هندسة الأنسجة ل3D الإنسان في المختبر نظام ورم اختبار
August 6th, 2013
وصفت وسائل لخلق أنسجة الورم 3D الإنسان كما نظم الاختبار. وتستند هذه التقنيات على decellularized البيولوجية أوعية دموية سقالة (BioVaSc)، وخلايا الإنسان الأولية وخط الخلية السرطانية، والتي يمكن تربيتها في إطار ثابت وكذلك في ظل ظروف دينامية في مفاعل حيوي التدفق.
الهدف العام من هذا الإجراء هو بناء نظام اختبار الورم ثلاثي الأبعاد مع الخلايا الأولية على سقالة بيولوجية منزوعة الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير السقالة أولا باستخدام عملية إزالة الخلايا حيث يتم ضخ جزء من الخنازير بمحلول إزالة الخلايا. الخطوة الثانية هي عزل الخلايا البشرية الأولية عن خزعة المريض باستخدام بروتوكول عزل قياسي.
بعد ذلك ، قم بإعداد نظام اختبار الورم عن طريق قطع تحت الغشاء المخاطي الأنبوبي للأمعاء الدقيقة من جانب واحد ، وتثبيته بين حلقتين معدنيتين والبذر بالخلايا السرطانية والخلايا اللحمية المرتبطة بها بكثافة خلايا محددة. الخطوة الأخيرة هي زراعة البناء المحمل بالخلية في إعداد مناسب في ظل ظروف ثابتة أو ديناميكية. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري الكيميائي المناعي لتقييم خصائص نمو الورم.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل أنظمة اختبار الورم TT ، هي أنه باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن إنشاء نماذج أنسجة ثلاثية الأبعاد تحاكي الظروف في الجسم الحي للورم بشكل أكثر دقة من النماذج ثنائية الأبعاد الشائعة. ميزة الثقافة الديناميكية هي الحفاظ على الخصائص الخاصة الخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الورم ، مثل كيفية تكوين الخلايا السرطانية لتفاعلات خلايا الخلية ومصفوفة الخلايا في بيئة ثلاثية الأبعاد ، مما سيساعد في توضيح العمليات المتعلقة بالسرطان مثل تطور الورم ورم خبيث.
السقالة البيولوجية الوعائية أو biova المستخدمة في نظام اختبار الورم هذا مشتقة من قطعة الخنازير. اشطف نظام الأوعية الدموية لجزء الخنازير والتجويف المعوي باستخدام PBS عن طريق الوصول الشرايين المقلية. كرر حتى يصبح نظيفا تماما.
قم بإعداد خزان زجاجي بقطر 200 مم بأربعة محولات وقم بتوصيلها عبر أنابيب السيليكون بالمضخة التمعجية. يمكن مراقبة وحدة التحكم في الضغط عبر مستشعر ضغط متصل بقبة معقمة يمكن التخلص منها. املأ زجاجات الخزان بمحلول إزالة الخلايا أو DZ.
افحص نظام الأنابيب بحثا عن فقاعات هواء محتملة. قم بتوصيل التجويف المعوي بوصلات الكابلات بالموصلات الزجاجية لتدفق اللموع. ضخ 500 مل من محلول DZ في الوصول الشرايين الحمراء لنظام الأوعية الدموية.
قم بمقاطعة عملية الضخ كل 15 دقيقة بعد فترة وجيزة للضغط يدويا على تجويف الأمعاء بالكامل. من المهم مراقبة ضغط المحلول العازل أثناء عملية إزالة الخلايا. يجب أن يتراوح الضغط بين 80 إلى 100 ملم من الزئبق على غرار ضغط الدم الطبيعي.
اغسل biova باستخدام PBS حتى يصبح خاليا من بقايا الخلايا ويصبح لون الأوعية الدموية أبيض تماما. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تقطيع خزعة الجلد إلى شرائح بعرض ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات بمشرط وشطفها ثلاث مرات بمحلول PBS. بعد احتضان الأنسجة بمحلول disbe ، استخدم ملاقطين لفصل البشرة عن الأدمة.
انقل كلاهما بشكل منفصل إلى أطباق بتري المليئة ب PBS لعزل الخلايا البطانية الجلدية الدقيقة الأولية أو شرائط الأدمة الشطف MV eecs مرة واحدة مع ene، أضف 10 ملليلتر من الرحلات في محلول EDTA إلى شرائط الأدمة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. أوقف تفاعل الإنزيم مع 1٪ FCS وانقل شرائح الجلد إلى طبق بتري مليء بعمر الأوعية الدموية. اكسر كل شريط بمشرط ثماني مرات على كل جانب ، مع إضافة القليل من الضغط لإنتاج تعليق الخلية.
بعد ذلك الطرد المركزي لتعليق الخلية وإعادة التشكيل ، وتعليق بيليه الخلية مع حياة الفراغ. لعزل الخلايا الليفية. أولا ، استخدم مشرطا لتقطيع شرائح الأدمة إلى قطع صغيرة.
انقل قطع الأدمة إلى أنبوب فالكون وأضف 10 مل من محلول الكولاجيناز المحتضن 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحلول وإزالة المادة الطافية بعناية. اغسل الحبيبات باستخدام DMEM بالإضافة إلى 10٪ FCS بالإضافة إلى 1٪ بكتيريا القلم.
بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط الثقافة ، وانقلها إلى قارورة ثقافة T 75 للسماح للخلايا بالنمو خارج الأنسجة التي تحتضن في ظل ظروف ثابتة. لإعداد نظام اختبار الورم أولا ، قم بقطع تحت الغشاء المخاطي الأنبوبي للأمعاء الدقيقة أو مخاط SIS ، وافتحه من جانب واحد وثبته بين حلقتين معدنيتين. يبلغ قطر تيجان الخلايا ذاتية الصنع 10 ملليمترات.
قم بتغطية SIS mu في وسط زراعة الخلايا طوال الليل في اليوم التالي ، وقم ببذور MVE CS الأولية على السطح القاعدي اللاحق ل SIS ، CI.Incubate السابق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات. بعد ثلاث ساعات ، املأ البئر بالوسيط لضمان المزرعة المغمورة وإعادتها إلى الحاضنة. اسمح للخلايا البطانية بالالتصاق لمدة ثلاثة أيام بعد ثلاثة أيام.
اقلب نظام الثقافة الثابتة بمقدار 180 درجة وانقله إلى لوحة 12 بئر. بعد ذلك ، انظر مزيجا من الخلايا الليفية الجلدية الأولية والخلايا السرطانية على السطح القمي لمتلازمة التلازمة الإسلامية. جانب التجويف السابق.
اسمح للخلايا بالالتصاق لمدة ثلاث ساعات. املأ البئر بوسيط لغمر ثقافة الثقافة ، ونظام اختبار الورم في ظل ظروف ثابتة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 14 يوما إضافية ، وتغيير وسط الثقافة كل يومين إلى ثلاثة أيام للثقافة الديناميكية. قم بإصلاح SIS mu بين حلقتين معدنيتين و البذور الأولية MV eecs كما هو موضح سابقا.
بعد ثلاثة أيام ، قم بإزالة SIS mu من الحلقات المعدنية وأدخل الغشاء في مفاعل التدفق باستخدام حقنة وقنية. ضع الخلايا الليفية الجلدية الأولية والخلايا السرطانية على المصفوفة في المفاعل الحيوي. اسمح للخلايا بالالتصاق لمدة ثلاث ساعات قبل ملء نظام المفاعل الحيوي بوسط الاستزراع في اليوم التالي ، ضع المفاعل الحيوي في نظام حاضنة ذاتي الصنع وقم بتوصيله بمضخة تمعجية.
يسمح هذا الإعداد بالثقافة الديناميكية إما بتدفق نابض منظم للضغط أو تدفق مستمر. في هذه التجربة ، يتم استخدام تدفق متوسط ثابت يبلغ 3.8 مل في الدقيقة. الحفاظ على الثقافة الديناميكية لمدة 14 يوما ، وتغيير وسط الاستزراع بعد سبعة أيام.
عند الانتهاء من التجارب ، يتم تثبيت الأنسجة ، والبارافين ، وتضمينها ، وتلطيخها ، ثم تصويرها باستخدام مجهر عكسي. النتائج التمثيلية موضحة هنا. تقدم اللوحة A لمحة عامة عن خط الخلايا الورمية S 4 62 المزروع بشكل ثابت في الزراعة الأحادية ثنائية الأبعاد الملطخة بالهيمات تولين.
تظهر الثقافة المشتركة ثلاثية الأبعاد في اللوحات B و C و D.تظهر هذه الصورة الملطخة H و e الثقافة الثلاثية للخلايا السرطانية S 4 62 والخلايا الليفية الأولية على الجانب القمي من SIS MU و MVEC. على الجانب الجانبي القاعدي ، تشير الأسهم إلى الخلايا البطانية. يمكن تحديد أنواع الخلايا المختلفة عن طريق تلطيخ علامات محددة من نوع الخلية مثل عامل فون ويلبراند لتسمية MVEC الموضح في اللوحة C و P 53 الموضحة في اللوحة D. يمكن تمييز الخلايا P 53 إيجابية S 4 62 عن الخلايا الليفية الأولية السلبية P 53 ، ويمكن تحليل التوزيع ثلاثي الأبعاد للخلايا بنفس الطريقة.
يمكن تحديد أنواع الخلايا المختلفة في لوحة الثقافة الثلاثية المزروعة ديناميكيا A هي صورة ملطخة H و E حيث تحدد الأسهم الخلايا البطانية. تظهر اللوحة B تلطيخا نسيجيا مناعيا لعامل فون ويلبراند ، وتظهر اللوحة C تلطيخا ل P 53 باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل اختبارات المخدرات من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية العثور على علاجات جديدة للسرطان أو تحليل مسارات الإشارات المهمة في تكوين الورم.
أيضا ، يمكن استخدام الخلايا الأولية لتحديد أفضل علاج شخصي للمرضى الأفراد.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طرقًا لإنشاء أنسجة ورمية ثلاثية الأبعاد باستخدام دعامة حيوية وعائية (BioVaSc) خالية من الخلايا مأخوذة من خلايا بشرية أولية. تسمح هذه النهج بزراعة هذه الأنسجة في ظل ظروف ثابتة وديناميكية، مما يعزز محاكاة بيئات الأورام في الجسم الحي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأورام
- هندسة الأنسجة
الخلفية
- توفر نماذج الأورام ثلاثية الأبعاد تمثيلًا أكثر دقة للظروف في الجسم الحي مقارنة بالثقافات ثنائية الأبعاد التقليدية.
- الدعامات غير الخلوية مشتقة من أنسجة الخنازير، وتوفر مصفوفة بيولوجية لنمو الخلايا.
- يمكن لظروف الزراعة الديناميكية أن تحافظ على خصائص الخلايا المحددة بشكل أفضل من الأساليب الثابتة.
- تهدف هذه الدراسة إلى توضيح العمليات المتعلقة بالسرطان مثل تطور الورم والنقائل.
غرض الدراسة
- تطوير نظام اختبار ورم ثلاثي الأبعاد باستخدام الخلايا البشرية الأولية.
- التحقيق في تفاعلات الخلية-الخلية والخلية-المصفوفة في بيئة ثلاثية الأبعاد.
- تحسين فهم بيولوجيا الورم والعمليات ذات الصلة.
الطرق المستخدمة
- إعداد دعامة حيوية غير خلوية من أنسجة الخنازير.
- عزل الخلايا البشرية الأولية من خزعات المرضى.
- زرع الخلايا الورمية والخلايا السدى على الدعامة.
- زراعة البناء المحمّل بالخلايا في ظل ظروف ثابتة أو ديناميكية.
النتائج الرئيسية
- نجحت نماذج الأورام ثلاثية الأبعاد في محاكاة ظروف الأورام في الجسم الحي.
- حافظت ظروف الزراعة الديناميكية على خصائص الخلايا المحددة.
- كشفت الفحص المجهري المناعي عن خصائص نمو الورم بالتفصيل.
- أظهرت الطريقة مزايا على النماذج ثنائية الأبعاد الحالية في دراسة بيولوجيا الأورام.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الدراسة نهجًا جديدًا لإنشاء نماذج ورمية ثلاثية الأبعاد.
- يمكن أن تسهم الطريقة بشكل كبير في أبحاث السرطان وتطوير العلاجات.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذا النظام لاستكشاف جوانب مختلفة من بيولوجيا الأورام.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This 3D in vitro tumor test system addresses the translational gap in oncology drug discovery by providing a human-relevant model that better recapitulates in vivo tumor architecture and stromal interactions. By enabling the study of tumor progression and metastasis in a physiologically relevant context, the system supports mechanistic de-risking and improves predictive confidence in preclinical target validation. The platform enhances early discovery decision-making through improved biological fidelity over conventional 2D cultures.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tumor-stromal interactions in a 3D microenvironment to clarify pathogenic mechanisms and validate therapeutic targets.
- Operational Value: Supports functional target validation using primary human cells and patient-derived models to increase target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible 3D co-culture system for quantitative assessment of compound effects on tumor growth and stromal interactions.
- Operational Value: Enables assay standardization and scalability for downstream screening campaigns through defined cell seeding and culture conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs) with stromal components to support disease-relevant mechanistic studies and biomarker exploration.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by maintaining human-relevant tissue architecture and cell-specific characteristics under dynamic culture.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supporting hypothesis-driven target validation in early discovery, enabling reproducible assay formats for screening, and providing quantitative phenotypic readouts that inform lead optimization and preclinical advancement decisions.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by elucidating tumor cell-cell and cell-matrix interactions in a 3D human-like microenvironment.
- Screening: Enables assay readiness through standardized seeding of tumor and stromal cells on decellularized scaffolds under static or dynamic conditions.
- Analytics: Generates immunohistochemical and morphological readouts that allow comparative analysis of tumor growth, invasion, and stromal engagement across experimental conditions.
- Translational Research: Models MPNSTs with patient-derived primary cells and vascularized scaffolds to support preclinical continuity and biomarker-aligned studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple therapeutic candidates and combinations in a consistent, human-relevant 3D system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in tumor-stromal signaling and invasion pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized scaffold preparation, cell isolation, and culture protocols.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by increasing biological relevance and reducing late-stage attrition due to poor target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of oncology candidates based on functional validation in a human-like 3D tumor model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, tissue engineering, and scaffold decellularization techniques.
- Depends on access to perfusion bioreactor systems, pressure regulation units, and sterile cell culture infrastructure for dynamic conditions.
- Necessitates cross-team standardization of cell seeding densities, culture duration, and medium exchange protocols between biology and bioengineering groups.
- Involves adaptation considerations when extending the model to other tumor types or stromal compositions beyond MPNSTs and fibroblasts/mvECs.
- Limited by the availability of patient-derived primary cells and the complexity of maintaining vascularized scaffold integrity over long-term culture.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:16
Decellularization of the BioVaSc
3:52
Isolation of Primary Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (mvECs) and Fibroblasts
5:50
Tumor Test System A. Static Culture
7:36
Tumor Test System B. Dynamic Culture
8:45
Results: Immunohistological Characterization of 3D Tumor Models
10:40
Conclusion
