استخدام مقياس كرات الدم (Hemacytometer) لعد الخلايا
تتطلب العديد من التجارب الطبية الحيوية التعامل مع كمية معروفة من الخلايا، وذلك من أجل الحصول على بيانات دقيقة وقابلة للتكرار وذات دلالة إحصائية. لذا،…
يُعد عد الخلايا خطوة مهمة في العديد من المقايسات القائمة على الخلايا لتحديد عدد الخلايا وحيويتها. وبشكل عام، يهدف العد إلى معرفة مدى التخفيف المطلوب لعينة ذات تركيز خلوي غير معروف لاستخدامها لاحقاً. وتعتبر غرفة عد كريات الدم (hemacytometer) هي الأداة المختبرية الأكثر شيوعاً لعد الخلايا.
يعد مقياس كرات الدم (hemacytometer) أداة عد تم ابتكارها في الأصل لعد خلايا الدم. ويوجد في مركز مقياس كرات الدم حجرتان للعد، توجد عليهما شبكة محفورة بالليزر.
تتكون الشبكة من 9 مربعات رئيسية. وتنقسم المربعات الأربعة الموجودة في الزوايا إلى 16 مربعاً أصغر. أما المربع المركزي فينقسم إلى 25 من هذه المربعات الصغيرة، والتي ينقسم كل منها بدوره إلى 16 مربعاً دقيقاً.
توجد في الطرف البعيد من كل حجرة منافذ لإدخال العينات، حيث يتم وضع عينة الخلايا المراد عدها.
وعلى جانبي حجرات العد توجد دعامات تثبيت الشريحة الغطائية، والتي تستقر عليها الشريحة الغطائية المصنوعة من الكوارتز، وعادة ما تكون على ارتفاع 0.1 mm تقريباً فوق حجرة العد.
بما أن مساحة كل مربع كبير هي 1 mm2، فإن الحجم الذي يحتويه كل مربع كبير هو 0.1 mm3 أو 1/10,000 من الـ ml.
قبل البدء بالعد، خصص دائماً لحظة لاستخدام الإيثانول ومناديل kimwipe لتنظيف وتجفيف أي وبر أو بصمات أصابع أو آثار مائية من غطاء الشريحة وغرفة العد.
ثم أضف بعناية كمية صغيرة من الماء إلى كل من دعامات تثبيت غطاء الشريحة، حيث سيعمل التوتر السطحي للماء على تثبيت غطاء الشريحة في مكانه.
الآن قم بمجانسة معلق الخلايا برفق، أو سحبه ودفعه بواسطة الماصة، لتفكيك أي تكتلات خلوية. استخدم ماصة دقيقة لسحب حوالي 10 μl من المعلق، ثم قم بتعبئة إحدى فتحات الإدخال بالعينة. سيتم سحب المحلول إلى غرفة العد عن طريق الخاصية الشعرية ويجب أن يغطي الشبكة بأكملها.
بينما تترسب الخلايا، اختر العدسة الشيئية. ثم ضع مقياس كرات الدم (hemacytometer) على المنصة.
بعد ذلك، افحص الخلايا تحت المجهر. إذا كان هناك أقل من 5 خلايا في كل ربع من الأرباع الكبيرة، فقد تحتاج إلى إجراء طرد مركزي لعينتك مرة أخرى وإعادة تعليق الراسب في حجم أصغر. أما إذا كانت الخلايا متداخلة أو كثيفة جداً لدرجة يصعب معها تمييزها عن بعضها البعض، فقد تحتاج إلى تخفيف عينتك في حجم أكبر من المحلول. تأكد من تدوين معامل التخفيف الذي استخدمته للخلايا، حيث ستحتاج إليه في حساب لاحق.
الآن حان وقت عد الخلايا!
كما تحدثنا سابقاً، تكون غرفة العد مغطاة بشبكة محفورة بالليزر. تسهل خطوط المربعات تتبع الخلايا التي تقوم بعدّها. اختر حجم المربع المخصص للعد بناءً على كثافة الخلايا في عينتك. على سبيل المثال، إذا كان عدد الخلايا منخفضاً، قم بعدّ جميع الخلايا في أحد المربعات الركنية. أما بالنسبة للعينات ذات العدد المتوسط من الخلايا، فاختر واحداً من المربعات الـ 16 الأصغر. وإذا كانت كثافة الخلايا عالية جداً، فقم بعدّ الخلايا في واحد من المربعات الـ 25 المركزية. وبغض النظر عن المربع الذي تختاره أو كثافة عينة الخلايا، قم بعدّ ما لا يقل عن 20-50 خلية لكل مربع.
لن تقع جميع الخلايا بدقة داخل المربعات؛ لذا يمكنك عدّ الخلايا التي تلامس الخطين العلوي والأيسر، مع تجاهل الخلايا التي تلامس الخطين السفلي أو الأيمن. وللحصول على أدق عدد، استخدم عداد خلايا لتتبع الخلايا واحسب متوسط عدد الخلايا في 4 مربعات من نفس الحجم.
لحساب عدد الخلايا في حجم 1 ml، اضرب عدد الخلايا التي تم عدّها في 10,000، لأنه، كما ذكرنا سابقاً، كل مربع كبير في الشبكة يمثل 1/10,000 من الـ ml. إذا قمت بعدّ أحد هذه المربعات الكبيرة، فاضرب هذا العدد ببساطة في 1. وإذا قمت بعدّ أحد المربعات الأصغر في أحد المربعات الركنية، فاضرب هذا العدد في 16. أما إذا قمت بعدّ جميع الخلايا في واحد من المربعات الـ 25 المركزية، فاضرب هذا العدد في 25. وإذا كنت قد قمت بتخفيف معلق الخلايا قبل تحميله في مقياس كرات الدم (hemacytometer)، فستحتاج أيضاً إلى الضرب في عامل التخفيف.
بعد ذلك، لحساب عدد الخلايا في 1 ml من هذه العينة، سنقوم بضرب الـ 20 خلية الموجودة في هذا المربع المركزي في 104 و 25 لنحصل على إجمالي 5 x 106 خلية في 1 ml من العينة.
الآن وبعد أن عرفنا العدد الإجمالي للخلايا في 1 ml من العينة، نحتاج إلى ضرب هذا العدد في الحجم الإجمالي لمحلولنا. على سبيل المثال، إذا كان لدينا 5 x 106 خلية في 1 ml، فسيكون لدينا في 2 ml إجمالي 1 x 107 خلية.
ثم، ولتجنب الأخطاء الناتجة عن الخطأ في العد، أو التوزيع غير المتساوي للخلايا، أو أخطاء الماصة، قم بتحميل الجانب الآخر من الغرفة وعدّ عينة الخلايا مرة ثانية.
يُعد عد الخلايا تحت المجهر فرصة ممتازة أيضاً لتقييم حيوية الخلايا في عينتك. وغالباً ما يتم خلط صبغة Trypan blue، وهي صبغة حيوية، مع العينة قبل تحميلها في مقياس كريات الدم (hemacytometer) لهذا الغرض.
تستبعد الخلايا الحية هذه الصبغة، لأن الخلايا الحية تكون انتقائية للغاية بشأن المواد التي تسمح بمرورها عبر أغشيتها. أما الخلية الميتة، فلا تملك غشاءً سليماً، مما يسمح لصبغة Trypan blue بالمرور وصبغ السيتوبلازم.
للتحقق من حيوية عينة الخلايا، قم بتخفيف جزء من معلق الخلايا في صبغة Trypan blue، ثم قم بتحميل العينة المصبوغة بـ Trypan blue تماماً مثل عينة الخلايا العادية. تحت مجهر تباين الطور (phase contrast)، ستظهر الخلايا الحية ساطعة وذهبية ويجب عدها؛ ولا تقم بعدد أي من الخلايا الميتة الزرقاء الباهتة.
احسب عدد الخلايا كما سبق، مع ضرب العدد النهائي هذه المرة في عامل تخفيف Trypan blue. فإذا كانت عينتنا التمثيلية الأصلية قد خُففت أولاً في Trypan blue، فإننا سنقوم حينئذٍ بضرب إجمالي عدد الخلايا في تخفيف Trypan blue بنسبة 1:10، ليصبح المجموع 1x108 خلايا في عينتنا.
عند الانتهاء من العد، تذكر تنظيف غطاء الشريحة وغرفة العد!
بما أنك أصبحت محترفاً في عد الخلايا، فلنتحدث عن بعض الأسباب التي قد تجعلك بحاجة لمعرفة عدد الخلايا لديك في تجربة معينة.
بعد عزل الخلايا من نسيج طبيعي أو تجريبي، من المهم معرفة عدد الخلايا التي تم استعادتها. هنا سيرغب الباحثون في معرفة عدد الخلايا الطحالية، أو خلايا الطحال، التي قاموا بعزلها من طحال هذا الفأر.
عند إجراء تجربة لمعرفة كيفية تفاعل مجتمعين خلويين مختلفين، من المهم معرفة عدد كل نوع من الخلايا التي يتم خلطها معاً، كما هو الحال في تجربة الزراعة المشتركة هذه باستخدام خلايا B وT.
ستحتاج إلى معرفة عدد الخلايا لديك للعديد من أنواع المقايسات القائمة على الخلايا. هنا يتم إعداد مقايسة ELISPOT لتحديد عدد الخلايا في العينة التي ستفرز IFNγ، وهو بروتين التهابي، استجابةً لفيروس الورم الحليمي البشري.
عند إجراء تجربة تتطلب استخلاص أو عزل mRNA من الخلايا المستهدفة، من المهم معرفة عدد الخلايا التي تبدأ بها، وذلك للحصول على كمية كافية من mRNA للتجربة.
يعد مقياس كرات الدم (hemacytometer) أداة غير مكلفة وسهلة الاستخدام نسبياً لعد الخلايا، ولكنها قد تكون مرهقة وعرضة للخطأ البشري.
جهاز Scepter Handheld Automatic Counter هو، كما يشير اسمه، جهاز عد محمول باليد يتميز بدقة عد محسنة مقارنة بمقياس كرات الدم، ويمكنه التمييز بين كل من حجم وحجم الخلايا في عينة خلوية.
يقوم عداد الخلايا الآلي TC10 بتقييم كل من عدد الخلايا وحيويتها، ويحسب تلقائياً العدد الإجمالي للخلايا في عينتك، كما يتيح رؤية الخلايا على شاشة القراءة الخاصة به أيضاً.
لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول عد الخلايا. استعرضنا في هذا الفيديو: ماهية مقياس كرات الدم (hemacytometer)، وكيفية عد الخلايا وتحديد حيويتها، وبعض الأسباب المختلفة التي قد تدفعكم للحاجة إلى عد الخلايا. شكراً للمشاهدة، وتذكروا ألا تقوموا بعدّ الخلايا الزرقاء!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
يُعد عد الخلايا خطوة مهمة في العديد من المقايسات القائمة على الخلايا لتحديد عدد الخلايا وحيويتها. وبشكل عام، يهدف العد إلى معرفة مدى التخفيف المطلوب لعينة ذات تركيز خلوي غير معروف لاستخدامها لاحقاً. وتعتبر غرفة عد كريات الدم (hemacytometer) هي الأداة المختبرية الأكثر شيوعاً لعد الخلايا.
يعد مقياس كرات الدم (hemacytometer) أداة عد تم ابتكارها في الأصل لعد خلايا الدم. ويوجد في مركز مقياس كرات الدم حجرتان للعد، توجد عليهما شبكة محفورة بالليزر.
تتكون الشبكة من 9 مربعات رئيسية. وتنقسم المربعات الأربعة الموجودة في الزوايا إلى 16 مربعاً أصغر. أما المربع المركزي فينقسم إلى 25 من هذه المربعات الصغيرة، والتي ينقسم كل منها بدوره إلى 16 مربعاً دقيقاً.
توجد في الطرف البعيد من كل حجرة منافذ لإدخال العينات، حيث يتم وضع عينة الخلايا المراد عدها.
وعلى جانبي حجرات العد توجد دعامات تثبيت الشريحة الغطائية، والتي تستقر عليها الشريحة الغطائية المصنوعة من الكوارتز، وعادة ما تكون على ارتفاع 0.1 mm تقريباً فوق حجرة العد.
بما أن مساحة كل مربع كبير هي 1 mm2، فإن الحجم الذي يحتويه كل مربع كبير هو 0.1 mm3 أو 1/10,000 من الـ ml.
قبل البدء بالعد، خصص دائماً لحظة لاستخدام الإيثانول ومناديل kimwipe لتنظيف وتجفيف أي وبر أو بصمات أصابع أو آثار مائية من غطاء الشريحة وغرفة العد.
ثم أضف بعناية كمية صغيرة من الماء إلى كل من دعامات تثبيت غطاء الشريحة، حيث سيعمل التوتر السطحي للماء على تثبيت غطاء الشريحة في مكانه.
الآن قم بمجانسة معلق الخلايا برفق، أو سحبه ودفعه بواسطة الماصة، لتفكيك أي تكتلات خلوية. استخدم ماصة دقيقة لسحب حوالي 10 μl من المعلق، ثم قم بتعبئة إحدى فتحات الإدخال بالعينة. سيتم سحب المحلول إلى غرفة العد عن طريق الخاصية الشعرية ويجب أن يغطي الشبكة بأكملها.
بينما تترسب الخلايا، اختر العدسة الشيئية. ثم ضع مقياس كرات الدم (hemacytometer) على المنصة.
بعد ذلك، افحص الخلايا تحت المجهر. إذا كان هناك أقل من 5 خلايا في كل ربع من الأرباع الكبيرة، فقد تحتاج إلى إجراء طرد مركزي لعينتك مرة أخرى وإعادة تعليق الراسب في حجم أصغر. أما إذا كانت الخلايا متداخلة أو كثيفة جداً لدرجة يصعب معها تمييزها عن بعضها البعض، فقد تحتاج إلى تخفيف عينتك في حجم أكبر من المحلول. تأكد من تدوين معامل التخفيف الذي استخدمته للخلايا، حيث ستحتاج إليه في حساب لاحق.
الآن حان وقت عد الخلايا!
كما تحدثنا سابقاً، تكون غرفة العد مغطاة بشبكة محفورة بالليزر. تسهل خطوط المربعات تتبع الخلايا التي تقوم بعدّها. اختر حجم المربع المخصص للعد بناءً على كثافة الخلايا في عينتك. على سبيل المثال، إذا كان عدد الخلايا منخفضاً، قم بعدّ جميع الخلايا في أحد المربعات الركنية. أما بالنسبة للعينات ذات العدد المتوسط من الخلايا، فاختر واحداً من المربعات الـ 16 الأصغر. وإذا كانت كثافة الخلايا عالية جداً، فقم بعدّ الخلايا في واحد من المربعات الـ 25 المركزية. وبغض النظر عن المربع الذي تختاره أو كثافة عينة الخلايا، قم بعدّ ما لا يقل عن 20-50 خلية لكل مربع.
لن تقع جميع الخلايا بدقة داخل المربعات؛ لذا يمكنك عدّ الخلايا التي تلامس الخطين العلوي والأيسر، مع تجاهل الخلايا التي تلامس الخطين السفلي أو الأيمن. وللحصول على أدق عدد، استخدم عداد خلايا لتتبع الخلايا واحسب متوسط عدد الخلايا في 4 مربعات من نفس الحجم.
لحساب عدد الخلايا في حجم 1 ml، اضرب عدد الخلايا التي تم عدّها في 10,000، لأنه، كما ذكرنا سابقاً، كل مربع كبير في الشبكة يمثل 1/10,000 من الـ ml. إذا قمت بعدّ أحد هذه المربعات الكبيرة، فاضرب هذا العدد ببساطة في 1. وإذا قمت بعدّ أحد المربعات الأصغر في أحد المربعات الركنية، فاضرب هذا العدد في 16. أما إذا قمت بعدّ جميع الخلايا في واحد من المربعات الـ 25 المركزية، فاضرب هذا العدد في 25. وإذا كنت قد قمت بتخفيف معلق الخلايا قبل تحميله في مقياس كرات الدم (hemacytometer)، فستحتاج أيضاً إلى الضرب في عامل التخفيف.
بعد ذلك، لحساب عدد الخلايا في 1 ml من هذه العينة، سنقوم بضرب الـ 20 خلية الموجودة في هذا المربع المركزي في 104 و 25 لنحصل على إجمالي 5 x 106 خلية في 1 ml من العينة.
الآن وبعد أن عرفنا العدد الإجمالي للخلايا في 1 ml من العينة، نحتاج إلى ضرب هذا العدد في الحجم الإجمالي لمحلولنا. على سبيل المثال، إذا كان لدينا 5 x 106 خلية في 1 ml، فسيكون لدينا في 2 ml إجمالي 1 x 107 خلية.
ثم، ولتجنب الأخطاء الناتجة عن الخطأ في العد، أو التوزيع غير المتساوي للخلايا، أو أخطاء الماصة، قم بتحميل الجانب الآخر من الغرفة وعدّ عينة الخلايا مرة ثانية.
يُعد عد الخلايا تحت المجهر فرصة ممتازة أيضاً لتقييم حيوية الخلايا في عينتك. وغالباً ما يتم خلط صبغة Trypan blue، وهي صبغة حيوية، مع العينة قبل تحميلها في مقياس كريات الدم (hemacytometer) لهذا الغرض.
تستبعد الخلايا الحية هذه الصبغة، لأن الخلايا الحية تكون انتقائية للغاية بشأن المواد التي تسمح بمرورها عبر أغشيتها. أما الخلية الميتة، فلا تملك غشاءً سليماً، مما يسمح لصبغة Trypan blue بالمرور وصبغ السيتوبلازم.
للتحقق من حيوية عينة الخلايا، قم بتخفيف جزء من معلق الخلايا في صبغة Trypan blue، ثم قم بتحميل العينة المصبوغة بـ Trypan blue تماماً مثل عينة الخلايا العادية. تحت مجهر تباين الطور (phase contrast)، ستظهر الخلايا الحية ساطعة وذهبية ويجب عدها؛ ولا تقم بعدد أي من الخلايا الميتة الزرقاء الباهتة.
احسب عدد الخلايا كما سبق، مع ضرب العدد النهائي هذه المرة في عامل تخفيف Trypan blue. فإذا كانت عينتنا التمثيلية الأصلية قد خُففت أولاً في Trypan blue، فإننا سنقوم حينئذٍ بضرب إجمالي عدد الخلايا في تخفيف Trypan blue بنسبة 1:10، ليصبح المجموع 1x108 خلايا في عينتنا.
عند الانتهاء من العد، تذكر تنظيف غطاء الشريحة وغرفة العد!
بما أنك أصبحت محترفاً في عد الخلايا، فلنتحدث عن بعض الأسباب التي قد تجعلك بحاجة لمعرفة عدد الخلايا لديك في تجربة معينة.
بعد عزل الخلايا من نسيج طبيعي أو تجريبي، من المهم معرفة عدد الخلايا التي تم استعادتها. هنا سيرغب الباحثون في معرفة عدد الخلايا الطحالية، أو خلايا الطحال، التي قاموا بعزلها من طحال هذا الفأر.
عند إجراء تجربة لمعرفة كيفية تفاعل مجتمعين خلويين مختلفين، من المهم معرفة عدد كل نوع من الخلايا التي يتم خلطها معاً، كما هو الحال في تجربة الزراعة المشتركة هذه باستخدام خلايا B وT.
ستحتاج إلى معرفة عدد الخلايا لديك للعديد من أنواع المقايسات القائمة على الخلايا. هنا يتم إعداد مقايسة ELISPOT لتحديد عدد الخلايا في العينة التي ستفرز IFNγ، وهو بروتين التهابي، استجابةً لفيروس الورم الحليمي البشري.
عند إجراء تجربة تتطلب استخلاص أو عزل mRNA من الخلايا المستهدفة، من المهم معرفة عدد الخلايا التي تبدأ بها، وذلك للحصول على كمية كافية من mRNA للتجربة.
يعد مقياس كرات الدم (hemacytometer) أداة غير مكلفة وسهلة الاستخدام نسبياً لعد الخلايا، ولكنها قد تكون مرهقة وعرضة للخطأ البشري.
جهاز Scepter Handheld Automatic Counter هو، كما يشير اسمه، جهاز عد محمول باليد يتميز بدقة عد محسنة مقارنة بمقياس كرات الدم، ويمكنه التمييز بين كل من حجم وحجم الخلايا في عينة خلوية.
يقوم عداد الخلايا الآلي TC10 بتقييم كل من عدد الخلايا وحيويتها، ويحسب تلقائياً العدد الإجمالي للخلايا في عينتك، كما يتيح رؤية الخلايا على شاشة القراءة الخاصة به أيضاً.
لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول عد الخلايا. استعرضنا في هذا الفيديو: ماهية مقياس كرات الدم (hemacytometer)، وكيفية عد الخلايا وتحديد حيويتها، وبعض الأسباب المختلفة التي قد تدفعكم للحاجة إلى عد الخلايا. شكراً للمشاهدة، وتذكروا ألا تقوموا بعدّ الخلايا الزرقاء!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a hemacytometer and why is it used for cell counting?
A hemacytometer is a counting chamber with a laser-etched grid originally designed for counting blood cells. It contains two counting chambers with grids divided into quadrants of varying sizes. The tool allows researchers to count cells under a light microscope and calculate total cell concentration, making it essential for determining cell numbers in biomedical experiments requiring known cell quantities.
Q2: How is the hemacytometer grid structured for cell counting?
The hemacytometer grid consists of 9 major quadrants. The four corner quadrants are subdivided into 16 smaller quadrants each, while the central quadrant contains 25 smaller quadrants, each further divided into 16 micro-quadrants. Each large square has an area of 1 mm² and contains a volume of 0.1 mm³, or 1/10,000th of a milliliter, which is critical for calculating total cell concentration.
Q3: What preparation steps are necessary before loading cells into a hemacytometer?
Clean the coverslip and counting chamber with ethanol and a kimwipe to remove lint, fingerprints, and watermarks. Apply water to the coverslip mounting supports to hold the coverslip in place using surface tension. Gently triturate the cell suspension by pipetting up and down to dislodge cell clumps, then aspirate approximately 10 microliters and load it into an introduction port where capillary action draws the solution across the grid.
Q4: How do you choose which quadrant to count based on cell density?
Select quadrant size according to cell density: for low cell numbers, count all cells in one corner quadrant; for medium density, use one of the 16 smaller quadrants; for high density, count cells in one of the 25 central quadrants. Always count at least 20-50 cells per quadrant to ensure accuracy. Count cells touching the top and left lines but disregard those touching bottom or right lines.
Q5: How do you calculate the total number of cells in your sample?
Multiply the cell count by 10,000 (since each large square equals 1/10,000th of a milliliter). Apply a multiplication factor based on quadrant size: multiply by 1 for large quadrants, by 16 for corner quadrants, or by 25 for central quadrants. If you diluted the sample, multiply by the dilution factor. Finally, multiply by total sample volume to determine total cell number in your experimental sample.
Q6: What is trypan blue exclusion and how does it determine cell viability?
Trypan blue is a vital stain that distinguishes live from dead cells. Live cells have intact membranes and exclude the dye, appearing bright and golden under phase contrast microscopy. Dead cells lack membrane integrity, allowing trypan blue to enter and stain the cytoplasm blue. Count only live cells and multiply the final count by the trypan blue dilution factor to determine viable cell concentration in your sample.
Q7: Why is accurate cell counting important in biomedical experiments?
Accurate cell counting ensures reproducible, statistically-relevant data in cell-based assays. Researchers need precise cell numbers when isolating cells from tissue, mixing different cell populations in co-culture experiments, performing immunoassays like ELISPOT, or extracting mRNA from cells. Knowing exact cell quantities allows proper dilution and standardization of experimental conditions across replicates and supports passaging cells cell lines subculturing methods and applications.