التفريق بين الأطفال حديثي الولادة ماوس خلايا الجلد الجذعية المشتقة في مثل جرثومة خلايا

الهدف العام من التجربة التالية هو تكوين خلايا شبيهة بالبويضات باستخدام خلايا جذعية جسدية مشتقة من الجلد. ويتم تحقيق ذلك من خلال استخدام خلايا جذعية نقية غير متمايزة مشتقة من جلد فأر حديث الولادة. وفي خطوة ثانية، يتم تفكيك الخلايا الجذعية، مما يهيئها لعملية التمايز.

بعد ذلك، يتم استزراع الخلايا الجذعية في وسط تمايز محدد. ومن أجل تحفيز تكوين الخلايا الجرثومية، يتم الحصول على نتائج تظهر تعبير المؤشرات الخاصة بالبويضة بناءً على تقنية PCR الكمي في الوقت الحقيقي شبه الكمي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا التناسلية.

من خلال توفير نظام مغلق لدراسة تشكل وتطور الخلايا الجرثومية، يجب تحضير جميع الأوساط المطلوبة للبروتوكول قبل ساعتين إلى ثلاث ساعات من الاستخدام، وتوضع بغطاء مرتخٍ في حاضنة المزارع الخلوية حيث ستجرى التجربة. الوسطان المستخدمان هنا هما وسط الخلايا الجذعية المكون من D-M-A-M-F 12، والمُدعم بـ B 27 و BFGF و EGF، ووسط تمايز الخلايا الجرثومية المكون من M1 99 والمُدعم بـ FSH و LH و B-S-A-I-T-S وبيروفات الصوديوم و tuin و EGF، وذلك للخلايا الجذعية المعزولة من فأر حديث الولادة.

تُستخدم الجراء لتمايز الخلايا الجرثومية في المختبر عند الممر الثاني إلى الرابع. وبما أن كفاءة تكوين الخلايا الشبيهة بالخلايا التناسلية أو OLC ترتبط مباشرة بجودة الخلايا الجذعية الأولية، فمن الأفضل بدء التمايز بمجرد أن تظهر المجموعة نظيفة وسليمة، وهو ما يكون عادةً حول الممر 2. قبل 48 ساعة من بدء التمايز، قم بإجراء استزراع فرعي للخلايا الجذعية باستخدام ماصة سيرولوجية، وأزل جميع التجمعات الخلوية الكروية المعلقة والوسط المستهلك من طبق الزرع وضعها في أنبوب سعة 15 ملليلتر. ومن المهم جمع التجمعات الكروية المعلقة من الخلايا فقط، وعدم جمع الخلايا الملتصقة بقاع الطبق والتي تتمايز تلقائياً.

قم بترسيب الخلايا عند 500 ×g لمدة خمس دقائق، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 500 µL من وسط زراعة الخلايا الجذعية الطازج. قم بالتسخين إلى 37 °C. استخدم الماصة بلطف لتحريك التجمعات من أجل تفكيك الخلايا جزئيًا.

تجنب سحب الخلايا بواسطة الماصة بقوة لأن ذلك سيقلل من حيوية الخلايا. اغسل الخلايا المفككة جزئيًا في 9.5 milliliters من وسط زراعة الخلايا الجذعية الطازج والمدفأ مسبقًا في طبق زراعة خلايا بقطر 10 centimeter ومنخفض الالتصاق. أعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا عند 37 degrees Celsius و5%CO2 لمدة 48 hours.

لبدء إجراء تمايز OLC، استخدم ماصة سيرولوجية لنقل الخلايا الجذعية من طبق الزرع ووضعها في أنبوب سعة 15 milliliter. اترك أي خلايا ملتصقة في الطبق. قم بترسيب الخلايا عند 500 ×g لمدة خمس دقائق، ثم تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 500 µL من PBS المعقم، ثم قم بسحب الخلايا بقوة باستخدام طرف ماصة واسع الفتحة سعة 1000 µL لتشكيل تكتلات لا يزيد حجمها عن 10 إلى 20 خلية.

لضمان نجاح هذا البروتوكول، من الضروري التحقق بانتظام من مستوى التفكك للتأكد من الوصول إلى المستوى الصحيح أثناء عملية التفكك. قم بسحب كمية صغيرة من الخلايا بشكل دوري وفحصها باستخدام مجهر الضوء الأبيض للتأكد من أن الخلايا المتجمعة موجودة في تكتلات تتراوح ما بين 10 إلى 20 خلية فردية. تجنب تفكيك الخلايا بشكل مفرط لأن ذلك سيؤدي إلى انخفاض حيوية الخلايا.

بعد ذلك، أضف 9.5 milliliters من PBS إلى الخلايا المفككة وانقل 15 microliters من معلق الخلايا هذا إلى مقياس كرات الدم (hemocytometer) لإجراء عد الخلايا. قم بترسيب الخلايا بجهاز الطرد المركزي عند 500 ×g لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من الرائق، أعد تعليق الخلايا في وسط التمايز بتركيز 1.32 × 10⁶ خلية لكل milliliter.

قم بتوزيع الخلايا عن طريق إضافة 500 µL لكل بئر في طبق تعليق مسطح القاع يحتوي على 24 بئراً. ضع طبق الـ 24 بئراً في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 °C في 5% CO2 لمدة 48 ساعة. بعد مرور 48 ساعة، اسحب 250 µL من الوسط من كل بئر وضعها في أنبوب سعة 1.5 mL مُسمى ومناسب.

أضف 250 µL من وسط التمايز الطازج إلى كل بئر، ثم قم بطرد الوسط المستهلك مركزياً عند 500 ×g لمدة خمس دقائق، وتخلص من السائل الطافي وأعد تعليق أي خلايا مترسبة في 50 µL من وسط التمايز الطازج. أعد تعليق الخلايا إلى بئر المزرعة المقابل في طبق التمايز، وقم بتغيير نصف الوسط بنفس الطريقة كل 48 ساعة حتى اليوم 12 من التمايز.

خلال مرحلة التمايز المبكرة، ستلتصق الخلايا بقعر طبق الزرع وتنتشر. تُظهر هذه الصورة التمثيلية خلايا في الفترة من 42 إلى 72 ساعة من التمايز، حيث تكون الخلايا موجبة لـ OCT four، وهو مؤشر للخلايا الجذعية غير المتمايزة ويظهر باللون الأخضر، بينما تم صبغ النوى بـ hirst وتظهر باللون الأزرق.

مع تقدم عملية التمايز، ستظهر بعض التجمعات الخلوية وبها خلايا موجبة لـ OCT four مميزة باللون الأخضر، ومحاطة بخلايا سالبة لـ OCT four. يمثل شريط المقياس في هذه الصورة 100 microns. يوضح هذا الشكل صورة بالضوء الأبيض لبنية تشبه الجريب بعد فصلها عن سطح المزرعة، ويمثل شريط المقياس 40 microns.

مع الاستمرار في الزرع، ستنمو خلايا LCS ليصل قطرها إلى حوالي 45 ميكرون. يمثل شريط المقياس في هذه الصورة 10 ميكرون. يمكن رؤية خلايا lcs موجبة لـ OCT الأربعة الكبيرة إما محاطة بخلايا أخرى أو بشكل منفرد ضمن المزرعة.

يمكن جمع هذه الخلايا الشبيهة بالخلايا العنقودية (lcs) مع الخلايا الداعمة أو باستخدام التربسين للحصول على خلايا شبيهة بالخلايا العنقودية (LCS) دون وجود خلايا أخرى ملتصقة بها. ومن أجل التأكد من أن الخلايا الشبيهة بالخلايا العنقودية (LCS) تعبر عن نسخ مماثلة لتلك الموجودة في مواقع الخلايا البيضاوية (ol sites) الطبيعية، تم جمع هذه الخلايا واختبار تعبيرها عن علامات مواقع الخلايا البيضاوية (OO site) الشائعة مثل Z-P-C-S-C-P three CMOs، و T four BMP 15، و vasa. يوضح هذا الشكل مستويات نسخ هذه العلامات في 10 خلايا شبيهة بالخلايا العنقودية (lcs) بالنسبة لـ 10 خلايا من فأر حديث الولادة.

تظهر النتائج أن الخلايا LCS تعبر عن مستوى أقل من ZPC مقارنة بالخلايا cytes. وبما أن ZPC يمثل مكوناً في بنية غشاء zop lucidum الخاص بخلايا CYTE، فقد يفسر ذلك الطبيعة الهشة وغشاء zita الأكثر رقة في خلايا lcs. كما أن تعبير بروتين meiosis SCP three يكون أعلى في خلايا LCS مقارنة بخلايا cytes الطبيعية.

ومع ذلك، يتم التعبير عن علامة انقسام منصف مختلف CMOs بمستوى أدنى. وقد يفسر هذا التباين في مستويات التعبير جزئياً الفشل الحالي لـ LCS في إكمال الانقسام المنصف. ولا تختلف العلامات الأخرى مثل BMP 15 و vasa بشكل ملحوظ بين مواقع lcs ومواقع O.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن صحة مجتمع الخلايا الجذعية البادئة أمر بالغ الأهمية لنجاح العملية.