Name: عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: تعلم عزل الخلايا البطانية البطينية الجنينية من أجنة الفئران المعدلة وراثياً باستخدام الأجسام المضادة والفصل المغناطيسي. تتيح هذه الطريقة دراسة تطور الأوعية الدموية وسلوك الخلايا البطانية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونود أن نشكر اندريا بورتبري لقراءة نقدية للمخطوطة، ومختبر خدمة مجهر UNC للحصول على المساعدة مع الوقت الفاصل بين التصوير، والمعاهد الوطنية للصحة (منحة # R01HL061656) لدعم التمويل.

1. إعداد الخرز الضد مترافق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم واحد قبل تشريح، والجمع بين الأضداد من خيار مع Dynabeads المناسبة (مثل الفئران Dynabeads مفتش للجسم التي أثيرت في الفئران، 4 × 10 8 حبات / مل) في تعليمات الشركة الصانعة. لBD الفئران مكافحة CD31 الأجسام المضادة (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر، وتستخدم لعزل الخلايا البطانية)، يتم إضافة 3 ميكرولتر الضد لكل ميكرولتر 25 حبات، لتركيز النهائي من 1.5 ميكروغرام الأجسام المضادة لمكافحة CD31 و 1 × 10 7 حبات / 25 ميكرولتر العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حبات والأضداد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li></ol> 2. إعداد لوحة الكولاجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا معزولة تشكيل الأنابيب بسرعة أكبر عندما نمت على هلام الكولاجين بدلا من مجرد لوحة الكولاجين المغلفة. لذلك، مصنوعة المواد الهلامية الكولاجين في الليلة التي سبقت تشريح، كما هو موضح في 6. على الجليد في نسيج الثقافة هود، والجمع بين الكواشف التالية (ما يكفي لمدة 19 بئرا): 206.4 ميكرولتر H العقيمة &lt;الفرعية&gt; 2 O، 140.4 ميكرولتر نوع الكولاجين الأول (4.08 ملغ / مل)، 38.4 ميكرولتر 10X M199، و 1.15 ميكرولتر 5 M هيدروكسيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 20 ميكرولتر من هذا الجل الكولاجين في الآبار من 384 جيدا نسيج لوحة الثقافة. وضع لوحة في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 80 ميكرولتر DMEM إلى كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إزالة مستنبت وكرر مرتين أكثر من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد شطف النهائي، إضافة 80 ميكرولتر 10٪ FBS / DMEM إلى كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. إزالة مستنبت قبل إضافة الخلايا المعزولة. </li></ol> 3. المكوس وهضم القلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس توقيت الحوامل في اليوم الجنينية المطلوب باستخدام تقنية القتل الرحيم المعتمدة. تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان في جامعة ولاية كارولينا الشمالية في تشابل هيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الماوس في موقف ضعيف، رش تحرري الجانب البطني من الأنثى مع الايثانول 70٪ قبلتشريح. باستخدام ملقط لرفع الجلد أسفل البطن والعضلات بعيدا عن الأعضاء الداخلية، وقطع فتح تجويف الأنثى في أسفل البطن لتصور أعضائه الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد عنق الرحم مع ملقط، وقطع بعناية الذيلية إلى ملقط والبدء في رفع قرن الرحم من تجويف البطن. في حين رفع قرن الرحم، وقطع بعيدا أي النسيج الضام الذي يحمل قرن في المكان. لإنهاء استئصال قرن الرحم، وقطع تقاطع قرن الرحم مع قناة البيض لتحرير قرن الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قرن الرحم في طبق بتري تحتوي الباردة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وشطف حسب الحاجة. خفض فتح قرن الرحم عن طريق خط الوسط لفضح الحويصلات الجنينية المرفقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض فتح الكيس الجنيني عند تقاطع المشيمة والجنين لتجنب قصد قطع الجنين واسترجاع الجنين. وضع الجنين في طبق بيتري الثانية مع برنامج تلفزيوني الباردة. العودة طبق بيتري مع قرن الرحم إلى جليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Decapitate الجنين لتحسين الوصول إلى جدار الصدر. إذا التنميط الجيني هو ضروري، وقطع الذيل لإزالته وحفظ في أنبوب إيبندورف وضعت على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الجنين على ظهرها، وقطع فتح جدار الصدر لتصور القلب والرئتين. لتجنب قطع القلب، وجعل قطع عمودي على طول الجانب من القفص الصدري، بالقرب من forelimb، تليها قطع أفقي عبر الجزء السفلي من الأضلاع، ثم، وسحب بلطف جدار الصدر صعودا وللخروج من الطريق. من خلال ما يقرب من 13.5 يوم الجنينية، جدار الصدر هو شفاف، والمساعدة في التصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع بعناية القلب باستخدام ملقط وقطع الأوعية أدناه. ثم، وقطع فوق سفن كبيرة للافراج عن القلب. إذا لم يتم قطع الأوعية الرئوية، قد تتم إزالة الرئتين مع القلب. وهكذا، وإزالة أنسجة غريبة، مثل الرئتين، إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل وتجاهل السفن الأذينين والبطينين كبيرة من. باستخدام مقص، اللحم المفروم البطينين إلى قطع صغيرة (حوالي 1 ملم 3 &lt;/ سوب&gt;) ووضعت في ما يقرب من 500 ميكرولتر كولاجيناز (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة). الاحتفاظ بعينات على الجليد حتى تم مفروم جميع البطينين ووضعها في كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات السابقة حتى يتم رفعه البطينين من جميع الأجنة، وجمع كل قلب في أنبوب إيبندورف منفصلة. إذا كان كل الأجنة لديها نفس التركيب الوراثي، قد يتم تجميع قلوب في أنبوب إيبندورف واحد. عدد العينات معالجتها في وقت واحد قد تكون محدودة استنادا إلى مغناطيس تستخدم لعزل، وDynaMag (123-21D) تستخدم هنا يحمل بحد أقصى 16 أنابيب إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البطينين المفروم عند 37 درجة مئوية مع هزاز لمدة 45 دقيقة. كل 15 دقيقة، وإزالة بلطف العينات وماصة صعودا وهبوطا لفصل ميكانيكيا الخلايا. </li></ol> 4. عزل الخلايا البطانية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير حل البطين للكولاجيناز خلال 70 ميكرون فلتر لإزالة كتل المتبقية من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة. نبذطاف، مع استبدال ما يقرب من 200 ميكرولتر FBS 10٪ في DMEM، وماصة صعودا وهبوطا لفصل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة السابقة مرة واحدة. الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة بعد الثانية 10٪ FBS / DMEM غسل. resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر 10٪ FBS / DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء خطوة الطرد المركزي النهائية، وإعداد الخرز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب إيبندورف التي تحتوي على الأجسام المضادة والخرز على مغناطيس لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الأنبوب في مكان على المغناطيس، وإزالة طاف. إزالة أنبوب من المغناطيس وإضافة ما يقرب من 100 ميكرولتر 10٪ FBS / DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب على مغناطيس لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف، ويغسل مرة أخرى مع 10٪ FBS / DMEM. تكرار لما مجموعه 3 يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل النهائي، resuspend والخرز الأجسام المضادة، مترافق في 10٪ FBS / DMEM (5 ميكرولتر لكل عينة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى كل عينة الخلية، إضافة 5 ميكرولتر من الخرز الأجسام المضادة، مترافق. ضع تعليق حبة خلية في 4 درجات مئوية مع هزاز FOR 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تدفق الصفحي هود، ووضع أنابيب إيبندورف تحتوي على خلايا والخرز الأجسام المضادة، مترافق على مغناطيس لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف، وإزالة أنابيب من المغناطيس، ويغسل مع ما يقرب من 100 ميكرولتر 10٪ FBS / DMEM. كرر لمدة 5 يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الماضي، وضع أنابيب على مغناطيس لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف، وإزالة أنابيب من المغناطيس. إضافة ما يقرب من 100 DMEM ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب على مغناطيس لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف، وإزالة أنابيب من المغناطيس. prewarmed إضافة 100-200 ميكرولتر 0.25٪ التربسين EDTA-. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب على مغناطيس لمدة 2 دقيقة. نقل بعناية طاف تحتوي الخلية الى أنابيب إيبندورف الطازجة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف. resuspend الخلايا في 80-100 ميكرولتر متوسطة النمو وطبق في 96 - 384 أو جيدا طبق ثقافة المعالجة، اعتمادا على العائد المتوقع(حوالي 450-600 الخلايا من البطينين من E14.5-E16.5 الأجنة). لخلايا بطانة الأوعية الدموية، واستخدام البطانية نمو الثقافة المتوسطة (المعرف أدناه). </li></ol>

<ol><li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLandecker%2C+H+%22Culturing+Life%3A+How+Cells+Became+Technologies%22">Culturing Life: How Cells Became Technologies</a>. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).</li>
<li>Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+dysfunction+and+cytoskeletal+changes+associated+with+repression+of+p16%28INK4a%29+during+immortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.</a> Oncogene. , (2012).</li>
<li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+endothelium%3A+an+emphasis+on+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).</li>
<li>Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li>
<li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+angiogenesis%3A+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).</li>
<li>Chang, L., Noseda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+local+precursors+during+embryonic+and+adult+arteriogenesis+requires+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling.</a> PNAS. 109, 5993-6998 (2012).</li>
<li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li>
<li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li>
<li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Research+communications+in+chemical+pathology+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li>
<li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li>
</ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

العمل مع الخلايا الجنينية الأولية يسمح التجارب رواية لمعالجة في المختبر الخطوات الحاسمة للتنمية. ومع ذلك، فإن إجراء العزل ليست تافهة. وتشمل الخطوات الحاسمة لعزل أي نوع من الخلايا ضمان أن يتم فصل الخلايا بشكل جيد على الهضم كولاجيناز ثم أنهم علقت جيدا خلال خطوات الغسيل. تشريح الميكانيكية من قبل pipetting يساعد كثيرا فصل الخلايا أثناء الخطوة كولاجيناز، والخطوة تصفية يزيل كتل من الخلايا. هذه الخطوات تحسين نقاء السكان والإنتاج. <p class="jove_content" style=";text-align:ri...

ظهور خطوط الخلايا خلد قد أحدثت ثورة بيولوجيا الخلية الأساسية 1. وتستمد خطوط الخلايا المتوفرة حاليا من مجموعة واسعة من الأجهزة وتشمل جميع أنواع الخلايا الرئيسية. ومع ذلك، خطوط الخلايا التي أنشئت لديها بعض القيود. من الواضح أن عملية تخليد تغيير سلوك الخلايا، وتحديدا فيما يتعلق مدى الحياة والانتشار، ولكن يمكن أن تؤثر أيضا على التعبير عن البروتينات غير متوقعة، مثل البروتينات هيكل الخلية 2. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن العديد من خطوط الخلايا المختلفة المتاحة، وهناك تنوع كبير بين حتى نوع خلية واحدة داخل الكائن الحي بأكمله. الخلايا البطانية على وجه الخصوص تظهر السلوكيات المتنوعة سواء كانت تقوم على خط الشرايين أو الأوردة وأي نوع من تدفق موجود في السفينة 3. حتى أكثر إلحاحا من منظور إنمائي، ومع ذلك، هو أن الغالبية العظمى من خطوط الخلايا المتاحة مستمدة من أنسجة البالغين (انظر، على سبيل المثال خميسوقال انه جمع متاحة عبر آي تي ​​سي سي). هذه خطوط الخلايا الكبار الأرجح لا ألخص الطبيعة الديناميكية لسلائفها الجنينية. ويتغير بسرعة الزمانية المكانية أنماط التعبير الجيني لوحظت خلال تطوير تشير أيضا إلى أن خلية البطانية من جهاز واحد في كل مرحلة تنموية معينة قد لا تتصرف بنفس الطريقة باعتبارها الخلية البطانية من نفس الجهاز في مرحلة تنموية مختلفة. كبديل لاستخدام المتاحة تجاريا خطوط الخلايا خلده، الخلايا الأولية يمكن أن تكون معزولة عن الأنسجة محددة من الفائدة. من بين مزايا هذه التقنية، وهذه الخلايا الأولية يمكن أن تكون معزولة عن جهاز معين أو حتى جزء من الجهاز في أي مرحلة تنموية محددة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الخلايا الأولية يمكن أن تكون معزولة عن مجموعة واسعة من الحيوانات المعدلة وراثيا المتوفرة، مما يتيح دراسة في المختبر من خروج المغلوب الجينات والضربة القاضية في حين تجنب مشاكل أخرى مثل كفاءة ترنسفكأيشن للفي. ليس من المستغرب، وكثيروقد نشرت تقنيات بالتفصيل كيفية عزل أنواع معينة من الخلايا 4،5. بشكل عام، هذه التقنيات تشمل جمع المنطقة من الفائدة، وعدم الربط بين الخلايا، ووضع علامات على نوع من الخلايا محددة من الفائدة، وعزل تلك الخلايا لمزيد من التحليل. لدراسة السكان الجنينية المبكرة من الخلايا البطانية التاجي، ان قلصنا تقنية 4 التي تم نشرها مسبقا للاستخدام مع جهاز أصغر. مع هذا الإجراء تحجيم، يمكننا عزل الخلايا البطانية التاجية من القلب الجنينية في مراحل جنينية محددة. ويمكن بعد هذه الخلايا يمكن استخدامها في المقايسات البطانية التقليدية، مثل تحليلات الهجرة. حتى أوائل خطوط الخلايا الجنينية تصبح أكثر انتشارا، والعمل مع الخلايا الأولية هي تقنية لا تقدر بثمن.

<tbody><tr><table><td colspan = "4" > REAGENTS </td></tr> في <tr><td>الوقت المناسب للفئران</td><td></td><td></td> الحامل <td>ليتم تشريحها في المرحلة الجنينية من الاهتمام</td></tr> مكافحة <tr><td>الفئران CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110-35</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>BD Bioscience</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>كولاجيناز ، النوع الأول</td><td>ورثينجتون الكيمياء الحيوية</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>وسط نمو الخلايا البطانية</td> <td>(صنع في المختبر كما هو موضح في الملاحظات)</td><td></td> <td>DMEM يحتوي على 20٪ FBS ، 5 & mu ؛ M &# 946 ؛ -mercapt &# 8211 ؛ ثانول ، 50 مو ؛ جم / مل تخطيط كهربية القلب ، و 1x البنسلين / الستربتومايسين</td></tr> <tr><td>&# 946 ؛ -mercapt &# 8211 ؛ ثانول</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>ECGS</td><td>Biomedical Technologies، Inc.</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>384-well culture plate</td><td>Greiner</td><td>T-3037-6</td><td>تم تحضير اللوحة باستخدام هلام الكولاجين الرقيق ، كما هو موضح في 6 ؛ مساحة سطح العمل 10 مم 2</td></tr> <tr><td>الكولاجين من النوع الأول</td><td>BD</td><td>354236</td><td>الاستخدام في النهائي تركيز 1.5 مجم / مل</td></tr><tr><td>M199 ، 10x</td><td>Invitrogen</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>يستخدم حسب التوجيهات في 13 <</td></tr><tr>TD Colspan = "4" ><قوي>المعدات< / قوي ></td></tr><tr><td>مجهر مجني</td><td>نيكون</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>حاضنة ثقافة الخلايا</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي على الطاولة</td><td>Thermo</td><td>75002430</td><td></td></tr></tbody></table>

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

ثقافة الخلية عززت بشكل كبير من قدرتنا على تقييم السكان من الخلايا الفردية في ظل ظروف ثقافة لا تعد ولا تحصى. بينما خطوط الخلايا خلد توفر مزايا كبيرة لسهولة استخدامها، وهذه خطوط الخلايا غير متوفرة لجميع أنواع الخلايا المحتملة. من خلال عزل الخلايا الأولية من منطقة محددة من الفائدة، ولا سيما من الماوس المعدلة وراثيا، ودراسات أكثر دقة لا يمكن أن يؤديها. الأسلوب الذي ينطوي على تشريح الأساسية للجهاز أو الجهاز الجزئي للاهتمام (مثل القلب أو منطقة محددة من القلب) والفصل بين الجهاز إلى الخلايا واحد. ثم يتم تحضين هذه الخلايا مع حبات مغناطيسية مترافق إلى الأجسام المضادة التي تعترف نوع من الخلايا في المصالح. الخلايا من الفائدة يمكن أن ثم تكون معزولة مع استخدام المغناطيس، مع التربسين الحضانة قصيرة الانفصال الخلايا من الخرز. ويمكن بعد هذه الخلايا المعزولة يكون مثقف وتحليلها كما تريد. وقد تم تصميم هذه التقنية في الأصل لجهاز الماوس الكبارو لكن يمكن زيادتها بسهولة إلى أسفل للاستخدام مع أجهزة الجنينية، كما هو موضح هنا. لأن مصلحتنا هي في الأوعية الدموية التاجية النامية، أردنا أن دراسة هذه الفئة من السكان من الخلايا الجنينية خلال مراحل محددة. وهكذا، فإن البروتوكول الأصلي إلى تعديل لتكون متوافقة مع صغر حجم البطينين الجنينية والعائد قدرة منخفضة من الخلايا البطانية في هذه المراحل التنموية. الاستفادة من هذا النهج تحجيم، قمنا بتقييم التاجي الضفيرة إعادة عرض في المعدلة وراثيا الجنينية الخلايا البطانية البطين.

استخدام أجسام مضادة محددة البطانية التي تعترف CD31، تم عزل الخلايا البطانية من البطينين من الجنينية (E) 13.5 (الشكل 1A) و 18.5 (أرقام 1B-1D) الأجنة. عندما نمت على طبق ثقافة غير المعالجة، تبقى هذه الخلايا تقريب وسوف تشكل نمطا حصوه إذا قرب متموجة (الشكل 1A). كما تم استخدام تمييع الكولاجين لمعطف الآبار، وبينما الخلايا البطانية والتمسك به (الشكل 1B)، فإنها تشكل أقل من السلاسل عندما مطلي على هلام الكولاجين (أرق...

ثقافة الخلية الأولية هي تقنية مفيدة لتحليل فئات معينة من السكان من الخلايا، لا سيما من أجنة الفئران المعدلة وراثيا في مراحل نمو محددة. هنا، يتم تشريح البطينين الجنينية وفصلها، والخرز الأجسام المضادة، مترافق الاعتراف وفصل الخلايا البطانية لمزيد من التحليل.

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا البطانية البطينية الجنينية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استعادة الجنين من أجل التشريح، ثم يتم استئصال القلب.تتم إزالة الأذينات ونقل البطينات المفرومة إلى محلول كولاجين. ثم يتم تحضين معلق الخلايا المفردة مع جسم مضاد يتعرف على الخلايا البطانية. وأخيرًا، يُستخدم مغناطيس لعزل الخلايا البطانية المرتبطة بالجسم المضاد.في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر تكوين السلاسل البطانية من خلال المجهر الضوئي. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التطور القلبي الوعائي، مثل العوامل التي تعزز هجرة الخلايا البطانية التاجية. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول سلوك الخلايا البطانية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على أنواع أخرى من الخلايا مثل الخلايا العضلية والأرومات الليفية. في اليوم السابق لإجراء التشريح، وأثناء العمل في غطاء زراعة الأنسجة، ادمج الأجسام المضادة المختارة مع حبيبات dyna beads المناسبة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة للأجسام المضادة rat anti CD 31 المستخدمة هنا.يتم إضافة 3 µL من الأجسام المضادة إلى 25 µL من الخرزات للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1.5 µg في 10⁷ خرزة، ثم تُحضن الخرزات في الأجسام المضادة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. ولتحضير هلامات الكولاجين لتكوين الأنيبيبات السريع للخلايا المعزولة، يتم دمج الكولاجين من النوع الأول والماء المقطر، و10X M 1 99، وهيدروكسيد الصوديوم بتركيز 5 M داخل غطاء زراعة الأنسجة على الثلج. ووفقاً لبروتوكول النص، يتم نقل 20 µL من هلام الكولاجين بواسطة الماصة إلى آبار طبق زراعة أنسجة يحتوي على 384 بئراً.ضع الطبق في حاضنة زراعة أنسجة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة. أضف 80 µL من DMM إلى كل بئر واتركها للحضن لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 37 °C. قم بإزالة وسط الزرع وكرر عملية الغسل مرتين إضافيتين، وبعد الشطف النهائي، أضف 80 µL من 10%FBS DM إلى كل بئر واتركها للحضن طوال الليل عند درجة حرارة 37 °C.بعد القتل الرحيم لفأرة حامل في توقيت محدد في اليوم الجنيني المطلوب، وباستخدام تقنية معتمدة وإزالة قرن الرحم وفقاً للبروتوكول النصي، ضعه في طبق بتري يحتوي على XPBS وقم بشطفه. وبمجرد كشف الأكياس الجنينية عبر شق وسطي عند نقطة التقاء المشيمة والجنين، اقطع كيساً جنينياً واستخرج الجنين.ضع الجنين في طبق بتري ثانٍ يحتوي على PBS بارد، وأعد قرن الرحم إلى الثلج لتحسين إمكانية الوصول إلى جدار الصدر لفصل رأس الجنين. وفي حال إجراء التنميط الجيني، اقطع الذيل واحفظه في أنبوب على الثلج. ثم ضع الجنين على ظهره وقم بالقص.افتح جدار الصدر لرؤية القلب والرئتين لتجنب قطع القلب. قم بإجراء قطع عمودي على طول جانب القفص الصدري بالقرب من أحد الأطراف الأربعة، يليه قطع أفقي عبر الجزء السفلي من الأضلاع. ثم اسحب جدار الصدر برفق للأعلى وبعيداً عن الطريق حتى اليوم الجنيني 13.5 تقريباً.يكون جدار الصدر شفافاً، مما يساعد في عملية التصوير. وباستخدام الملاقط، ارفع القلب بعناية واقطع الأوعية الموجودة تحته. وإذا رغبت في ذلك، انقل القلب إلى طبق نظيف لتحريره من الرئتين، مع القطع فوق الأوعية الكبيرة.بعد ذلك، افصل الأذينين والأوعية الدموية الكبيرة عن البطينين وتخلص منهما. ثم باستخدام المقص، قم بتقطيع البطينين إلى قطع صغيرة وضعها في حوالي 500 µL من الكولاجينيز على الثلج. استأصل البطينين من بقية الأجنة وقم بمعالجتهما، مع جمع كل قلب في أنبوب منفصل.ضع البطينات المفرومة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع التحريك المستمر لمدة 45 دقيقة. كل 15 دقيقة، أخرج العينات برفق وقم بالماصة صعوداً وهبوطاً لتفكيك الخلايا ميكانيكياً. بعد فترة التحضين، مرر محلول الكولاجيناز الخاص بالبطينات عبر مرشح 70 ميكرومتر لإزالة تكتلات الخلايا المتبقية، ثم قم بطرد مركزي للخلايا عند 400 G لمدة 10 دقائق، وتخلص من السائل الطافي واستبدله بحوالي 200 ميكرولتر من 10%FBS في DMEM؛ قم بالماصة صعوداً وهبوطاً لإعادة تعليق الخلايا، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى، وبعد غسلة ودورة طرد مركزي ثانية، أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من 10%FBS في dmm.بعد ذلك، قم بتحضير الحبيبات بوضع أنبوب الأجسام المضادة والحبيبات أولاً على مغناطيس لمدة دقيقة واحدة، ثم اسحب السائل الطافي. بعد ذلك، أخرج الأنبوب من المغناطيس وأضف ما يقرب من 100 µL من 10% FBS في dmm. أعد الأنبوب إلى المغناطيس لمدة دقيقة واحدة، ثم قم بإزالة السائل الطافي.كرر عملية الغسل ثلاث مرات إجمالاً بعد الغسلة النهائية. أعد تعليق الخرزات المقترنة بالأجسام المضادة في 10%FBS في DMM لكل عينة خلايا، وأضف خمسة ميكرولتر 5 µL من الخرزات المقترنة بالأجسام المضادة. ضع معلقات الخرزات والخلايا عند درجة حرارة 4 °C مع التحريك المستمر لمدة 30 دقيقة داخل غطاء التدفق الصفائحي، ثم ضع العينات على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة، واسحب السائل الطافي.أزل الأنابيب من المغناطيس واغسلها بنحو 100 µL من 10%FPS وdm. كرر العملية لإجراء خمس غسلات إجمالاً بعد الغسلة النهائية. علّق الخرز في نحو 100 µL من DMEM.ضع الأنابيب على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة الوسط، ثم أضف من 100 إلى 200 µL من trypsin بتركيز 0.25% في EDTA المسخن مسبقاً، واحضن العينات عند 37 °C و 5% CO2 لمدة خمس دقائق. ضع الأنابيب على المغناطيس لمدة دقيقتين.بعد ذلك، انقل بعناية الخلايا التي تحتوي على المادة الطافية إلى أنابيب جديدة وافصلها بجهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 400 G. وأخيراً، بعد إزالة المادة الطافية، قم بإعادة تعليق الخلايا في 80 إلى 100 µL من وسط نمو الخلايا البطانية وازرعها في طبق زراعة معالج يحتوي على 96 أو 384 بئراً، اعتماداً على الإنتاجية المتوقعة؛ حيث ينتج كل زوج من البطينين من أجنة في المراحل من E 14.5 إلى E 16.5 عادةً ما بين 450 إلى 600 خلية، كما تم توضيحه هنا باستخدام جسم مضاد محدد للخلايا البطانية يتعرف على CD 31. تم عزل الخلايا البطانية من بطينات أجنة في اليوم E 13.5.عندما تُزرع هذه الخلايا في طبق زراعة غير معالج، تظل مستديرة وتُشكل نمطاً يشبه رصف الحجارة عندما تقترب من مرحلة التلاحم. وعلى الرغم من أن الخلايا ستلتصق بالأطباق المطلية بالكولاجين المخفف، فإن هذه الخلايا المعزولة من البطينات في اليوم الجنيني 18.5 تُشكل سلاسل أقل مقارنة بما يحدث عند طلائها على هلام الكولاجين. بالإضافة إلى ذلك، تشكل الخلايا تفاعلات بين-خلوية وسلاسل بشكل أسرع، وتتفرع على هلام الكولاجين مقارنة بالأطباق المطلية بالكولاجين، وذلك للتحقق من هويتها.تظهر الخلايا في هذا الشكل تسمية إيجابية باستخدام الواصم البطاني ISO selectin. بالإضافة إلى ذلك، وكما هو موضح هنا، أظهرت الخلايا البطانية المعزولة من بطينات الجنين في المرحلة E 18.5 تسمية إيجابية باستخدام الواصمات البطانية PAM و flick one. يوضح هذا الشكل الخلايا البطانية التي تم عزلها من بطينات جنين في المرحلة E 14.5 وتم تسميتها بصبغة cyto النوعية للخلايا البطانية.تبقى 16 خلية معزولة على قيد الحياة لمدة تصل إلى أسبوع من الزرع، ولكنها مقاومة لعملية الـ ization، وبناءً على ذلك فهي الأنسب للتجارب النهائية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون ثلاث ساعات ونصف تقريبًا إذا نُفذت بشكل صحيح. وعقب هذا الإجراء، يمكن إجراء فحوصات أخرى مثل فحوصات تكوين الأنابيب وفحوصات الهجرة عبر الغشاء (transwell migration assays) لتحديد سلوك هذه الخلايا المعزولة في المختبر (in vitro).

isolation-of-embryonic-ventricular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا البروتوكول فيديو يوضح العزلة وثقافة الإنسان الخلايا البطانية الوريد السري (HUVEC) من الحبل السري البشري. مرة واحدة معزولة يمكن استخدام هذه الخلايا لتكوين الأوعية الدموية في المختبر فحوصات مثل الفحص الفايبرين محسن الخرزة جل أظهرت أيضا من قبل مختبر هيوز.

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي (HUVEC)

نحن نقدم طريقة لعزل وزراعة السكان نقية من خلايا صمام القلب البطانية (مركزنا). يمكن عزل مركزنا من جانبي نتوء أو النشرة وبعدها مباشرة ، الخلية الأساسية خلالي (VIC) العزلة واضح ومباشر.

عزل الخلايا البطانية صمامي

هذه المادة سوف توفر وسيلة لعزل وزراعة السمان أو الدجاج...

العزلة وثقافة الطيور الجنينية الخلايا الاصلية صمامي

هنا ، نحن تصف بروتوكول للثقافة العزلة والفئران من خلايا بطانة الأوعية الدموية الرئوية. يضم هذا الأسلوب ميكانيكي والأنزيمية تفارق أنسجة الرئة ، فضلا عن عملية تنقية 2 - خطوة استخدام الألغام المضادة للPECAM - 1 ومعاداة ICAM - 2 الأضداد مترافق إلى حبات المغناطيسي ، والتي تنتج الخلايا البطانية نقية السكان من أصل الاوعية الدموية الدقيقة في معظمها.

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

يوضح هذا الفيديو استراتيجية سهلة وموثوقة لإعداد الثقافات نقية من الخلايا البطانية من الدماغ الأمامي الجنينية داخل 10-12 يوما، وسوف يكون من المفيد للبحوث تركز على جوانب كثيرة من الأوعية الدموية الدماغية.

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

تعد القدرة على عزل الخلايا البطانية لصمام القلب (VECs) أمرا بالغ الأهمية لفهم آليات تطوير الصمام وصيانته ومرضه.  نصف هنا عزل VECs عن الفئران الجنينية والبالغة Tie2-GFP باستخدام FACS الذي سيسمح بإجراء دراسات تحدد مساهمة VECs في عمليات النمو والمرض.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

للدم الجذعية والسلف الخلايا (HSPC) مستمدة من المتخصصة (مكون للدم) الخلايا البطانية خلال تطوير، ولكن لا يعرف الكثير عن العملية التي بعض الخلايا البطانية تحدد لتصبح تكوين الدم. ونحن لشرح طريقة التدفق الخلوي على أساس السماح العزلة في وقت واحد من الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC من الأنسجة الجنينية في الفئران.

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

والهدف من هذا البروتوكول عزل السلف غشائي الخلايا من دم الحبل السري. وتشمل بعض التطبيقات باستخدام هذه الخلايا كالعلامات البيولوجية لتحديد المرضى مع مخاطر القلب والأوعية الدموية، علاج الأمراض الدماغية، وخلق صمام الأوعية الدموية والقلب هندسة الأنسجة بنيات.

عزل خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري البشري

نقدم بروتوكولًا لعزل الخلايا الأندية والانهوائية التاجية من قلوب الفئران من خلال هضم الأنسجة بالتتابع في عازل للهضم وجمع الخلايا من دورات الطرد المركزي المتكررة وتنقية الخلايا باستخدام الميكروبات CD31 المضادة للفئران.

عزل الخلايا الإندوكاريال والشريان التاجي من الجدار الحر البطيني للقلب الجرذ

يصف هذا البروتوكول العزلة الحادة لخلايا العضلات الملساء القلبية والوعائية القابلة للحياة من أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات والجنينية (Danio rerio) ، وهي مناسبة للدراسات الكهربية.

عزل خلايا العضلات الملساء القلبية والوعائية عن أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات والجنينية للدراسات الكهروفسيولوجية

على الرغم من التحدي ، فإن عزل الخلايا البطانية الرئوية ضروري للدراسات حول التهاب الرئة. يصف هذا البروتوكول إجراء للعزل عالي الغلة وعالي النقاء للخلايا البطانية الوعائية الكبيرة والأوعية الدموية الدقيقة.

عزل الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة والأوعية الدموية الكبيرة وتنقيتها من العينات المشتقة من الرئة

تعلم عزل الخلايا البطانية البطينية الجنينية من أجنة الفئران المعدلة وراثياً باستخدام الأجسام المضادة والفصل المغناطيسي. تتيح هذه الطريقة دراسة تطور الأوعية الدموية وسلوك الخلايا البطانية.

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية

استكشف المزيد من الفيديوهات