تحفيز الميكانيكية التي يسببها الكالسيوم انتشار الموجات في الخلية monolayers: مثال من الأبقار الخلايا البطانية القرنية

الهدف العام من التجربة التالية هو دراسة التواصل بين الخلايا عبر قنوات الوصلات الفجوية (gap junction channels) والقنوات النصفية (HEMI channels) من خلال قياس مدى انتشار موجة الكالسيوم بين الخلايا والمستحثة بالتحفيز الميكانيكي في طبقات أحادية من الخلايا البطانية القرنية الأولية. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق عزل الخلايا البطانية القرنية الأولية من عيون بقريّة حديثة. وكخطوة ثانية، بعد مرور يومين إلى ثلاثة أيام من الاستزراع في شرائح ذات حجرات، يتم تحميل الطبقة الأحادية الملتئمة من الخلايا بصبغة Fluo-4 AM الفلورية الحساسة للكالسيوم. بعد ذلك، نقوم بتطبيق محفز ميكانيكي محكوم وموضعي على خلية واحدة من الطبقة الأحادية لاستحثاث موجة كالسيوم بين الخلايا، والتي يتم تصورها باستخدام المجهر البؤري (confocal microscope).

تظهر النتائج انتشار موجة الكالسيوم بين الخلوية. وفي نهاية المطاف، يتم استخدام تثبيط قنوات الوصلات الفجوية والقنوات نصف الفجوية (HEMI channels) للكشف عن خصائص وتنظيم مختلف الأشكال الإسوية لبروتينات Conex و panex المكونة لقنوات الوصلات الفجوية والقنوات نصف الفجوية. وتكمن الميزة الرئيسية لانتشار موجة الكالسيوم بين الخلوية المستحثة بالتحفيز الميكانيكي في أنها توفر طريقة بسيطة وموثوقة لفحص مساهمة وخصائص القنوات الرابطة والقنوات نصف الفجوية بطريقة غير جراحية.

علاوة على ذلك، تعتمد هذه الطريقة على جزيئات وإشارات التسلسل الفسيولوجي الموجودة في الأنظمة الخلوية المدروسة. وأخيراً، يمكن تكييفها بسهولة مع مجموعة متنوعة من الأنظمة الخلوية، بما في ذلك الخلايا الأولية والنماذج الخلوية التي تعبر بشكل خارجي عن نظائر معينة من connection أو PanIN. يمكن لهذه الطرق أن توفر رؤية واضحة حول الوظيفة والتنظيم الديناميكي لقنوات cap junction وقنوات HEMI القائمة على connection و PanIN، وذلك من خلال استخدام تقنية إسكات الجينات بواسطة SI RNA لنظائر connection أو panics الداخلية، وعن طريق استخدام مثبطات انتقائية لقنوات cap junction وقنوات HEMI.

هذا النظام لا يقتصر بالتأكيد على الخلايا البطانية للقرنية فحسب، بل هو قابل للتطبيق على أي نوع من الخلايا تقريباً وكذلك على الأنسجة الأكثر تعقيداً. يستخدم هذا الإجراء عيناً حديثة الاستئصال من بقرة لا يتجاوز عمرها 18 شهراً، ولم يمر على وفاتها أكثر من خمس دقائق.

تم نقل ذلك إلى المختبر في محلول ملح التوازن الخاص بـ Earl ومحلول يود بتركيز 1% عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. أولاً، انقل العين إلى أطباق Petri بحجم 100 millimeter في 20 millimeter. بعد ذلك، اشطف العين باستخدام EBSS الذي يحتوي على 1% يود.

بعد ذلك، قم بتعقيمه بمحلول يحتوي على 70% ethanol من هذه النقطة فصاعداً. اعمل داخل غطاء تعقيم (sterile hood). قم بتشريح القرنية بعناية من العين وضعها في طبق بتري مقاس 35 مليمتر في 10 مليمتر يحتوي على EBSS بحيث تكون طبقة الخلايا الطلائية مواجهة للأعلى.

أزل أي أنسجة متبقية من القزحية لا تزال ملتصقة بالقرنية بعناية. وإذا لزم الأمر، انقل القرنية إلى طبق آخر من EBSS مع توجيه طبقة الخلايا البطانية للأعلى، ثم اشطفها مرتين باستخدام EBSS. بعد ذلك، ضع القرنية بحيث تكون الطبقة البطانية مواجهة للأعلى في وعاء على شكل ساعة رملية وغطّها بوسط النمو.

للشطف، قم بإزالة الوسط باستخدام ماصة شفط. ضع 300 µL من محلول tripsin بتركيز 0.5 g/L على الطبقة البطانية للقرنية. ضع الساعة الرملية التي تحتوي على القرنية في طبق بتري مغطى وانقله إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة عند 37 °C و 5% CO2.

بعد استعادة الساعة الرملية، يتم كشط الخلايا البطانية بلطف بعيداً عن القرنية باستخدام ماصة باستير زجاجية ذات طرف معقوف ومصقول بالنار. يتم شفط المحلول الذي يحتوي على الخلايا البطنية وإضافته إلى دورق زراعة بمساحة 25 سنتيمتر مربع يحتوي على أربعة ملليلتر من وسط الزراعة. بعد ذلك، يتم وضع 300 ميكرولتر من وسط النمو على القرنية.

كرر عملية الكشط وأضف المحلول الذي يحتوي على الخلايا البطانية إلى قارورة الزراعة. كرر هذه الخطوة مرة أخرى، ثم ضع قوارير الزراعة التي تحتوي على الخلايا البطانية القرنية في وسط النمو داخل الحاضنة عند 37 °C و5% carbon dioxide. بعد يومين، أضف 6 mL من وسط الزراعة وقم بتجديد وسط النمو كل يومين.

يجب أن تصل الخلايا إلى حالة التلاقي (confluence) في غضون سبعة إلى 10 أيام من العزل وحتى عملية النقل. أولاً، يتم سحب وسط الزرع ثم الشطف مرتين باستخدام EBSS. بعد ذلك، يُضاف مليلتران من محلول التريبسين إلى الخلايا وتوضع القارورة في الحاضنة لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع دقائق.

ثم أضف 12 milliliters من وسط النمو واستخدم الماصة لسحب الوسط وإعادته ثلاث مرات لتشتيت الخلايا. بعد ذلك، قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) أو عداد خلايا آلي. أضف 165,000 خلية إلى شريحتين زراعتين لكل منهما بئر واحد.

بعد ذلك، قم بتجهيز دوارق زراعة مربعة بمساحة 75 سنتيمتر مربع لممر جديد بكثافة 6,250 خلية لكل سنتيمتر مربع، وأضف وسط زراعة جديد حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 25 ملليلتر، ثم ضع الدوارق وشرائح الغرفة في الحاضنة. يتم تجديد الوسط كل يومين، ويجب أن تصل طبقة الخلايا إلى حالة التلاقي (confluency) في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام. أولاً، قم بتحميل الخلايا في شريحة الغرفة باستخدام 10 ميكرومولار من Fluo-4 AM في محلول ملحي منظم بالفوسفات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الرج اللطيف؛ وبينما تخضع الخلايا للتحضين في Fluo-4 AM، قم بتوصيل ماصة مجهرية زجاجية بقطر طرف يقل عن 1 ميكرومتر بموضع نانو كهربائي piezo-electric، وقم بتوصيلها بمضخم مثبت على مناور مجهري (micro manipulator).

اضبط جهد منظم الموضعة النانوي ليكون بين 0.2 و 1.5 فولت. ثم قم بإزالة محلول 4:00 AM. بعد ذلك، اغسل الخلايا خمس مرات باستخدام المحلول الملحي الملحق بالفوسفات (PBS)، ثم قم بحضن الخلايا في PBS لمدة خمس دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة قبل القياس.

يتم الاستثارة بطول موجي 488 nanometers باستخدام ليزر الأرجون مع استخدام مقسم الحزمة HFT 48. يتم جمع الانبعاث الفلوري عند 530 nanometers باستخدام مرشح انبعاث طويل التمرير LP 5 0 5 مع ضبط الثقب (pinhole) عند الحد الأدنى، وهنا تُستخدم عدسة شيئية غمر زيتية بقوة 40 x. ضع شريحة الحجرة على منصة المجهر البؤري (confocal microscope) وابحث عن منطقة من الخلايا المتلاحمة.

بعد ذلك، حرك المجهر الدقيق لضبط وضع الماصة الزجاجية الدقيقة بحيث تلامس غشاء الخلية بزاوية 45 درجة. قم بتشغيل المجهر الدقيق لملامسة أقل من 1% من غشاء الخلية المفردة لفترة وجيزة باستخدام الماصة الزجاجية الدقيقة لإحداث تحفيز ميكانيكي للخلية لمدة ثانية واحدة. ثم قم بقياس التغيرات المكانية في تركيز أيونات الكالسيوم بعد التحفيز الميكانيكي باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) لجمع الصور وتخزينها.

أخيراً، ارسم منطقة اهتمام مضلعة لتحديد إجمالي مساحة سطح الخلايا المستجيبة باستخدام برنامج المجهر البؤري. تظهر عوابر الكالسيوم المستحثة بالتحفيز الميكانيكي في نقاط زمنية مختلفة تحت ظروف التحكم في الخلايا البطانية للقرنية البقرية من خلال صور فلورية ممثلة ذات ألوان زائفة، وتظهر شدة الفلورية قبل التحفيز في الصورة الأولى. ويحدد السهم الأبيض في الصورة الثانية الخلية التي تم تحفيزها ميكانيكياً.

تنتشر موجة الكالسيوم إلى ست طبقات خلوية مجاورة، حيث تبلغ المساحة الإجمالية للخلايا التي وصلت إليها الموجة مساحة نشطة قدرها 62, 870 micrometers squared. يوضح الرسم البياني الخطي المجرى الزمني لقيمة الفلورة المعيارية أو NF في الخلية المحفزة ميكانيكياً والمشار إليها بـ ms، والمتوسط الحسابي لقيمة NF في الطبقات الخلوية المجاورة من الأولى إلى الخامسة والمشار إليها في الرسم البياني بـ MB one إلى MB five. تظهر هذه الصور تغيرات ملحوظة في انتشار موجات الكالسيوم بين الخلوية بعد المعالجة بالنوكليوتيدات الخارجية في الرسم البياني الموجود على اليسار، وبعد المعالجة بمثبطات إنزيم ecto nucleotide aase في الرسم البياني الموجود على اليمين؛ وبشكل أكثر تفصيلاً، يظهر الرسم البياني الموجود على اليسار انخفاضاً ملحوظاً في المساحة النشطة بعد معالجة الخلايا البطانية لقرنية البقر بإنزيمات Aras Aase six و Aase seven الخارجية، والتي قامت بتحلل A TP و A DP، مما أدى بذلك إلى تثبيط مسار التواصل بين الخلوي عبر الإفراز المحيطي.

تشير النجمة إلى قيمة P أقل من 0.001 في حالة وجود ace مقابل غيابه. يوضح الرسم البياني الموجود على اليمين زيادة معنوية في المنطقة النشطة بعد معالجة BCEC بمثبط انتقائي للنوكليوتيد الخارجي، A RL 6 7 1 56، مما يعزز مسار التواصل البيني المحيطي. تشير النجمة إلى قيمة P أقل من 0.001 في حالة وجود a RL مقابل غيابه بمجرد إتقان ذلك.

يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون خمس إلى 10 دقائق لتجربة واحدة في حالة واحدة عند تنفيذها بشكل صحيح. ويستغرق إجراء سلسلة كاملة من التجارب التي تتيح مقارنة حالات مختلفة يوماً واحداً لاستخلاص الاستنتاجات الإحصائية. ويجب استخدام تجارب مستقلة تُجرى في أيام مختلفة ومن دفعات مختلفة من الخلايا المعزولة.

يتيح قياس وتقدير كمية انتشار موجات الكالسيوم داخل الخلايا تحديد وتوصيف التنظيم البيولوجي الخلوي لمختلف الأشكال الإسوية للاتصالات والوصلات، مثل قنوات الوصلات الفجوية والقنوات نصف الفجوية. وأود أيضاً التأكيد على أن هذه الطريقة لا تكتفي بذاتها، بل يجب استكمالها بنهج جزيئية ووظيفية أخرى تتراوح من نقل الصبغات إلى إطلاق الكالسيوم والفيزيولوجيا الكهربائية.