تنفيذ المشبك الحيوي مع المواصلة متشابك والاصطناعية في خلايا الشبكية العقدة ماوس

الهدف العام من التجربة التالية هو التحقيق في تأثيرات التغيرات في النسبة والتوقيت النسبي للمدخلات المشبكية المثيرة والمثبطة على النشاط المتصاعد للخلايا العصبية باستخدام خلايا العقدة الشبكية كخلايا عصبية نموذجية. يتم تحقيق ذلك عن طريق ترقيع جسم الخلية لخلية عقدية في شبكية العين بأكملها ، باستخدام ماصة زجاجية مملوءة بمحلول داخل الخلايا يشبه التركيب الأيوني الفسيولوجي وأصفر لوسيفر لتحديد نوع الخلية شكليا كخطوة ثانية باستخدام المشبك الديناميكي ، يتم حقن مجموعة من أشكال موجات التوصيل المثيرة والمثبطة في جسم الخلية ، مما ينتج عنه تغيير في إمكانات الغشاء كرد فعل. بعد ذلك ، يتم حقن أشكال موجات التوصيل المختلفة التي تم الحصول عليها من التجارب الفسيولوجية في ظروف التحكم ، أو في وجود الأدوية في جسم الخلية من أجل الحصول على الاستجابات العصبية المقابلة.

تظهر النتائج آثار التغيرات في نسبة الإثارة والتثبيط على النشاط المتصاعد لخلايا العقدة الشبكية بناء على حقن التيارات المكونة من موصلات مثيرة ومثبطة عبر تسجيلات المشبك الديناميكية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل المشبك الحالي أو مشبك الجهد ، هي أنها توفر أداة تفاعلية يمكن من خلالها حقن النسبة والتوقيت النسبي للتوصيلات المشبكية المثيرة والمثبطة في الخلايا العصبية للتحقيق في التأثير على الاستجابات الخلوية. يمكن أن توفر هذه المنهجية نظرة ثاقبة على وظيفة دوائر الشبكية وكذلك أي شبكات عصبية أخرى في الجهاز العصبي المركزي.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق إعداد نظام إعادة التروية ب 250 مل من وسط الأهداف الكربوكسية المؤكسجة في الإعداد الفيزيولوجي الكهربي. بعد ذلك ، قم بتلطيخ طبقة رقيقة من الشحوم المفرغة بشكل موحد في قاع غرفة التروية. قم بإغلاقها بقلة غطاء وتأكد من أنها محكمة الإغلاق.

ثم ضع كمية صغيرة من الشحوم على الأطراف العلوية والسفلية للحجرة. سيثبت الشحم الشبكة في مكانها ويمنعها من الضغط بشدة على شبكية العين. الآن قم بتثبيت الغرفة على المنصة وقم بمحاذاة كلتا الفتحتين بعد ذلك.

التضحية بحيوان عن طريق خلع عنق الرحم بعد تخديره بالفلور. قم بإزالة عينيها بسرعة باستخدام مقص منحني صغير. اغسلها جيدا بسائل خارج الخلية المؤكسج للسيارة في دورق صغير ، وضعها في طبق بتري مملوء بسائل خارج الخلية المؤكسج للسيارة.

تحت مجهر التشريح ، قم بعمل ثقب إدخال باستخدام إبرة قياس 19 في القرنية على بعد حوالي ملليمترين من حافة كلتا العينين. يجب أن تكون هذه الخطوة المهمة سريعة للسماح بالأكسجين من كلا الحكم. بعد ذلك ، قم بإزالة قرنية واحدة باستخدام زوج صغير من مقص القزحية عن طريق القطع بالتوازي مع حافتها.

بعد ذلك ، قم بإزالة القزحية والعدسة باستخدام زوج من الملقط الدقيق وكرر الإجراءات للعين الأخرى. انقل كوب عين واحد إلى دورق يحتوي على محلول خارج الخلية المؤكسج في علبة السيارات. باستخدام شفرة المشرط ، قم بتقطيع كوب عين واحد إلى نصفين ، وافصل الشبكية برفق عن ظهارة الصباغ باستخدام مسبار تشريح حاد أو عن طريق سحبه برفق.

ثم أمسك حافة أنسجة الشبكية المنفصلة بالقرب من الهالة سيرتا بزوج من الملقط الناعم وامسك الهالة سيرتا بزوج آخر من الملقط الناعم. اسحبه نحو مركز شبكية العين. هذه عملية حساسة وقد تستغرق بضع محاولات.

إذا نجحت الهالة Serta ، إزالة الجسم الهدبي والخلط الزجاجي وتقليل انحناء شبكية العين. بعد ذلك ، قم بقص الحواف ثم انقل شبكية العين إلى غرفة التروية مع توجيه الخلايا العقدية لأعلى. امسك المنديل في مكانه عن طريق وضع الشبكة على كرات الشحوم.

احتفظ بالأنسجة المتبقية مع كوب العين الآخر في محلول خارج الخلية المؤكسج في صندوق السيارة لاستخدامه لاحقا ، قم بتركيب غرفة التسجيل تحت مجهر عمودي. اضبط على الفور التروية المستمرة لشبكية العين باستخدام محلول خارج الخلية المؤكسج بمعدل ثلاثة إلى خمسة ملليلتر في الدقيقة عند 35.5 درجة مئوية ، تأكد من وجود قطب التأريض في مكانه. الآن قم بتشغيل مصدر ضوء المجهر وتركيزه على أجسام الخلايا العقدية من خلال 40 × الهدف.

حدد موقع مركز حامل الفتحة للتسجيل. في هذه الخطوة ، قم بتثبيت ماصة زجاجية من خمسة إلى ثمانية ميجا أوم في حاملها وحركها تحت المجهر باستخدام مناور ميكروم تحت هدف 40 ×. اخفض الماصة ببطء حتى تتكون غمازة صغيرة على سطح الغشاء المحدد الداخلي.

ادفع الماصة بعناية إلى الأمام حتى تلتقط كمية صغيرة من الأنسجة ثم حركها لأعلى أو بشكل جانبي لتمزيق ثقب صغير لفضح أجسام الخلايا العقدية. الآن املأ ماصة نظيفة بثمانية إلى 10 ميكرولترات ، وهو محلول داخل الخلايا قائم على البوتاسيوم باللون الأصفر لوسيفر. أدخله في الحامل ، المتصل بمرحلة رأس مكبر الصوت ، وتأكد من غمر قطب كلوريد الفضة المكلور.

حدد خلية ذات جسم خلية كبيرة. اخفض طرف الماصة ببطء بضغط إيجابي لعمل غمازة صغيرة على سطح الغشاء. ثم توقف وحرر الضغط للحصول على ختم جيجا.

بمجرد تحقيق ختم جيجا ، قم بالضغط السلبي برفق لكسر الغشاء من أجل تحقيق تكوين مشبك رقعة الخلية بالكامل. هذا الإجراء هو خطوة حساسة. إذا تم تطبيق الكثير من الضغط السلبي ، يصبح الاتصال متسربا.

إذا كان قليلا جدا ، يظل الغشاء سليما. بمرور الوقت ، سيملأ لوسيفر الأصفر الخلية ، مما يسمح بتصور مورفولوجيا الخلية إذا كانت مستقرة. يجب أن يستمر هذا الإعداد لمدة 30 دقيقة أو أكثر.

الآن قم بإجراء اختبار الجهد الحالي من سالب 75 مللي فولت إلى موجب 35 مللي فولت كل 10 مللي فولت باستخدام التصحيح الرئيسي وانتقل إلى الاختبارات اللاحقة. فقط في حالة وجود تيار صوديوم أكبر من نانو أمبير واحد. بعد ذلك ، افتح عرض المختبر وقم بتنفيذ برنامج acuma العصبي المكتوب المخصص.

اضبط رقم التكرار على ثمانية. ثم اضبط إمكانات الانعكاس للتوصيليات المثيرة والمثبطة عند صفر وناقص 75 مللي فولت على التوالي. حدد زوجا واحدا مطابقا من الموصلات المثيرة والمثبطة للاختبار وسيظهر تتبع التوصيل الاستثاري الأخضر وتتبع التوصيل المثبط الأحمر في اللوحة السفلية.

بعد ذلك ، ارجع إلى التصحيح الرئيسي وحدد وضع المشبك الحالي. قم بتبديل مكبر الصوت على الفور إلى وضع المشبك الحالي في العزلة العصبية. اضغط على زر التسجيل.

ستظهر الاستجابة الخلوية مع انفجار الحبسة لإمكانات العمل على اللوحة العلوية. ثم حقن التيار في الخلية ذات الموصلية المنخفضة. أولا ، إذا لوحظت استجابة قليلة أو معدومة ، فقم بزيادة التيار بزيادات صغيرة حتى ينتج استجابة قوية.

أن يؤدي الحقن الحالي المفرط إلى قتل الخلية. بمجرد الانتهاء من الاختبارات. حدد زوجا جديدا من أشكال موجات الموصلية وكرر الإجراءات لجميع أزواج الموصلات الفسيولوجية والاصطناعية.

بعد التسجيل ، اسحب الماصة بعناية حتى يظل جسم الخلية سليما. بعد ذلك ، قم بإصلاح الأنسجة على الفور و 4٪ بارا فورمالديهايد لمدة 30 دقيقة ، متبوعة بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق باستخدام محلول فوسفات 0.1 مولار ، قم بتبريدها وإجراء تلطيخ الأجسام المضادة في اليوم التالي أو في غضون أسبوع عندما تكون جاهزا. وصمة عار ضد الخلايا العقدية المملوءة باللون الأصفر لوسيفر في درجة حرارة الغرفة باستخدام أرنب أصفر أولي مضاد لوسيفر IgG عند تخفيف من واحد إلى 10،000 لمدة خمسة أيام.

ثم في اليوم السادس ، والبقاء بين عشية وضحاها مع الماعز الثانوي المضاد للأرانب IgG ، أضف تخفيفا من واحد إلى 500 في النهاية ، قم بتركيب شبكية العين الرطبة في وسائط الحفاظ على الفلورسنت. ضع زلة الغطاء وأغلقها بطلاء الأظافر. التقط صورا متحدة البؤر لتشكل الخلية باستخدام مجهر Leica SPECT ثنائي البؤر.

فيما يلي استجابات الخلية العقدية لحقن أشكال موجة التوصيل المثير والمثبط التي تم الحصول عليها من تجارب التحكم الموضحة باللونين الأخضر والأحمر على التوالي. وفيما يلي الاستجابات لحقن أشكال موجات التوصيل المسجلة بعد تطبيق حمام السموم الرباعي. فيما يلي استجابات خلية عقدية أخرى لأزواج مختلفة من أذرع أشكال موجات التوصيل.

تم تغيير النسب بين الموصلية المثيرة والتوصيل المثبط من واحد إلى صفر إلى واحد إلى اثنين. مع زيادة درجة التثبيط ، انخفضت استجابة الخلية ، وإليك استجابات الخلية العقدية لنفس مستوى الإثارة الذي تنوع فيه بداية التثبيط. يمثل Delta T فارق التوقيت بين بداية الموصليات المثبطة والمثيرة.

مع انخفاض تأخير التثبيط ، أصبحت استجابة الخلية أضعف. هذا الإجراء هو تقنية قوية تساعد في الكشف عن التفاعلات بين الإكسي ثلاثة ومدخلات المشبك المثبطة التي تولد ناتجا عصبيا.