الطرق الأساسية في علم الأحياء الخلوي والجزيئي

تتطلب العديد من التجارب الطبية الحيوية التعامل مع كمية معروفة من الخلايا، وذلك من أجل الحصول على بيانات دقيقة وقابلة للتكرار وذات دلالة إحصائية. لذا، فإن تعلم كيفية عد الخلايا يعد تقنية أساسية بشكل خاص لأي عالم في المجال الطبي الحيوي يسعى للنجاح. والطريقة الأكثر شيوعاً لعد الخلايا هي استخدام مقياس كرات الدم (hemacytometer) - وهو جهاز يحتوي على شبكتين محفورتين بالليزر، تساعدان في تعداد جزء من الخلايا تحت مجهر ضوئي بسيط. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه البيانات لاستنتاج عدد الخلايا في العينة التجريبية.

تُستخدم الخطوط الخلوية بشكل متكرر في التجارب الطبية الحيوية، لأنها تسمح بالزراعة والتوسع السريع لأنواع الخلايا من أجل التحليل التجريبي. تُزرع الخطوط الخلوية تحت ظروف مماثلة عند مقارنتها بالخلايا المعزولة حديثاً، أو الخلايا الأولية، ولكن مع وجود بعض الاختلافات الجوهرية الهامة: (1) تتطلب الخطوط الخلوية مزيجاً خاصاً بها من عوامل النمو، و(2) يجب مراقبة نموها بشكل أدق من الخلايا الأولية، حيث أن الطفرات التي تسمح بنموها إلى أجل غير مسمى يمكن أن تؤدي أيضاً وبسرعة إلى فرط نموها. لذلك، عندما تصل الخطوط...

يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل، أو PCR، تقنية تُستخدم لتضخيم DNA من خلال التدوير الحراري – وهي دورات من تغيرات درجات الحرارة في فواصل زمنية محددة. وباستخدام إنزيم DNA polymerase مستقر حرارياً، يمكن لتقنية PCR إنشاء نسخ عديدة من DNA من لبنات بناء DNA التي تسمى dNTPs. هناك ثلاث خطوات في PCR: المسخ، والارتباط، والاستطالة. يُعد المسخ الخطوة الأولى في الدورة، وهو يؤدي إلى صهر DNA عن طريق تفكيك الروابط الهيدروجينية بين القواعد، مما ينتج عنه DNA أحادي السلسلة. أما الارتباط فيخفض درجة الحرارة بما يكفي...

يُعد الفصل الكهربائي لهلام DNA تقنية تُستخدم للكشف عن جزيئات DNA وفصلها. حيث يتم تطبيق مجال كهربائي على مصفوفة هلامية مكونة من الآغاروز، وتهاجر الجسيمات المشحونة داخل الهلام وتنفصل بناءً على الحجم. وتتسبب مجموعات الفوسفات سالبة الشحنة في هيكل DNA في تحرك قطع DNA نحو الأنود - وهو قطب كهربائي موجب الشحنة. يشرح الفيديو الآلية التي يتم من خلالها فصل قطع DNA على هلام الأجاروز، ويقدم إجراءً عاماً خطوة بخطوة حول كيفية تحضير هلام الأجاروز، وتحميل عينات DNA، وتشغيل هلام DNA، وتصوير قطع DNA، والتخلص...

يُعد الفصل الكهربائي للهلام باستخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم وبولي أكريلاميد، أو SDS-PAGE، تقنية واسعة الاستخدام لفصل مخاليط البروتينات بناءً على حجمها فقط. وتُستخدم مادة SDS، وهي منظف أنيوني، لإحداث شحنة متساوية على طول البروتينات التي تم جعلها خطية. ثم يتم فصل البروتينات المغلفة بـ SDS عن طريق تحميلها أولاً في هلام مكون من البولي أكريلاميد، ثم تسليط مجال كهربائي على الهلام. ويعمل المجال الكهربائي كقوة دافعة، حيث يسحب البروتينات المغلفة بـ SDS نحو المصعد، بينما تتحرك البروتينات الكبيرة بشكل...

التحول هو العملية التي تحدث عندما تمتص الخلية DNA غريباً من محيطها. ويمكن أن يحدث التحول في الطبيعة في أنواع معينة من البكتيريا. وفي البيولوجيا الجزيئية، يتم إعادة إنتاج التحول صناعياً في المختبر عن طريق إنشاء مسام في أغشية الخلايا البكتيرية. وتسمى الخلايا البكتيرية القادرة على امتصاص DNA من البيئة بالخلايا المختصة. وفي المختبر، يمكن جعل الخلايا البكتيرية مختصة ومن ثم إدخال DNA إليها من خلال إجراء يسمى طريقة الصدمة الحرارية. تستخدم عملية التحول بالصدمة الحرارية بيئة غنية بالكالسيوم يوفرها...

يشير مصطلح "التحول" (transformation) إلى عملية ابتلاع الخلية للحمض النووي DNA الغريب. وفي الطبيعة، يمكن أن يحدث التحول في أنواع معينة من البكتيريا. أما في البيولوجيا الجزيئية، فيتم تحفيز التحول صناعياً عن طريق إنشاء ثقوب في جدران الخلايا البكتيرية. وتسمى الخلايا البكتيرية القادرة على امتصاص DNA من البيئة المحيطة بالخلايا المختصة (competent cells). ويمكن إنتاج الخلايا المختصة كهربائياً (Electrocompetent cells) في المختبر، كما يمكن تحقيق تحول هذه الخلايا عبر تطبيق مجال كهربائي يعمل على إنشاء ثقوب...

يُجرى عادةً مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للكشف عن وجود و/أو كمية بروتين مستهدف محدد ضمن عينة تجريبية. ويتم الكشف عن البروتين المستهدف بواسطة الأجسام المضادة، مما يجعل ELISA مقايسة مناعية. ومن خلال سلسلة من خطوات الحضن والغسيل، تقوم هذه الأجسام المضادة، والتي غالباً ما تكون مرتبطة أو مقترنة بإنزيم، بالكشف عن البروتين المبطن لقاع بئر في لوحة معايرة دقيقة. وعند تعريضها لمادة ركيزة، يتسبب الإنزيم المرتبط بالجسم المضاد في تغيير اللون، مما يشير بذلك إلى وجود البروتين المستهدف في...

تعد تنقية البلازميد تقنية تُستخدم لعزل وتنقية الحمض النووي للبلازميد (plasmid DNA) من الحمض النووي الجينومي والبروتينات والريبوسومات وجدار الخلية البكتيرية. والبلازميد هو جزيء صغير ودائري ومزدوج السلسلة من الحمض النووي يُستخدم كناقل لجزيئات محددة من الحمض النووي. وعند إدخاله في كائن مضيف عبر عملية التحول، يتضاعف البلازميد، مما يؤدي إلى إنتاج نسخ عديدة من قطعة الحمض النووي قيد الدراسة. يصف هذا الفيديو إجراءً عاماً مفصلاً خطوة بخطوة حول كيفية إجراء تنقية البلازميد. تتضمن تنقية البلازميد ثلاث...

تُستخدم تنقية الهلام لاستعادة قطع DNA بعد الفصل الكهربائي. وتتضمن عملية استعادة DNA من هلام الأجاروز ثلاث خطوات أساسية: الارتباط، والغسل، والاستخلاص من عمود السيليكا. ويُعتقد أن DNA يرتبط بالسيليكا في وجود تركيز عالٍ من الأملاح عبر جسر ملحي. وبعد عملية الارتباط، يتم غسل DNA من الشوائب واستخلاصه في ظروف منخفضة الملوحة مما يؤدي إلى تفكيك هذا التفاعل. يستعرض هذا الفيديو إجراءً عاماً ومفصلاً خطوة بخطوة لقص نطاق من الهلام، وإذابة الهلام، والتنقية عن طريق الارتباط بعمود السيليكا، ثم استرداد الـ DNA...

تُستخدم تقنية لطخة ويسترن (Western Blotting) لتحديد وجود بروتينات معينة في عينات مفصولة كهربائياً. وبعد الفصل باستخدام تقنية تُعرف باسم الفصل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد وبوجود دوديسيل كبريتات الصوديوم، أو SDS-PAGE، تُستخدم عملية النقل في تقنية ويسترن لنقل البروتينات من هلام بولي أكريلاميد إلى قطعة من الغشاء التي تعمل على احتجاز البروتينات في مواقعها المحددة. بعد ذلك، يتم فحص الأغشية باستخدام أجسام مضادة في عملية تسمى اللطخة المناعية (immunoblotting). وتعتمد اللطخة المناعية على الارتباط بين...

عملية ترانسفكشن (Transfection) هي عملية إدخال المادة الوراثية، مثل DNA و RNA مزدوج السلسلة، إلى خلايا الثدييات. يتيح إدخال DNA إلى الخلية التعبير عن البروتينات، أو إنتاجها، باستخدام الآليات الخاصة بالخلية، بينما يُستخدم إدخال RNA إلى الخلية لتثبيط إنتاج بروتين معين عن طريق إيقاف عملية الترجمة. وبينما يكون موقع عمل RNA الذي تم نقله عبر الترانسفكشن هو السيتوبلازم، يجب نقل DNA إلى النواة من أجل إتمام عملية الترانسفكشن بفعالية. هناك، يمكن التعبير عن DNA بشكل عابر لفترة زمنية قصيرة، أو دمجه في DNA...

يشير الربط في البيولوجيا الجزيئية إلى عملية دمج قطعتين من الـ DNA من خلال تكوين رابطة فوسفاتية ثنائية الإستر. ويقوم إنزيم يُعرف باسم الليغاز بتحفيز تفاعل الربط هذا. وفي الخلية، تعمل إنزيمات الليغاز على إصلاح الكسور في السلسلة الواحدة أو السلسلتين التي تحدث أثناء تضاعف الـ DNA. أما في المختبر، فيُستخدم الـ DNA ligase أثناء الاستنساخ الجزيئي لربط قطع الـ DNA الخاصة بالإدراجات مع النواقل، وهي جزيئات DNA حاملة تعمل على تضاعف القطع المستهدفة في الكائنات المضيفة. يوفر هذا الفيديو مقدمة عن عملية ربط...

تتعرف إنزيمات التقييد أو الإنزيمات القاطعة (endonucleases) على تسلسل محدد من الحمض النووي DNA وتقوم بقطعه. تظهر هذه الإنزيمات بشكل طبيعي في البكتيريا كآلية دفاع ضد العاثيات (bacteriophages)، وهي فيروسات تصيب البكتيريا. وتقوم إنزيمات التقييد البكتيرية بقطع الحمض النووي DNA الخاص بالعاثيات الغازية، بينما يظل الحمض النووي الجينومي البكتيري سليمًا بفضل إضافة مجموعات الميثيل. يشرح هذا الفيديو المبادئ الأساسية لإنزيمات القطع، بما في ذلك: كيفية تسمية إنزيمات القطع وأنواع مواقع التعرف والنهايات...

الاستنساخ الجزيئي هو مجموعة من الطرق المستخدمة لإدراج الحمض النووي المؤتلف (recombinant DNA) في ناقل - وهو حامل لجزيئات الحمض النووي التي ستعمل على مضاعفة قطع الحمض النووي المؤتلف في الكائنات المضيفة. يمكن عزل قطعة الحمض النووي، والتي قد تكون جيناً، من عينة بدائية النواة أو حقيقية النواة. وبعد عزل القطعة المطلوبة، أو "المُدرج" (insert)، يجب قطع كل من الناقل والمُدرج باستخدام إنزيمات القطع ثم تنقيتهما. يتم بعد ذلك ربط القطع المنقاة معاً من خلال تقنية تسمى الربط (ligation). ويُعرف الإنزيم الذي...