جهاز الاستشعار البيولوجي للكشف عن المضادات الحيوية البكتيريا العنقودية الذهبية المقاومة لل

الهدف العام من التجربة التالية هو التمييز بين سلالات الميثيسيلين المقاومة للميثيسيلين أو MRSA والميثيسلين الحساسة ، أو سلالات MSSA من المكورات العنقودية الذهبية بواسطة عاثية مختارة بشكل خاص مضادة للبكتيريا المحللة المعدلة. عندما ترتبط البكتيريا بذيول طويلة مرنة للعاثية اللايتية ، تكون المسافة بين الخلايا المرفقة وسطح المستشعر أكبر من تغلغل الموجة الصوتية لمراقبة الجودة m. لذلك ، لا يتم إنشاء إشارة حدث الربط.

يؤدي استبدال العاثية السليمة بالعاثية الكروية إلى عاثية تعمل بكامل طاقتها مع ذيول قصيرة ، والتي تربط البكتيريا داخل عمق اختراق الموجة الصوتية لمراقبة الجودة ، وبالتالي تساهم في تغيرات التردد والتبديد عندما يتم ترسيب المنشطات العاثية على بلورة A-Q-C-M-D وتتعرض للتعليق البكتيري المختلط ، فهي تربط كل من سلالات MRSA و MSSA من المكورات العنقودية الذهبية ، ولكن ليس البكتيريا الأخرى التي تفصل المكورات العنقودية الذهبية عن البكتيريا الأخرى الموجودة على سطح البلورة. أخيرا ، عندما تتم إضافة حبات PPP محددة من MR.RSA ، يتم إنشاء إشارة في وجود سلالات Mr.RSA من المكورات العنقودية الذهبية. المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل هي أن هذه الطريقة لا تتطلب استخراج الحمض النووي وليست حساسة للتجربة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لفحص وتطهير المكورات العنقودية أو ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على البكتيريا الأخرى المقاومة للمضادات الحيوية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن تصنيع أجهزة الاستشعار الحيوية يتطلب الدقة والدقة والصبر. ابدأ بتنظيف قطع الكوارتز المشفرة بالذهب عن طريق حفر البلازما في الأرجون لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتعقيم القطع لمدة ست ساعات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في خزانة معقمة بعد التعقيم عند 50 ميكرولتر من تعليق العاثيات على السطح الذهبي لكل قطعة في طبق بتري معقم ، ثم احتضان القطع طوال الليل في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة تعليق العاثيات المتبقي للتنعير ، ثم اغسل كل قطعة كوارتز بعاثية مربوطة خمس مرات باستخدام PBS لإزالة أي عاثية غير مرتبطة.

لاختبار عدوى العاثية الجمودة على سطح جاف ، انشر أولا مزرعة المكورات العنقودية الذهبية بين عشية وضحاها على NZY eRate واترك المعلق يجف. ثم ضع قطعة كوارتز مطلية بالذهب مع عاثية ثابتة ووجهها لأسفل على اللوحة. بعد 12 ساعة عند 37 درجة مئوية ، يمكن ملاحظة منطقة تحلل تشير إلى العدوى لاختبار النشاط اللايتي للعاثية الحرة في السائل.

أولا ، أضف مزرعة بكتيرية بين عشية وضحاها من المكورات العنقودية الذهبية إلى 10 مل من NZY في كل من أربع قوارير ذراع جانبية سعة 300 ملليلتر. ثم أضف اثنين في 10 إلى ستة PFU لكل مليلتر من العاثية الحرة إلى اثنين من القوارير. الآن ، راقب المسار الزمني لتحلل خلايا المكورات العنقودية لمدة 570 دقيقة عن طريق قياس الكثافة الضوئية على فترات 30 دقيقة لكل قارورة مع أخذ القياس النهائي في 24 ساعة.

لاختبار النشاط اللايتي للعاثية المرتبطة في السائل ، كرر الخطوات الموضحة للتو ، ولكن أضف قطعا ذهبية مع عاثية مربوطة إلى القوارير التجريبية بدلا من العاثية الحرة. لتحضير المنشطات العاثية ، قم أولا بدمج 400 ميكرولتر من تعليق العاثية 1 2600 مع حجم متساو من الأطياف الضوئية الصف الكلوروفورم في قارورة مليلتر واحد في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بدوامة تعليق الكلوروفورم التابع للعاثية برفق من خمس إلى ست مرات على فترات خمس ثوان على مدى دقيقة واحدة.

بعد السماح للتعليق بالاستقرار لمدة 30 ثانية, جمع الجزء العلوي الذي يحتوي على تعليق الستيرويد. نقل بضعة ميكرولترات من تعليق الستيرويد إلى قارورة 500 ميكرولتر للنقل ومسح المجهر الإلكتروني. حفظ تعليق الستيرويد المتبقي في قنينة مليلتر واحد لتصنيع أجهزة الاستشعار الحيوية.

لتحضير المستشعر الحيوي أولا ، قم بتنظيف مستشعرات QCMD عن طريق نقش البلازما في الأرجون لمدة 10 دقائق في منظف البلازما. ثم اشطف المستشعرات بالهكسان لإزالة أي شوائب عضوية. بعد ذلك ، قم بتنظيف حوض من توازن الفيلم كما وصفه أولسون إيتال سابقا في مجلة الطرق الميكروبيولوجية.

عن طريق ملء حوض LB بمحلول الطور الفرعي وتنظيفه بحاجز حوض صغير. ثم قم بتثبيت الحوض الصغير عند 20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الآن قم بإنشاء طبقة أحادية من العاثية على محلول الطور الفرعي LB عن طريق تقطير 300 ميكرولتر Eloqua من التعليق المائي للعاثية 1 2600 بعناية ، وهو قضيب زجاجي مائل صالح للأكل مغمور جزئيا في مرحلة SOPH بعد السماح للطبقة الأحادية بالاستقرار لمدة 10 دقائق ، قم بضغط الطبقة الأحادية بمعدل 30 ملم في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى ضغط ثابت يبلغ 19 نيوتن لكل متر.

ترسيب الفيلم العمودي هو أصعب جزء في هذا الإجراء. لضمان النجاح ، يحتاج المرء إلى التأكد من أن جميع مكونات هذا الإجراء نظيفة ويجب أيضا تحسين معلمات الترسيب أحادية الطبقة. الآن قم بغمس المستشعر داخل وخارج الطبقة الأحادية سبع مرات متتالية بمعدل 4.5 ملم في الدقيقة لإجراء ترسيب الفيلم الرأسي.

على مستشعر QCMD العمودي. يربط ترسيب الفيلم العمودي العاثية السليمة بسطح المستشعر الحيوي. أخيرا ، استخدم المستشعرات الحيوية للعاثيات المصنعة للكشف عن MRSA المجهري الإلكتروني وقياس البصريات لكل من العاثية الحرة والمرتبطة.

ابدأ هذه الخطوة بإنشاء خطوط الأساس وتردد الرنين وتبديد الطاقة لمستشعر QCM في الماء باستخدام برنامج qof T. بعد حوالي 30 دقيقة ، ارسم معلقة من الخلايا البكتيرية المكورات العنقودية الذهبية الحساسة للميثيسلين الحية أو الخلايا البكتيرية MSSA في الماء من خلال خلية الاختبار. يعرض الخط الأزرق قيمة التردد بينما يوضح الخط الأحمر مستوى تبديد الطاقة.

تظهر الخطوط الأفقية إنشاء خط الأساس. يشير الرقم الثاني في منتصف الشاشة إلى أن الأحداث مرتبطة بالمستشعر. يراقب الرقم الثاني من أصل أربعة باستمرار التغييرات في تردد الرنين وتبديد الطاقة لأجهزة الاستشعار لأول نغمة معروضة.

فيما يلي التغييرات بعد اجتياز البكتيريا لخلية الاختبار. لاحظ أن الأمر لا يستغرق سوى بضع ثوان حتى ينخفض التردد ويزداد تبديد الطاقة عندما تصل التغييرات في تردد رنين المستشعرات وتبديد الطاقة الداخلية إلى مستويات التشبع عند تعليق سرعات اللاتكس المترافقة بالأجسام المضادة PVP إلى التدفق ومواصلة المراقبة المستمرة لتبديد التردد. تظهر هنا عملية الكشف بأكملها التي توضح إنشاء خطوط الأساس ، والتغيير في الثواني القليلة في التردد وتبديد الطاقة بعد إضافة البكتيريا ، والتشبع ، وأخيرا التغييرات بعد إضافة الخرز.

يوضح هذا الجدول النشاط اللايتي للعاثية المثبت ضد جميع السلالات المختبرة من S reus ، بما في ذلك سلالات MRSA كما هو موضح في اختبار بقعة العاثية. تراوحت أحجام البلاك بشكل عام من خمسة إلى 15 ملم. لم يتم العثور على أي نشاط ضد ثقافات الاختبار الأخرى.

هنا ، يظهر النمو الطبيعي للمكورات العنقودية Urus A TCC 1 2600 في وسط NZ Y على حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية مع زيادة عدد البكتيريا من 3.2 في 10 إلى ستة إلى 4.0 مرات 10 إلى ثمانية CFU لكل مليلتر. في حوالي 24 ساعة ، أظهرت العاثية المشمولة على سطح ذهبي نشاطا لايتيا مشابها لنشاط العاثية المعلقة. ظلت العاثية المجمدة معدية في عدوى بكتيرية جديدة حتى بعد استخدامها في تجربة نمو لمدة 24 ساعة ، وعدة غسلات وتخزين في PBS لمدة ستة أيام عند أربع درجات مئوية.

في هذه الصورة ، يمكن ملاحظة الليزوزوم حول القطعة الذهبية مما يشير إلى أن العاثيات المجمدة قادرة على تحلل الخلايا البكتيرية. لذلك ، كما هو موضح هنا ، فإن الانخفاض الفعال في نمو البكتيريا الموجود في الزراعة المشتركة للبكتيريا والعاثيات المسرحة هو نتيجة للتفاعل الأساسي للبكتيريا العالقة بالماء والعاثيات المقيدة. هنا ، يتم عرض الصور المجهرية الإلكترونية للإرسال والمسح الضوئي للعاثية اللايتية السليمة 1 2600 على سطح ركيزة ذهبية عندما يخضع تعليق العاثية لمعالجة الكلوروفورم ، ويتقلص ذيل العاثية في الطول ويثخن ويصبح الرأس متعدد الأضلاع مستديرا أو الستيرويد.

على الرغم من التغييرات الهيكلية الكبيرة. لم يتغير النشاط اللايتي للستيرويد كما تم قياسه بأرقام البلاك نتيجة لمعالجة الكلوروفورم. لم تظهر مستشعرات QCM ذات العاثيات اللايتية المجمدة أي تغييرات كبيرة في تردد الرنين أو تبديد الطاقة عندما تعرضوا ل MRSA مما يشير إلى أن تفاعل العاثيات MRSA أدى إلى تغيير في الكتلة.

وفقا ل QCM ، كشفت الصور المجهرية الإلكترونية لأجهزة الاستشعار الحيوية بعد الفحص عن ارتباط بكتيري كبير على سطح المستشعر. عندما تم حقن معلقات MRSA في خلية التدفق باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية للستيرويد العاثية ، لوحظ انخفاض كبير في التردد وزيادة في التبديد. بعد تفاعلات ربط بكتيرية العاثية الكروية MRSA ، تعرضت مستشعرات الفحص لتعليق سرعة اللاتكس المترافق بالجسم المضاد BBP two A.

استجابت أجهزة الاستشعار الحيوية لفحص MRSA لتعليق سرعة اللاتكس المترافق بالجسم المضاد BPP حيث لوحظ انخفاض إضافي في التردد وزيادة في التبديد. تم تأكيد ارتباط MSA بمجسات العاثيات و PPP اثنين من سرعات اللاتكس المترافقة مع الجسم المضاد A باستخدام تحقيقات الفحص المجهري الإلكتروني الماسح. عندما تعرض المستشعر الحيوي للستيرويد العاثية ل MSSA ، لوحظ انخفاض كبير في التردد وزيادة في التبديد بعد تفاعلات ربط MSSA للعاثية ، تم تحدي مستشعرات الفحص مع PPP اثنين من تعليق سرعة اللاتكس المترافق مع الأجسام المضادة A.

في البداية ، أظهر المستشعر الحيوي لمقايسة MSSA عابرا قصيرا للزيادات في التردد وانخفاضا في التبديد بعد بضع دقائق من تفاعلات سرعات اللاتكس المترافقة مع الأجسام المضادة MSSA و PPP. ومع ذلك ، يعود التردد إلى ما بعد PVP اثنين من مستويات إدخال الجسم المضاد A ، لكن الطاقة deci زادت. ثم تم تحليل ارتباط MSSA بمجسات العاثيات عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني ، ولكن لم يلاحظ هنا ارتباط بين MSSA و PPP سرعتين من اللاتكس المترافق بالجسم المضاد A ، ويتم عرض ملف تعريف سمك متماثل للقطع الناقص وخريطة سمك ثلاثية الأبعاد للعاثية اللايتية.

تم رسم خط عبر خريطة السماكة لإنشاء ملف تعريف السماكة. تظهر هذه الصور الأخيرة صورا تمثيلية للكاميرا البصرية CCD ل MRSA تم التقاطها بواسطة العاثيات المرتبطة بالسطح الذهبي لمستشعر A-Q-C-M-D وملامح شدة ثلاثية الأبعاد ل MRSA على ركائز زجاجية ثابتة للعاثيات بتركيز 10 إلى ثمانية CFU لكل مليلتر و 10 إلى تسعة CFU لكل مليلتر. تمثل كل دائرة مستديرة بكتيريا واحدة.

من الواضح أن زيادة تركيز البكتيريا في التعليق السائل من 10 إلى ثمانية CFU لكل مليلتر إلى 10 إلى تسعة CFU لكل مليلتر يؤدي إلى ارتفاع كبير في البكتيريا التي تم التقاطها في ملامح كثافة 3D. يتناسب عدد القمم البيضاء على الطبقة العليا مع عدد البكتيريا التي تم التقاطها ، وكما هو متوقع ، تزداد كثافة القمم بشكل كبير عند زيادة التعرض للبكتيريا من 10 إلى ثمانية إلى 10 إلى تسعة CFUs لكل مليلتر. تتوافق الطبقة الزرقاء الداكنة السفلية مع طبقة العاثيات التي تلامس ركيزة ذهبية.

مع التقاط المزيد من البكتيريا ، تتغير الخصائص البصرية للعاثيات لأنها ترتبط بالبكتيريا مما يؤدي إلى لون أزرق أغمق وأكثر كثافة. باتباع هذا الإجراء ، يمكننا تحديد كفاءة التقاط البكتيريا من أجل فهم تفاعلات بكتيريا العاثيات بعد التطوير. توضح هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج بالعاثيات البكتيرية لاستكشاف تثبيط مسببات الأمراض في والبشر لا تنس أن العمل مع المذيبات العضوية في البكتيريا المسببة للأمراض يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، واتباع اللوائح الصارمة مهم جدا.