قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس معامل المرونة للخلايا الحية باستخدام مجهر القوة الذرية. ويتم تحقيق ذلك من خلال إجراء قياسات مطيافية القوة بتردد تعديل (FM) أولاً في مواقع مختلفة على الخلية. وكمرحلة ثانية، يتم تحليل كل منحنى للقوة والمسافة لتحديد النقطة التي يلامس فيها رأس مجهر AFM الخلية في البداية.

بعد ذلك، وبدءاً من نقطة التلامس، يتم مطابقة أول 200 إلى 300 نانومتر من بيانات الانبعاج وفقاً لنموذج hertz. ومن أجل استخلاص معامل المرونة، تعطي النتائج خريطة ثنائية الأبعاد لصلابة الخلية يتم الحصول عليها باستخدام وضع رسم خرائط القوة، حيث يمثل كل بكسل منحنى مسافة وقوة واحداً. ستقوم غوين توماس، وهي طالبة دراسات عليا من مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. لبدء هذا الإجراء، قم بتنظيف حامل الكابول باستخدام ethanol بتركيز 70% واتركه حتى يجف.

بعد ذلك، قم بتركيب ذراع كانتليفر bru DNP 10 في جهاز A FM وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، قم بمعايرة حساسية الرافعة الضوئية العكسية. يصف هذا المعامل مقدار استجابة الفوتودايود بالفولت لكل نانومتر من انحراف الكانتليفر.

لإنجاز ذلك، قم أولاً بوضع شريحة زجاجية نظيفة على منصة العينة. قم بتركيب رأس FM واضبط شعاع الليزر والمحاذاة وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وبمجرد إتمام المحاذاة، قم بتشبيك طرف A FM على الشريحة الزجاجية مع سحب P eight O.

أعد ضبط محاذاة المرآة لتصل قراءة الثنائي الضوئي إلى سالب 2 volts. ثم أجْرِ قياساً لمطيافية القوة باستجابة قصوى للثنائي الضوئي أو نقطة تحفيز تبلغ موجب 2 volts. بعد اكتمال عملية الحصول على البيانات، قم بتكبير منطقة التلامس الصلب في منحنى القوة وأجرِ مطابقة خطية لهذه المنطقة.

لإيجاد الميل بالفولت لكل نانومتر، قم بعد ذلك بإعادة ضبط محاذاة المرآة ليكون الانحراف الحر صفراً فولت. بعد ذلك، قم بمعايرة ثابت نابض الكانتيليفر باستخدام طريقة الضبط الحراري التي وصفها levy وMalam. للبدء، ارفع الماسح بعيداً عن منصة العينة بحيث لا تكون هناك أي تفاعلات بين الطرف والعينة.

ثم قم بالتقاط البيانات الحرارية عن طريق تسجيل الاهتزاز الحراري للعتبة الكابولية. ويقوم برنامج A FM بتحليل طيف القدرة لهذا الاهتزاز الحراري ورسمه في نافذة البيانات. بعد ذلك، قم بإجراء مطابقة لجزء البيانات المتمركز عند أدنى تردد، والمعروف أيضاً بقمة الرنين الأساسية، لتحديد ثابت النابض.

من أجل تحضير نظام الـ a FM لأطباق الزرع، قم بتركيب ملحق مسخن الأطباق على منصة الـ a FM واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. انتظر لمدة 20 دقيقة حتى يصل النظام إلى حالة توازن حراري مستقرة. وبمجرد التسخين المسبق، ضع طبق زرع على منصة الـ a FM وثبته باستخدام المشبك المرفق مع مسخن الأطباق؛ وبالنسبة للقياسات التي تزيد مدتها عن 30 دقيقة، يجب استخدام وسط زرع مستقل عن ثاني أكسيد الكربون بدلاً من وسط الزرع العادي.

بعد ذلك، ضع قطرة صغيرة من وسط زراعة بدرجة حرارة 37 degrees Celsius على طرف عتلة الـ A FM، ثم اخفض رأس الـ a FM حتى يغمر السائل الطرف تماماً. وباستخدام كاميرا CCD ذات عرض علوي، أعد محاذاة شعاع الليزر على العتلة. ستختلف المحاذاة في السائل عنها في الهواء بسبب التغير في معامل الانكسار للوسط.

بمجرد المحاذاة، قم بتفعيل طرف الـ A FM على منطقة خالية من الخلايا في طبق الزرع، وأجرِ معايرة لحساسية الرافعة الضوئية العكسية في البيئة السائلة. لبدء قياسات الخصائص الميكانيكية للخلايا، ضع طرف العارضة فوق منطقة عين اللؤلؤ في الخلية بمساعدة مجهر ضوئي. يتم إجراء تعديلات دقيقة على موضع العوارض عن طريق تطبيق إزاحات على ماسحي X و Y.

بعد ذلك، قم بتحويل الـ FM إلى وضع المطيافية الرباعي، واضبط معدل الغرز عند 5 µm/s، وهو معدل منخفض بما يكفي لتجنب التأثيرات الهيدروديناميكية. بعد ذلك، اضبط نقطة تحفيز الانحراف عند 2 nN. ولتجنب إتلاف الخلايا، قم بتعديل هذه القيمة وفقاً لصلابة العينة.

بالإضافة إلى ذلك، حدد خيار التشغيل النسبي (relative triggering)، والذي سيعمل على تصحيح أي انزياح في إشارة الانحراف. ثم اضبط مسافة القوة عند 5 µm لضمان انفصال الطرف تماماً عن الخلية بين قياسات القوة. اجمع ثلاثة منحنيات قوة من مواقع مختلفة في منطقة النواة لـ 30 خلية على الأقل لكل حالة.

على الرغم من أنه من المفيد أخذ منحنيات متعددة لكل خلية، إلا أن أخذ عدد كبير جداً من المنحنيات للحصول على بيانات إحصائية موثوقة قد يؤدي إلى تغيرات في صلابة الخلية نتيجة الإجهاد الناجم عن مسبار AFM. قم بتوصيف توزيع الخصائص الميكانيكية عبر خلية واحدة باستخدام وضع خريطة القوة (force map mode).

في وضع خريطة القوة، اضبط حجم المسح على 30 micrometers والدقة على 32 في 32، وتكون معاملات الغرز هي نفسها المختارة لمنحنيات القوة الفردية. سيقوم جهاز A FM بعد ذلك بأخذ منحنيات قوة فردية عند كل بكسل في منطقة العينة وتوفير خريطة صلابة للمنطقة بأكملها. بعد ذلك، قم بتحليل منحنيات القوة المسجلة باستخدام MATLAB لحساب صلابة الخلية.

ابدأ بتطبيق خوارزمية نشرتها لأول مرة Lynette Al، والتي تقوم بحساب كل من الملاءمة الخطية وملاءمة هيرتز من كل نقطة باستخدام برنامج matlab. احسب الخطأ التربيعي المتوسط النسبي (relative RMS error) لكلا الملاءمتين واجمع هذه القيم عند كل نقطة. يتم اختيار النقطة التي تحقق الحد الأدنى من إجمالي خطأ الملاءمة كنقطة اتصال أولية، حيث يعد تحديد هذه النقطة أمراً بالغ الأهمية للقياس الدقيق لمعامل يونج (young's modulus) للخلايا.

بعد ذلك، احسب دلتا تشوه العينة. باستخدام المعادلات التالية، يكون التشوه مساوياً للصفر قبل ملامسة الخلية عندما تكون Z أقل من Z zero، ويكون مساوياً للفرق بين انحراف الكابول D والمسافة الإجمالية Z بعد نقطة التلامس. ثم احسب قوة الغرز F باستخدام المعادلات التالية، حيث تكون القوة مساوية للصفر قبل ملامسة الخلية عندما تكون Z أقل من Z zero، وتكون مساوية لثابت النابض K للكابول مضروباً في انحراف الكابول بعد نقطة التلامس.

يتم بعد ذلك تطبيق ملاءمة مربع إليز (Elise square's fit) على بيانات تشوه العينة مقابل قوة الغرز في منطقة ما بعد التلامس لنموذج هيرتز (hertz model)، وذلك لاستخراج معامل يونغ (Young's modulus) للخلية بناءً على شكل الطرف المستخدم الموضح. فيما يلي منحنيات قوة ممثلة مأخوذة من ثلاث خلايا ليفية T3 مستزرعة على ثلاثة أسطح مختلفة. وكما تلاحظون هنا، يمكن للأسطح المختلفة أن تؤثر بشكل كبير على صلابة الهيكل الخلوي للخلية.

يظهر متوسط تشوه الخلايا المستزرعة على سطح بلاستيكي صلب باللون الأحمر. وتظهر الخلايا التي نمت على هلام بولي أكريلاميد صلب باللون الأرجواني، بينما تظهر الخلايا التي نمت على هلام بولي أكريلاميد مرن باللون الأزرق. وبعد تحديد نقاط التلامس في المنحنيات بدقة، يمكن توضيح قوى الغرز كدالة لتشوه الخلية بدقة.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن حساب معامل يونغ (Young's modular) بدقة من أول 300 nanometers من الانبعاج بعد التلامس. يظهر هنا خلية ليفية (fibroblast) تم ترانسفكشنها ببروتين menton الملحق بالبروتين الفلوري الأخضر، وهو نوع من الخيوط المتوسطة. وكلما كانت الصورة أكثر سطوعاً، دل ذلك على وجود كمية أكبر من menton في تلك المنطقة.

يمكن أن يرتبط ذلك بصلابة الهيكل الخلوي. باستخدام تقنية رسم خرائط القوة بمجهر القوة الذرية (AFM) المعروضة هنا، يمكن إظهار خريطة صلابة مماثلة لخلية ليفية بدقة 32 في 32 بكسل، حيث يمثل كل بكسل مساحة 2.5 في 2.5 ميكرون من سطح الخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ستكون لديك فكرة جيدة عن كيفية استخدام مجهر القوة الذرية لقياس مرونة خلايا الأنسجة الحية.