جهاز الاستشعار البيولوجي للكشف عن المضادات الحيوية البكتيريا العنقودية الذهبية المقاومة لل

الهدف العام من التجربة التالية هو التمييز بين سلالات Staphylococcus aureus المقاومة للميثيسيلين (MRSA) والسلالات الحساسة للميثيسيلين (MSSA)، وذلك باستخدام عاثيات بكتيرية حالة (lytic phages) معدلة ومختارة خصيصاً. عندما ترتبط البكتيريا بالذيول المرنة الطويلة للعاثيات الحالة، تصبح المسافة بين الخلايا المرتبطة وسطح المستشعر أكبر من مدى اختراق الموجة الصوتية لـ QC m، وبالتالي لا يتم توليد إشارة لحدث الارتباط.

يؤدي استبدال العاثية السليمة بالجسيمات الكروية إلى الحصول على عاثيات وظيفية بالكامل ذات ذيول قصيرة، والتي ترتبط بالبكتيريا ضمن عمق اختراق الموجة الصوتية لجهاز الـ QC m، مما يساهم بالتالي في تغيرات التردد والتشتت عند ترسيب ستيرويدات العاثية على بلورة A-Q-C-M-D وتعريضها لمعلق بكتيري مختلط؛ حيث ترتبط هذه العاثيات بكل من سلالات MRSA وMSSA من بكتيريا staphylococcus aureus، ولكنها لا ترتبط بأنواع البكتيريا الأخرى، مما يعمل على فصل staphylococcus aureus عن البكتيريا الأخرى على سطح البلورة. وأخيراً، عند إضافة الخرز المرتبط بالأجسام المضادة PPP two A الخاصة بـ Mr.RSA، يتم توليد إشارة في وجود سلالات Mr.RSA من staphylococcus aureus. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل PCR في أن هذه الطريقة لا تتطلب استخلاص الحمض النووي DNA وغير حساسة للمؤثرات التجريبية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول فحص وتطهير بكتيريا staphylococcus orus، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنواع أخرى من البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً ضرورياً لأن تصنيع المستشعرات الحيوية يتطلب الدقة والإتقان والصبر. ابدأ بتنظيف قطع الكوارتز المطلية بالذهب عن طريق النقش بالبلازما في جهاز Argonne لمدة 10 دقائق، ثم قم بتعقيم القطع لمدة ست ساعات تحت الأشعة فوق البنفسجية في خزانة تعقيم، وبعد التعقيم يتم إضافة 50 µL من معلق العاثيات إلى السطح الذهبي لكل قطعة في طبق بتري معقم، ثم تُحضن القطع طوال الليل في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة؛ وفي الصباح التالي، يتم إزالة معلق العاثيات المتبقي لتقدير العيار، ثم تُغسل كل قطعة كوارتز مرتبطة بالعاثيات خمس مرات باستخدام PBS لإزالة أي عاثيات غير مرتبطة.

لاختبار قدرة العاثيات المثبتة على العدوى على سطح جاف، يتم أولاً نشر مزرعة مبيتة من بكتيريا Staphylococcus aureus على طبق NZY eRate، وتُترك المعلق لتجف. بعد ذلك، تُوضع قطعة من الكوارتز المطلية بالذهب والمثبت عليها العاثيات ووجهها لأسفل على الطبق. وبعد مرور 12 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، يمكن ملاحظة منطقة تحلل تشير إلى القدرة على العدوى؛ ولاختبار النشاط المحلل للعاثيات الحرة في السائل.

أولاً، أضف مزرعة بكتيرية مبيتة من staphylococcus aureus إلى 10 milliliters من NZY في كل من أربع دوارق ذات ذراع جانبية سعة 300 milliliter. ثم أضف 2 × 10⁶ PFU لكل milliliter من العاثيات الحرة إلى اثنين من الدوارق. الآن، راقب التسلسل الزمني لتحلل خلايا staphylococcus لمدة 570 دقيقة عن طريق قياس الكثافة الضوئية على فترات زمنية مدتها 30 دقيقة لكل دورق، مع أخذ قياس نهائي عند 24 ساعة.

لاختبار النشاط التحللي للعاثلات المرتبطة في السائل، كرر الخطوات التي تم توضيحها للتو، ولكن أضف قطع الذهب المرتبطة بالعاثلات إلى الدوارق التجريبية بدلاً من العاثلات الحرة. ولتحضير ستيرويدات العاثلات، ادمج أولاً 400 µL من معلق stock phage 1 2600 مع حجم مساوٍ من الكلوروفورم بدرجة نقاء قياس طيفي في أنبوب سعة 1 mL في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم برج معلق العاثلات والكلوروفورم بلطف باستخدام جهاز vortex من خمس إلى ست مرات، بفاصل زمني قدره 5 seconds في كل مرة، على مدار دقيقة واحدة.

بعد ترك المعلق يستقر لمدة 30 ثانية، اجمع الجزء العلوي الذي يحتوي على معلق الستيرويد. انقل بضعة ميكرولترات من معلق الستيرويد إلى قارورة سعة 500 ميكرولتر لاستخدامها في المجهر الإلكتروني النافذ والماسح. احفظ ما تبقى من معلق الستيرويد في قارورة سعة واحد ملليلتر لتصنيع المستشعر الحيوي.

لتحضير المستشعر الحيوي أولاً، قم بتنظيف مستشعرات QCMD عن طريق النقش بالبلازما في غاز الأرغون لمدة 10 دقائق في منظف البلازما. ثم اشطف المستشعرات باستخدام الهكسان لإزالة أي شوائب عضوية. بعد ذلك، قم بتنظيف حوض ميزان الفيلم كما وصف سابقاً Olson Etal في مجلة Journal of Microbiological methods.

يتم ملء حوض LB بمحلول الطور السفلي وتنظيفه باستخدام حاجز الحوض. ثم يتم تثبيت درجة حرارة الحوض عند 20 °C لمدة 10 دقائق. الآن، يتم إنشاء طبقة أحادية من العاثيات على محلول LB للطور السفلي عن طريق تقطير 300 µL من المعلق المائي للـ phage 1 2600 بعناية باستخدام قضيب زجاجي مائل مغمور جزئياً في طور SOPH. بعد ترك الطبقة الأحادية لتستقر لمدة 10 دقائق، يتم ضغط الطبقة الأحادية بمعدل 30 mm/min حتى يتم الوصول إلى ضغط ثابت قدره 19 N/m.

يعد ترسيب الغشاء الرأسي الجزء الأكثر دقة في هذا الإجراء. ولضمان النجاح، يجب التأكد من نظافة جميع مكونات هذا الإجراء، كما يجب تحسين معاملات ترسيب الطبقة الأحادية. الآن، اغمر المستشعر في الطبقة الأحادية ثم أخرجه منها سبع مرات متتالية بمعدل 4.5 millimeters per minute لتنفيذ عملية ترسيب الغشاء الرأسي.

على مستشعر QCMD الموضوع بشكل عمودي. يؤدي ترسيب الغشاء الرأسي إلى ربط العاثيات السليمة بسطح المستشعر الحيوي. وأخيراً، تُستخدم المستشعرات الحيوية للعاثيات المُصنعة للكشف عن MRSA، والمجهر الإلكتروني، والبصريات الإلكترونية لكل من العاثيات الحرة والمربوطة.

ابدأ هذه الخطوة بتحديد القيم المرجعية، وتردد الرنين، وتبدد الطاقة لمستشعر QCM في الماء باستخدام برنامج qof T. بعد مرور 30 دقيقة تقريبًا، قم بتمرير معلق من خلايا بكتيريا *Staphylococcus aureus* الحية الحساسة للميثيسيلين أو MSSA في الماء عبر خلية الاختبار. يمثل الخط الأزرق قيمة التردد، بينما يوضح الخط الأحمر مستوى تبدد الطاقة.

توضح الخطوط الأفقية إنشاء الخط المرجعي. يشير الرقم اثنان في منتصف الشاشة إلى أن الأحداث مرتبطة بالمستشعر. يقوم الرقم اثنان من أصل أربعة بمراقبة التغيرات في تردد الرنين وتبدد الطاقة للمستشعرات باستمرار بالنسبة للنغمة فوق الصوتية الأولى الموضحة.

تظهر هنا التغيرات بعد مرور البكتيريا عبر خلية الاختبار. لاحظ أن التردد يستغرق بضع ثوانٍ فقط لينخفض ويزداد تبدد الطاقة عندما تصل التغيرات في تردد رنين المستشعرات وتبدد الطاقة الداخلية إلى مستويات التشبع عند تعليق حبيبات اللاتكس المقترنة بالأجسام المضادة PVP في التدفق، مع الاستمرار في المراقبة المستمرة للتردد والتبدد. يوضح الشكل هنا عملية الكشف الكاملة التي تبين إنشاء الخطوط المرجعية، والتغير الذي يستغرق بضع ثوانٍ في التردد وتبدد الطاقة بعد إضافة البكتيريا، والوصول إلى حالة التشبع، وأخيراً، التغيرات بعد إضافة الحبيبات.

يوضح هذا الجدول النشاط التحليلي للفاجات المثبت ضد جميع سلالات S reus المختبرة، بما في ذلك سلالات MRSA كما هو موضح في اختبار بقع الفاجات. وتراوحت أحجام اللويحات عمومًا من 5 إلى 15 مليمتر. ولم يتم العثور على أي نشاط ضد المزارع الاختبارية الأخرى.

يتم هنا توضيح النمو الطبيعي لسلالة staphylococcus Urus A TCC 1 2600 في وسط NZ Y باستخدام حاضنة هزازة عند 37 °C، حيث يزداد عدد البكتيريا من 3.2 × 10⁶ إلى 4.0 × 10⁸ CFU/mL. وفي غضون 24 ساعة تقريباً، أظهرت العاثيات المثبتة على سطح ذهبي نشاطاً تحللياً مماثلاً لنشاط العاثيات في المعلق. كما ظلت العاثيات المثبتة معدية عند نقلها إلى عدوى بكتيرية جديدة حتى بعد استخدامها في تجربة نمو استمرت 24 ساعة، وإجراء عدة عمليات غسيل، وتخزينها في PBS لمدة ستة أيام عند 4 °C.

في هذه الصورة، يمكن ملاحظة الجسيم الحالة (lysosome) حول قطعة الذهب، مما يشير إلى أن العاثيات المثبتة قادرة على تحلل الخلايا البكتيرية. وبناءً على ذلك، وكما هو موضح هنا، فإن الانخفاض الفعال في النمو البكتيري الملاحظ في المزرعة المشتركة للبكتيريا والعاثيات غير المتحركة هو نتيجة للتفاعل الأولي بين البكتيريا المعلقة في الماء والعاثيات المرتبطة. وتظهر هنا صور مجهرية إلكترونية نافذة وماسحة لـ lytic phage 1 2600 السليم على سطح ركيزة ذهبية؛ وعندما يتعرض معلق العاثيات للمعالجة بالكلوروفورم، يتقلص طول ذيل العاثية ويزداد سمكاً، بينما يصبح الرأس المضلع مستديراً أو يشبه الستيرويد.

على الرغم من التغيرات الهيكلية الملحوظة، فإن النشاط المحلل للستيرويد، مقاساً بأعداد اللويحات، لم يتغير نتيجة للمعالجة بالكلوروفورم. ولم تظهر مستشعرات QCM التي تحتوي على عاثيات محللة مثبتة أي تغيرات ذات دلالة في تردد الرنين أو تبدد الطاقة عند تعريضها لبكتيريا MRSA، مما يشير إلى أن التفاعل بين عاثية MRSA وبكتيريا MRSA أدى إلى تغير ضئيل في الكتلة.

ومع ذلك، وفقًا لتقنية ميزان الكوارتز الدقيق (QCM)، كشفت الصور المجهرية الإلكترونية للمستشعرات الحيوية بعد الاختبار عن ارتباط بكتيري ملحوظ على سطح المستشعر. وعند حقن معلقات MRSA في خلية التدفق التي تحتوي على مستشعرات حيوية من العاثيات الستيرويدية، لوحظ انخفاض كبير في التردد وزيادة في التبدد. وعقب تفاعلات ارتباط بكتيريا MRSA بالعاثيات الكروية، عُرِّضت مستشعرات الاختبار لمعلقات لاتكس سريعة مقترنة بالأجسام المضادة BBP two A.

استجابت مستشعرات المقايسة الحيوية لـ MRSA هذه لمعلقات حبيبات اللاتكس السريعة المقترنة بالأجسام المضادة BPP two A، حيث لوحظ انخفاض إضافي في التردد وزيادة في التبدد. وتم تأكيد ارتباط MSA بمجسات العاثيات وحبيبات اللاتكس السريعة المقترنة بالأجسام المضادة PPP two A باستخدام فحوصات المجهر الإلكتروني الماسح. وعندما تعرض مستشعر العاثيات الحيوي لـ MSSA، لوحظ انخفاض كبير في التردد وزيادة في التبدد نتيجة تفاعلات الارتباط بين العاثيات و MSSA، ثم تم اختبار مستشعرات المقايسة باستخدام معلقات حبيبات اللاتكس السريعة المقترنة بالأجسام المضادة PPP two A.

في البداية، أظهر المستشعر الحيوي الخاص بمقايسة MSSA فترات انتقالية قصيرة من الزيادات في التردد والانخفاضات في التبدد بعد بضع دقائق من التفاعلات بين MSSA وكرات اللاتكس المتقارنة بالأجسام المضادة PPP two A. ومع ذلك، عاد التردد إلى مستويات ما بعد إدخال الجسم المضاد PVP two A، ولكن الطاقة التبددية زادت. ثم تم تحليل ارتباط MSSA بمجسات العاثيات بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح، ولكن لم يُلاحظ أي ارتباط بين MSSA وكرات اللاتكس المتقارنة بالأجسام المضادة PPP two A؛ وهنا يتم عرض ملف تعريف سمك متماثل إهليلجي وخريطة سمك ثلاثية الأبعاد للعاثيات الحالة.

تم رسم خط عبر خريطة السمك لإنشاء ملف تعريف السمك. وتظهر الصور الأخيرة صور كاميرا بصرية CCD ممثلة لـ MRSA تم التقاطها بواسطة عاثيات مرتبطة بالسطح الذهبي لمستشعر A-Q-C-M-D، وملفات تعريف الكثافة ثلاثية الأبعاد لـ MRSA على ركائز زجاجية مثبت عليها عاثيات بتركيز 10 to the eight CFU per milliliter و 10 to the nine CFU per milliliter. تمثل كل دائرة مستديرة بكتيريا واحدة.

من الواضح أن زيادة تركيز البكتيريا في المعلق السائل من 10⁸ CFU لكل milliliter إلى 10⁹ CFU لكل milliliter تؤدي إلى ارتفاع ملحوظ في كمية البكتيريا المكتشفة في ملفات الكثافة ثلاثية الأبعاد (3D intensity profiles). ويتناسب عدد القمم البيضاء في الطبقة العلوية طردياً مع عدد البكتيريا المكتشفة، وكما كان متوقعاً، تزداد كثافة القمم بشكل كبير عند زيادة التعرض البكتيري من 10⁸ إلى 10⁹ CFUs لكل milliliter. أما الطبقة الزرقاء الداكنة في الأسفل فهي تمثل طبقة العاثيات (phage layer) الملامسة لركيزة ذهبية.

كلما تم التقاط المزيد من البكتيريا، تتغير الخصائص الضوئية للعاثيات نتيجة ارتباطها بالبكتيريا، مما يؤدي إلى ظهور لون أزرق داكن وأكثر كثافة. وباتباع هذا الإجراء، يمكننا تحديد كفاءة التقاط البكتيريا من أجل فهم تفاعلات العاثيات مع البكتيريا بعد التطوير. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج بالعاثيات لاستكشاف تثبيط الممرضات في الحيوانات والبشر. ولا تنسَ أن العمل مع المذيبات العضوية في البكتيريا الممرضة قد يكون خطيرًا للغاية، لذا فإن اتباع اللوائح الصارمة أمر بالغ الأهمية.