قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس معامل المرونة للخلايا الحية باستخدام مجهر القوة الذرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إجراء قياسات التحليل الطيفي لقوة FM أولا في مواقع مختلفة في الخلية. كخطوة ثانية ، يتم تحليل كل منحنى مسافة قسري لتحديد النقطة التي يتلامس فيها طرف FM في البداية مع الخلية.

بعد ذلك ، بدءا من نقطة التلامس ، يتم تركيب أول 200 إلى 300 نانومتر من بيانات المسافة البادئة في نموذج الهرتز. من أجل استخراج معامل المرونة ، تنتج النتائج خريطة ثنائية الأبعاد لصلابة الخلية التي تم الحصول عليها باستخدام وضع تعيين القوة حيث يمثل كل بكسل منحنى مسافة قسري واحد يوضح الإجراء Guen Thomas ، طالب دراسات عليا من مختبري. لبدء هذا الإجراء ، نظف حامل الكابولي بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركه حتى يجف.

ثم قم بتحميل ناتئ bru DNP 10 في A FM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بمعايرة حساسية الرافعة البصرية العكسية. تصف هذه المعلمة مقدار استجابة الصمام الثنائي الضوئي بالفولت لكل نانومتر من انحراف الكابولي.

لإنجاز ذلك ، قم أولا بتحميل شريحة زجاجية نظيفة على مرحلة العينة. قم بتثبيت رأس FM واضبط شعاع الليزر والمحاذاة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بمجرد المحاذاة ، قم بتعطيم طرف A FM على الشريحة الزجاجية مع سحب P ثمانية O.

أعد محاذاة المرآة إلى قراءة الصمام الثنائي للصور سالب فولت. ثم قم بإجراء قياس طياف القوة مع أقصى استجابة للصمام الثنائي الضوئي أو نقطة الزناد موجبة فولت. بعد اكتمال الحصول على البيانات ، قم بتكبير منطقة التلامس الثابت لمنحنى القوة وقم بإجراء ملاءمة خطية لهذه المنطقة.

لإيجاد الميل بالفولت لكل نانومتر ، ثم أعد ضبط محاذاة المرآة إلى انحراف حر من صفر فولت. بعد ذلك ، قم بمعايرة ثابت الزنبرك الكابولي باستخدام طريقة الضبط الحراري الموصوفة بواسطة levy و Malam. للبدء ، ارفع الماسح الضوئي بعيدا عن مرحلة العينة حتى لا تكون هناك تفاعلات بين الطرف والعينة.

ثم التقط البيانات الحرارية عن طريق تسجيل الاهتزاز الحراري لشعاع الكابولي. يحلل برنامج A FM طيف طاقة لمثل هذا الاهتزاز الحراري ويرسمه في نافذة بيانات. بعد ذلك ، قم بإجراء ملاءمة لمقطع البيانات المتمركز عند أدنى تردد ، والمعروف أيضا باسم ذروة الرنين الأساسي لتحديد ثابت الزنبرك.

من أجل إعداد FM للوحات الثقافة ، قم بتثبيت ملحق سخان الأطباق على مرحلة FM واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. انتظر 20 دقيقة حتى يصل النظام إلى توازن حراري مستقر. بمجرد التسخين المسبق ، ضع طبق ثقافة على مرحلة FM وقم بتثبيته باستخدام المشبك المزود بسخان الأطباق لقياسات تزيد عن 30 دقيقة ، يجب استخدام وسط مستقل عن ثاني أكسيد الكربون لاستبدال وسط الثقافة العادي.

بعد ذلك ، ضع قطرة صغيرة من وسط الثقافة 37 درجة مئوية على طرف ناتئ A FM وقم بخفض رأس FM حتى يتم غمر الطرف في السائل. باستخدام كاميرا CCD للرؤية العلوية ، قم بإعادة تنظيم شعاع الليزر على الكابولي. تختلف المحاذاة في السائل عن الهواء بسبب التغير في معامل الانكسار للوسط.

بمجرد المحاذاة ، قم بتعطيم طرف FM على منطقة خالية من الخلايا من طبق الثقافة وقم بإجراء معايرة حساسية الرافعة البصرية العكسية في البيئة السائلة. لبدء قياسات الخصائص الميكانيكية للخلايا ، ضع طرف الكابولي فوق منطقة عين بيرل للخلية بمساعدة المجهر البصري. يتم إجراء تعديلات دقيقة لموضع الكابولي من خلال تطبيق الإزاحات على الماسحات الضوئية X و Y.

ثم قم بتبديل FM إلى أربعة وضع طيفي واضبط معدل المسافة البادئة على خمسة ميكرومتر في الثانية ، وهو منخفض بما يكفي لتجنب التأثيرات الهيدروديناميكية. بعد ذلك ، اضبط نقطة تشغيل الانحراف على اثنين من نيوتن النانو. لتجنب إتلاف الخلايا ، اضبط هذه القيمة وفقا لصلابة العينة.

بالإضافة إلى ذلك ، حدد خيار التشغيل النسبي ، والذي سيصحح أي انحراف في إشارة الانحراف. ثم اضبط مسافة القوة على خمسة ميكرومترات للتأكد من انفصال الطرف تماما عن الخلية بين قياسات القوة. اجمع ثلاثة منحنيات قوة في مواقع مختلفة في منطقة النوى لما لا يقل عن 30 خلية لكل حالة.

على الرغم من أنه من المفيد أخذ منحنيات متعددة على كل خلية. للحصول على بيانات إحصائية موثوقة ، يمكن أن يؤدي أخذ الكثير منها إلى تغييرات في تصلب الخلية إلى الضيق من مسبار FM. مزيد من توصيف توزيع الخواص الميكانيكية في جميع أنحاء خلية واحدة باستخدام وضع خريطة القوة.

في وضع خريطة القوة ، اضبط حجم المسح الضوئي على 30 ميكرومتر والدقة على 32 × 32 ، ومعلمات المسافة البادئة هي نفسها تلك المحددة لمنحنيات القوة الفردية. سيأخذ A FM بعد ذلك منحنيات قوة مفردة عند كل بكسل في منطقة العينة ويوفر خريطة صلابة للمنطقة بأكملها. بعد ذلك ، قم بتحليل منحنيات القوة المسجلة باستخدام MATLAB لحساب صلابة الخلية.

ابدأ باعتماد خوارزمية نشرتها Lynette Al لأول مرة ، والتي تحسب كلا من الملاءمة الخطية وملاءمة الهرتز من كل نقطة باستخدام matlab. احسب خطأ RMS النسبي لكل من النوبات وجمع هذه القيم في كل نقطة. يتم تحديد النقطة التي تصل إلى الحد الأدنى من خطأ التركيب الكلي كنقطة اتصال أولية لتحديد موقع هذه النقطة أمر بالغ الأهمية للقياس الدقيق لمعامل الخلايا الصغيرة.

بعد ذلك ، احسب دلتا تشوه العينة. باستخدام المعادلات التالية مع التشوه يساوي صفرا قبل ملامسة الخلية حيث Z أقل من Z صفر ويساوي الفرق بين انحراف الكابولي D والمسافة الإجمالية Z بعد نقطة الاتصال. ثم احسب قوة المسافة البادئة F باستخدام المعادلات التالية حيث تكون القوة تساوي صفرا قبل ملامسة الخلية حيث Z أقل من Z صفر وتساوي ثابت الزنبرك K للناتئ مضروبا في انحراف الكابولي بعد نقطة التلامس.

ثم يتم تطبيق ملاءمة مربع إليز على تشوه العينة مقابل بيانات القوة البادئة في منطقة ما بعد التلامس لنموذج الهرتز من أجل استخراج معامل يونغ للخلية بناء على شكل الطرف المستخدم الموضح. فيما يلي منحنيات القوة التمثيلية المأخوذة من ثلاث خلايا ليفي T مستزرعة على ثلاثة أسطح مختلفة. كما ترون هنا ، يمكن أن تؤثر الأسطح المختلفة بشكل كبير على صلابة الهيكل الخلوي للخلية.

متوسط تشوه الخلايا المزروعة على سطح بلاستيكي صلب باللون الأحمر. تظهر تلك التي تزرع على جل بولي أكريلاميد صلب باللون الأرجواني ، وتلك التي تزرع على جل بولي أكريلاميد مرن تظهر باللون الأزرق. بعد تحديد نقاط التلامس في المنحنيات بعناية ، يمكن إظهار قوى المسافة البادئة كدالة لتشوه الخلية بدقة.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن حساب وحدات Young الخاصة بهم بدقة من أول 300 نانومتر من المسافة البادئة بعد الاتصال. يظهر هنا الخلايا الليفية التي تم نقلها ببروتين الفلورسنت الأخضر الموسوم بمينتون ، وهو نوع من الخيوط الوسيطة. كلما كانت الصورة أكثر إشراقا ، زاد عدد الإشارات في تلك المنطقة.

يمكن أن يكون هذا مرتبطا بصلابة الهيكل الخلوي للخلية. باستخدام تقنية رسم خرائط قوة FM المعروضة هنا ، من الممكن إظهار خريطة صلابة مماثلة للانفجار الليفي بدقة 32 × 32 بكسل حيث يمثل كل بكسل 2.5 × 2.5 ميكرون من مساحة سطح الخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فكرة جيدة عن كيفية استخدام الفحص المجهري للقوة الذرية لقياس مرونة خلايا الأنسجة الحية.