تنفيذ المشبك الحيوي مع المواصلة متشابك والاصطناعية في خلايا الشبكية العقدة ماوس

الهدف العام من التجربة التالية هو استقصاء تأثيرات التغيرات في النسبة والتوقيت النسبي للمدخلات المشبكية الاستثارية والتثبيطية على نشاط الارتفاع المفاجئ (spiking activity) في العصبونات، باستخدام خلايا العقد الشبكية كعصبونات نموذجية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تثبيت غشاء الجسم الخلوي لخلية عقدية في شبكية مثبتة بالكامل، باستخدام ماصة زجاجية مملوءة بمحلول داخل خلوي يشبه التركيب الأيوني الفسيولوجي وصبغة Lucifer yellow لتحديد النوع المورفولوجي للخلية كخطوة ثانية. وباستخدام تقنية التثبيت الديناميكي (dynamic clamp)، يتم حقن مجموعة من أشكال موجات الموصلية الاستثارية والتثبيطية في الجسم الخلوي، مما يؤدي إلى حدوث تغير في جهد الغشاء كاستجابة. بعد ذلك، يتم حقن أشكال موجات موصلية متنوعة تم الحصول عليها من تجارب فسيولوجية في ظروف ضابطة، أو في وجود عقاقير، في الجسم الخلوي من أجل الحصول على الاستجابات العصبونية المقابلة.

تظهر النتائج تأثيرات التغيرات في نسبة الاستثارة والتثبيط على نشاط إطلاق النبضات في خلايا العقد الشبكية، بناءً على حقن تيارات مكونة من موصلات استثارية وتثبيطية عبر تسجيلات التثبيت الديناميكي (dynamic clamp). وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تثبيت التيار أو تثبيت الجهد، في أنها توفر أداة تفاعلية يمكن من خلالها حقن النسبة والتوقيت النسبي للموصلات المشبكية الاستثارية والتثبيطية في العصبونات لاستقصاء التأثير على الاستجابات الخلوية. ويمكن لهذه المنهجية أن توفر رؤى حول وظيفة الدوائر الشبكية، بالإضافة إلى أي شبكات عصبونية أخرى في الجهاز العصبي المركزي.

ابدأ هذا الإجراء بتجهيز نظام إعادة التروية باستخدام 250 milliliters من وسط aims المؤكسج بالكربوكسي في الإعداد الفيزيولوجي الكهربائي. بعد ذلك، افرد طبقة رقيقة من شحم التفريغ بشكل متساوٍ على قاع غرفة التروية. أغلقها باستخدام شريحة غطاء وتأكد من أنها محكمة الإغلاق ضد الهواء.

بعد ذلك، ضع كمية صغيرة من الشحم على الطرفين العلوي والسفلي للغرفة. سيعمل الشحم على تثبيت الشبكة في مكانها ومنعها من الضغط بقوة زائدة على الشبكية. الآن، قم بتثبيت الغرفة على المنصة، ثم قم بمحاذاة الفتحتين بعد ذلك.

يتم التضحية بالحيوان عن طريق خلع الفقرات العنقية بعد تخديره باستخدام isof fluorine. يتم استئصال العينين بسرعة باستخدام مقص صغير منحني. تُغسل العينان جيداً باستخدام سائل خارج خلوي مؤكسج للقطط في بيكر صغير، ثم توضعان في طبق بتري مملوء بسائل خارج خلوي مؤكسج للقطط.

باستخدام المجهر التشريحي، اصنع فتحة إدخال باستخدام إبرة قياس 19 في القرنية على بعد حوالي مليمترين من الحافة في كلتا العينين. يجب تنفيذ هذه الخطوة المهمة بسرعة للسماح بعملية الأكسجة لكل من rein a. بعد ذلك، قم بإزالة إحدى القرنيات باستخدام مقص قزحية صغير عن طريق القص بشكل موازٍ لحافتها.

بعد ذلك، قم بإزالة القزحية والعدسة باستخدام ملقط دقيق وكرر الإجراءات للعين الأخرى. انقل كوب عين واحد إلى دورق يحتوي على محلول خارج خلوي مؤكسج بالكربوكس. باستخدام شفرة المشرط، اقطع كوب عين واحد إلى نصفين، ثم افصل الشبكية برفق عن الظهارة الصباغية باستخدام مسبار تشريح غير حاد أو عن طريق سحبها برفق.

بعد ذلك، أمسك حافة أنسجة الشبكية المنفصلة بالقرب من الـ aura serta باستخدام ملقط دقيق، وامسك الـ aura serta بملقط دقيق آخر. اسحبها باتجاه مركز الشبكية. هذه عملية دقيقة وقد تتطلب عدة محاولات.

في حال النجاح، سيتم إزالة الجسم الهدبي والخلط الزجاجي، وسيتم تقليل انحناء الشبكية. بعد ذلك، قم بتشذيب الحواف ثم انقل الشبكية إلى غرفة التروية بحيث تكون الخلايا العقدية متجهة للأعلى. ثبت النسيج في مكانه عن طريق وضع الشبكة فوق كرات الشحم.

احفظ النسيج المتبقي مع كوب العين الآخر في محلول خارج خلوي مؤكسج بـ carbox لاستخدامه لاحقاً، وقم بتثبيت غرفة التسجيل تحت مجهر رأسي. اضبط على الفور عملية التروية المستمرة للشبكية باستخدام محلول خارج خلوي مؤكسج بـ carbox بمعدل 3 إلى 5 mL/min عند درجة حرارة 35.5 °C، وتأكد من وضع قطب التأريض في مكانه. الآن، قم بتشغيل مصدر ضوء المجهر واضبط التركيز على أجسام خلايا العقد الشبكية باستخدام عدسة شيئية بقوة 40x.

حدد موقع مركز تثبيت الثقب من أجل التسجيل. في هذه الخطوة، قم بتثبيت ماصة زجاجية تتراوح مقاومتها بين خمس إلى ثماني ميجا أوم في حاملها، وحركها تحت المجهر باستخدام مناور مجهري (micromanipulator) تحت عدسة شيئية بقوة 40x. اخفض الماصة ببطء حتى تُحدث نقرة صغيرة على سطح الغشاء المحدد الداخلي.

قم بدفع الماصة للأمام بحذر حتى تلتقط كمية صغيرة من النسيج، ثم حركها للأعلى و/أو جانبيًا لتمزيق ثقب صغير لكشف أجسام خلايا العقدة العصبية. الآن املأ ماصة نظيفة بـ 8 إلى 10 µL من محلول داخل خلوي قائم على البوتاسيوم يحتوي على Lucifer yellow. أدخلها في الحامل المتصل بمرحلة الرأس الخاصة بالمضخم، وتأكد من غمر قطب كلوريد الفضة المكلور.

اختر خلية ذات جسم خلوي كبير. اخفض طرف الماصة ببطء مع تطبيق ضغط إيجابي لإحداث نقرة صغيرة على سطح الغشاء. ثم توقف عن الضغط وقم بتحريره للحصول على ختم جيجا (giga seal).

بمجرد تحقيق ختم الجيجا (giga seal)، يتم تطبيق ضغط سلبي بلطف لكسر الغشاء من أجل الوصول إلى تكوين تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (whole cell patch clamp). وتعد هذه العملية خطوة دقيقة؛ حيث يؤدي تطبيق ضغط سلبي زائد إلى جعل الاتصال غير محكم (leaky).

إذا كانت الكمية قليلة جداً، سيبقى الغشاء سليماً. وبمرور الوقت، سيمتلئ الخلية بـ Lucifer yellow، مما يسمح بتصور مورفولوجيا الخلية إذا كانت مستقرة. يجب أن يستمر هذا الإعداد لمدة 30 دقيقة أو أكثر.

قم الآن بإجراء اختبار الجهد والتيار من -75 millivolts إلى +35 millivolts بزيادة قدرها 10 millivolts باستخدام patch master، ثم انتقل إلى الاختبارات اللاحقة، وذلك فقط في حال وجود تيار صوديوم أكبر من 1 nano amp. بعد ذلك، افتح lab view وقم بتشغيل برنامج neuro acuma المكتوب خصيصاً لهذا الغرض.

اضبط عدد التكرارات على ثمانية. ثم اضبط جهود العكس للموصلات الاستثارية والتثبيطية عند صفر و-75 millivolts على التوالي. اختر زوجاً متطابقاً واحداً من الموصلات الاستثارية والتثبيطية للاختبار، وسيظهر أثر الموصلية الاستثارية باللون الأخضر وأثر الموصلية التثبيطية باللون الأحمر في اللوحة السفلية.

بعد ذلك، عُد إلى جهاز Patch Master واختر وضع تثبيت التيار (current clamp mode). قم بتحويل المضخم فوراً إلى وضع تثبيت التيار في برنامج NeuroAcuma، ثم اضغط على زر التسجيل.

ستظهر الاستجابة الخلوية مع دفقة لا لغوية من جهود الفعل في اللوحة العلوية. بعد ذلك، قم بحقن تيار في الخلية ذات الموصلية المنخفضة. أولاً، إذا لوحظت استجابة ضئيلة أو لم تلاحظ أي استجابة، فقم بزيادة التيار بزيادات صغيرة حتى ينتج استجابة قوية.

يمكن أن يؤدي حقن تيار مفرط إلى قتل الخلية. وبمجرد اكتمال الاختبارات، اختر زوجاً جديداً من أشكال موجات الموصلية وكرر الإجراءات لجميع أزواج الموصليات الفسيولوجية والاصطناعية.

بعد التسجيل، اسحب الماصة بعناية لضمان بقاء جسم الخلية سليمًا. بعد ذلك، قم بتثبيت النسيج فورًا باستخدام 4%para formaldehyde لمدة 30 دقيقة، يليه ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق بمحلول phosphate buffer بتركيز 0.1 molar، ثم يُحفظ في الثلاجة ويتم إجراء تلوين الأجسام المضادة في اليوم التالي أو خلال أسبوع عند الجاهزية. قم بالتلوين ضد الخلايا العقدية المملوءة بـ Lucifer yellow في درجة حرارة الغرفة باستخدام primary anti Lucifer yellow rabbit IgG بتخفيف واحد إلى 10,000 لمدة خمسة أيام.

ثم في اليوم السادس، وبعد ترك العينة طوال الليل مع الجسم المضاد الثانوي goat anti rabbit IgG، يتم إضافة تخفيف بنسبة 1 إلى 500. وفي النهاية، يتم تحضير مسحة رطبة للشبكية في وسط حفظ فلوري. ضع غطاء الشريحة وأحكم إغلاقه بطلاء الأظافر. التقط صوراً مجهرية بؤرية لخلايا المورفولوجيا باستخدام مجهر Leica SPECT two confocal.

فيما يلي استجابات خلية عقدية لحقن أشكال موجية من الموصلية الاستثارة والمثبطة، والتي تم الحصول عليها من تجارب الضبط الموضحة باللونين الأخضر والأحمر على التوالي. وهنا تظهر الاستجابات لحقن أشكال موجية من الموصلية تم تسجيلها بعد إضافة التترودوتوكسين إلى الحمام. وفيما يلي استجابات خلية عقدية أخرى لأزواج مختلفة من أشكال موجات الموصلية.

تم تغيير النسب بين الموصلية الاستثارية والموصلية التثبيطية من واحد إلى صفر ثم من واحد إلى اثنين. ومع زيادة درجة التثبيط، انخفضت استجابة الخلية، وفيما يلي استجابات خلية عقدية لنفس مستوى الاستثارة مع تغيير وقت بدء التثبيط. ويمثل Delta T الفرق الزمني بين بدء الموصلية التثبيطية والموصلية الاستثارية.

كلما قل تأخير التثبيط، أصبحت استجابة الخلية أضعف. يعد هذا الإجراء تقنية قوية تساعد في الكشف عن التفاعلات بين المدخلات المشبكية الاستثارية والتثبيطية التي تولد المخرجات العصبية.