادة ما تتم إزالة العينات من الاغاروز قبل تلطيخها ، ثم توضع على شريحة محاطة بمادة مثل الشحم الفراغي الذي يمنع الغطاء من سحق العينة. من الأفضل عرضها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر من أجل الحصول على صور عالية الدقة لكل قسم سميك.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول إعداد العينة النسيجية للفحص المجهري الضوئي.
يجب أن تفهم الآن الخطوات المتبعة لإعداد العينة لتنقلك من قطعة من الأنسجة إلى قسم قابل للتلطيخ. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
علم الأنسجة هو مصطلح يشير إلى دراسة التشريح المجهري للأنسجة والخلايا. يعد التحضير المناسب للعينة النسيجية للفحص المجهري الضوئي أمرا ضروريا للحصول على نتائج عالية الجودة من عينات الأنسجة.
هناك 3 خطوات رئيسية مشتركة في جميع الإجراءات النسيجية تقريبا. أولا ، يتم إصلاح العينة ، من أجل الحفاظ على الأنسجة وإبطاء تدهور الأنسجة. بعد ذلك ، يتم غمر العينة في مادة ، أو وسائط تضمين ، لها خصائص ميكانيكية مماثلة لنفسها. بمجرد تضمينها ، يتم تقسيم العينة أو تقطيعها إلى شرائح رفيعة باستخدام أداة قطع دقيقة تعرف باسم microtome. يصف هذا الفيديو هذه الخطوات العامة وبعض المفاهيم المتعلقة بها.
يعد تثبيت الأنسجة خطوة حاسمة تحافظ على مكونات الخلايا والأنسجة وتحافظ على بنيتها. بعد موت الخلية ، يتم إطلاق الإنزيمات التي تحدث بشكل طبيعي من العضيات الخلوية وتبدأ في تحلل البروتينات في جميع أنحاء الخلية والمصفوفة خارج الخلية ، وبالتالي تدمير بنية الخلية. يمنع التثبيت مثل هذا التدهور عن طريق تثبيط قدرة هذه الإنزيمات بشكل مباشر على هضم البروتين وجعل مواقع انقسام الإنزيم غير معروفة.
الآليتان الرئيسيتان للتثبيت هما الربط المتبادل والتخثر. يتضمن الربط المتقاطع تكوين رابطة تساهمية داخل البروتينات وبينها ، مما يؤدي إلى تصلب الأنسجة وبالتالي مقاومة التدهور. يحدث التخثر بسبب جفاف البروتينات من خلال استخدام الكحول أو الأسيتون ، مما يؤدي إلى تشويه بنية البروتين الثلاثي ، بحيث تحرك المناطق الكارهة للماء ، أو التي تخشى الماء ، سطح البروتين. يمكن أن يساعد التثبيت التخثري في تضمين الوسائط ، مثل شمع البارافين ، في اختراق الأنسجة.
يعد الفورمالين أحد أكثر المثبتات استخداما ، وهو الفورمالديهايد المذاب في الماء. أثناء التثبيت ، يرتبط الفورمالديهايد بالأمينات الأولية ، مثل تلك الموجودة على السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية ليسين والجلوتامين لتشكيل رابط متقاطع مستقر يسمى جسر الميثيلين. هذه العملية بطيئة بطبيعتها ويمكن أن تستغرق ما يصل إلى 1-2 أيام.
قبل التثبيت ، يجب مراعاة بعض الاعتبارات. أولا ، ضع في اعتبارك انتشار العينة. سوف تنشر المثبتات مسافة عبر الأنسجة بمعدل متعلق بمعامل الانتشار للمثبت مضروبا في الجذر التربيعي للوقت. سيستغرق المثبت الذي يستغرق ساعة واحدة لاختراق 1 مم في العينة 25 ساعة لاختراق 5 مم. بمجرد وصول الفورمالين إلى مركز الأنسجة ، يجب أن تحدث عتبة تفاعل التشابك. وبالتالي ، يجب أن يقتصر حجم العينة على 4 مم في السماكة للتثبيت الشامل في فترة زمنية معقولة.
ثانيا ، ضع في اعتبارك حجم ودرجة الحموضة في المثبت. يجب أن تكون نسبة حجم المثبت إلى العينة 40: 1 على الأقل حتى لا يتم استنفاد الكاشف بسهولة بمرور الوقت. في حين أن بعض المثبتات مصممة للعمل بدرجة حموضة حمضية ، يعمل الفورمالين بشكل أفضل عند تخزينه بالفوسفات للحفاظ على درجة حموضة محايدة ، بحيث لا يتم إنتاج الحمض الزائد ، مما يسبب القطع الأثرية في الأنسجة.
الخطوة التالية في التحضير النسيجي هي التضمين ، والذي يتضمن دعم العينات في الوسائط التي لها صلابة ميكانيكية مماثلة للعينة نفسها. يعد اختيار وسيط التضمين الصحيح أمرا بالغ الأهمية ، لأنه إذا كان شديد الصلابة أو ضعيفا جدا ، فقد تحدث عيوب أثناء التقسيم. إلى حد بعيد ، فإن الوسائط الأكثر شيوعا المستخدمة للتضمين هي شمع البارافين.
قبل تضمين البارافين ، يجب تجفيف العينات عن طريق استبدال الماء الموجود في الأنسجة بالإيثانول ، أولا ، متبوعا بالزيلين ، ثم أخيرا شمع البارافين الدافئ. بمجرد أن يتسلل الشمع إلى العينة ، يتم وضعه بعناية وتحيط به بشمع إضافي باستخدام قالب لتشكيل كتلة. بعد ذلك ، يتم إرفاق العينات بشريط مناديل للتقسيم.
التقسيم هو عملية قطع شرائح رقيقة من عينة من كتلة التضمين. عادة ما تكون الأقسام بسمك 4-10 ميكرومتر للاستخدام مع الفحص المجهري الضوئي.
لقطع المقاطع ، يتم تثبيت شفرة معدنية أو زجاجية أو ماسية أولا على ميكروتوم. ثم يتم وضع العينة في حامل العينة. بعد ذلك ، يتم تقديم العينة إلى سطح القطع وسحبها عبر الشفرة لإنشاء شريحة بالسمك المطلوب. سوف تتراكم الأقسام على شكل شرائط رفيعة يمكن وضعها على شرائح زجاجية.
بعد التقسيم ، يتم وضع العينات على الشرائح. بالنسبة لعينات البارافين المضمنة ، يتم وضع الشرائح أولا في حمام مائي دافئ ثم يتم رفعها من الماء على الشريحة وتركها حتى تجف.
تحتوي الأنسجة البيولوجية على تباين ضئيل جدا ، لذلك بعد علم الأنسجة ، عادة ما تكون الشرائح ملطخة بالأصباغ أو الأجسام المضادة التي تسلط الضوء على التشكل أو بروتينات معينة. البقعة الأكثر شيوعا التي يتم إجراؤها هي الهيماتوكسيلين واليوزين ، أو H & E. نظرا لأنه شائع جدا ، فقد تم تصنيع العديد من الآلات الآلية لتلطيخ العديد من الأقسام بشكل متكرر باستخدام H & E. يلطخ الهيماتوكسيلين نوى الخلايا الزرقاء ويوزين يلطخ السيتوبلازم الوردي ويكشف عن التشكل الخلوي للأنسجة.
أحد عيوب التثبيت هو أن الارتباط المتبادل للبروتينات يمكن أن يجعل من الصعب على وضع العلامات على الأجسام المضادة للعثور على مواقع ارتباطها. بدلا من استخدام التثبيت للحفاظ على العينات ، يمكن استخدام التجميد السريع للأنسجة ، أو التجميد المفاجئ ، والذي يتبعه تقنية التقسيم تسمى التقطيع بالتبريد
يتم تضمين عينات الأنسجة وتوجيهها في وسائط تجميد خاصة تسمى OCT ، أو وسط درجة حرارة القطع المثلى ثم يتم تجميدها بسرعة. مثل وسائط التضمين الأخرى ، يطابق OCT صلابة العينة.
يتم استخدام ميكروتوم التبريد أو cryostate لقطع الأقسام المجمدة وتحافظ هذه الأداة على درجة حرارة داخلية تبلغ -20 درجة مئوية للحفاظ على برودة شفرة القطع والعينات. على عكس الأقسام المدمجة في البارافين ، يمكن رفع الأقسام المجمدة مباشرة على شريحة زجاجية موجبة الشحنة مباشرة بعد التقسيم.
هناك طريقة أخرى لتجنب التثبيت وهي تضمين الأجار ، حيث يتم تغطية العينات بأغروز سائل طازج. عندما يبرد الاغاروز ، فإنه يغلق الأنسجة في مكانها ويمكن تقليم الاغاروز الزائد.
الاهتزازات ، وهي بديل آخر للميكروتوم ، لها شفرة تهتز وتتحرك عبر العينة المضمنة في الاغاروز. تستخدم الاهتزازات لإنشاء أقسام سميكة في حدود 50-1000 ميكرومتر من عينات الاغاروز المدمجة.
عادة ما تتم إزالة العينات من الاغاروز قبل تلطيخها ، ثم توضع على شريحة محاطة بمادة مثل الشحم الفراغي الذي يمنع الغطاء من سحق العينة. من الأفضل عرضها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر من أجل الحصول على صور عالية الدقة لكل قسم سميك.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول إعداد العينة النسيجية للفحص المجهري الضوئي.
يجب أن تفهم الآن الخطوات المتبعة لإعداد العينة لتنقلك من قطعة من الأنسجة إلى قسم قابل للتلطيخ. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
Chapters in this video
0:00
Overview
1:05
Fixation of Tissue Samples
4:19
Embedding and Sectioning
6:12
Applications
9:01
Summary
Videos from this collection: