خلايا المرور
يعد تمرير الخلايا أو تثقيفها الفرعي إجراء شائعا يتم فيه تقسيم الخلايا من ثقافة معينة أو "تقسيمها" إلى ثقافات جديدة وتغذيتها بوسائط جديدة لتسهيل المزيد من التوسع. في حين أن المفهوم نفسه بسيط نسبيا ، سنناقش في هذا الفيديو بعض الخطوات الأكثر أهمية للصيانة الناجحة وتوسيع خطوط الخلايا.
تتراكم المستقلبات السامة في وسط زراعة الخلايا بمرور الوقت. عند توسيع الخلايا ، من المهم بشكل خاص تغيير الوسائط بانتظام للحفاظ على صحة الخلية ومراقبة توسع الخلية لتجنب فرط نمو الخلايا.
بشكل عام ، يتم زراعة نوعين رئيسيين من الخلايا: خطوط الخلايا الخالدة وخطوط الخلايا الجذعية
خطوط الخلايا الخالدة هي خلايا مشتقة من كائنات متعددة الخلايا تعرضت لنوع من الطفرات التي تؤثر على تنظيم دورة الخلية ، مما يسمح لها بالتكاثر إلى أجل غير مسمى. ربما يكون خط الخلايا الأكثر شهرة هو خط خلايا HeLa ، والذي اشتق من آفة سرطان عنق الرحم الموجودة في خزعة مأخوذة من السيدة هنريتا لاكس في عام 1951.
على عكس خطوط الخلايا التي خلدها السرطان ، يتم إنشاء خطوط الخلايا الجذعية عن طريق عزل الخلايا المتجددة ذاتيا ومتعددة القدرات من مجموعة متنوعة من الأنسجة من الأنسجة البالغة والجنينية. في ظل الظروف المناسبة ، يمكن الحفاظ على هذه الخلايا ، مثل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي تراها هنا ، في الثقافة إلى أجل غير مسمى.
يتم استزراع الخلايا على النحو الأمثل في معلق ، مثل الخلايا الخالدة المعزولة من الدم ، أو تنمو بشكل أفضل عند الالتصاق بالسطح ، كما هو الحال بالنسبة للعديد من الخلايا المشتقة من الأنسجة.
يجب مراقبة نمو هذه الخلايا الملتصقة عن كثب لضمان صحة الخلية. اعتمادا على نوع الخلية ، يجب تمرير معظم الخلايا الملتصقة عندما تكون متقاربة بنسبة 70-90٪ ، أي عندما تغطي 70-90٪ من سطح حاوية الزراعة.
ضع في اعتبارك أن خطوط الخلايا تحتفظ بالعديد من خصائص ثقافة الخلية الأصلية ، ولكن مع كل مقطع متتالي يمكنها أيضا البدء في اكتساب خصائص فريدة للثقافة الموسعة. لذلك ، ضع في اعتبارك الحد من عدد المرات التي تستمر فيها في اجتياز مزرعة خلوية فردية.
عند مرور الخلايا ، من المهم استخدام تقنية معقمة والكواشف والمعدات المناسبة.
من الضروري استخدام الوسائط المناسبة للنمو والتوسع الأمثل لخط الخلية الخاص بك. سيتطلب كل خط خلوي كوكتيل مكمل نمو محدد ، ومع ذلك ، فإن معظم خطوط الخلايا على الأقل تتطلب مكملات بما يلي: المصل ، مثل مصل الأبقار الجنيني ، والذي يجب معالجته بالحرارة لتعطيل مكمل البقر والذي يوفر عوامل نمو حيوية للخلايا ، والمضادات الحيوية ، مثل البنسلين والستربتومايسين ، والتي تساعد على الحد من النمو الملوث في الثقافة ، وعوامل النمو الأخرى ، مثل عامل نمو الخلايا الليفية ، للمساعدة في إطالة نمو وتوسع خطوط الخلايا. قم بتخزين وسائط زراعة الخلايا المكملة أو "الكاملة" في درجة حرارة 4 درجات مئوية عند عدم استخدامها.
أولا ، لاحظ لون وسط زراعة الأنسجة. وسائط زراعة الخلايا الطازجة غنية بالعناصر الغذائية وتظهر بلون برتقالي واضح ، ويرجع ذلك جزئيا إلى إضافة مؤشر الأس الهيدروجيني ، أحمر الفينول.
عندما تبدأ الخلايا في استخدام العناصر الغذائية في الوسائط ، تبدأ النفايات والحمض في التراكم في مزرعة الخلايا ، مما يؤدي إلى خفض درجة الحموضة. لهذا السبب ، تحتوي العديد من وسائط زراعة الأنسجة على الفينول الأحمر ، مما يحول الوسائط من البرتقالي إلى الأصفر عندما تحول الخلايا إلى حمضية المزرعة. قم بتغيير الوسائط قبل أن تتحول إلى هذا اللون!
عندما يحول الفينول الأحمر الوسائط إلى اللون الوردي ، مما يشير إلى أن الرقم الهيدروجيني أصبح أساسيا جدا لنمو الخلايا الصحية ، فقد يكون الوقت قد حان لتغيير خزان ثاني أكسيد الكربون وكذلك الوسائط الخاصة بك.
ترتبط معظم خطوط الخلايا الملتصقة بشكل طبيعي بالبلاستيك غير المطلي. لذلك ، كثيرا ما تستخدم ألواح زراعة الخلايا البلاستيكية ، مثل أطباق بتري أو 6 ألواح آبار ، لزراعة الخلايا الفرعية.
كما تستخدم قوارير زراعة الخلايا البلاستيكية. غالبا ما تستخدم قارورة ثقافة الخلايا T25 ، على سبيل المثال ، لتوسيع مجموعات خطوط الخلايا الصغيرة أو لبدء نمو خط خلوي يتوسع ببطء. تستخدم قوارير ثقافة T75 بشكل شائع لخطوط الخلايا التي تتكاثر بسرعة أكبر أو لتوليد أعداد أكبر من الخلايا مما يمكن وضعه في قارورة T25.
عند إزالة الخلايا الملتصقة ، يجب أولا شق البروتينات التي تربط الخلايا بالبلاستيك. لهذا الغرض ، يتم استخدام إنزيم التربسين الهضمي بشكل متكرر. من المهم تحديد وقت التعرض للتربسين بعناية ، لأن العلاج لفترة طويلة يمكن أن يؤدي إلى تلف بروتينات سطح الخلية الأخرى.
يمكن أن تحتوي وسائط زراعة الخلايا على معادلات التربسين. لذلك ، غالبا ما يستخدم محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS ، لغسل الخلايا قبل التربسين.
يستخدم EDTA ، وهو مخلب الكالسيوم ، أحيانا أيضا لتعزيز وظيفة التحلل للبروتين في التربسين.
لتوسيع مستعمرة الخلية ، تزرع الخلايا التي تم تمريرها حديثا في حاضنة زراعة الخلايا في ظل الظروف المناسبة لخط الخلية هذا ، عادة عند حوالي 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، و 95٪ رطوبة.
قبل أن تبدأ ، من المهم أن تفهم عدد المرات التي يجب فيها مراقبة خلاياك ، والتي ستعتمد على مدى سرعة تكاثر خلاياك.
الآن بعد أن أصبحت الوسائط الخاصة بك ذات لون برتقالي سعيد ، راقب ظروف الثقافة الأخرى ، مثل ما إذا كانت الثقافة غائمة أم لا - ربما تشير إلى تلوث - حجم وكثافة مستعمرات الخلايا ، والجودة الإجمالية للخلايا.
إذا وصلت الخلايا إلى حوالي 90٪ من التقاء ، فقم بإزالة وسط زراعة الأنسجة وغسل الخلايا باستخدام PBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم.
أضف الآن التربسين إلى الخلايا ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية. بعد حوالي 5 دقائق ، تأكد من انفصال الخلايا ، ثم أوقف التحلل البروتيني عن طريق إضافة وسائط زراعة الأنسجة الطازجة.
انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي الشكل للطرد المركزي. ثم ، بعد تدوير الخلايا ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات وإعادة تعليق الخلايا في وسائط جديدة. احسب عدد الخلايا التي جمعتها ثم قم بزرع الخلايا وفقا للكثافة المناسبة للتوسع الفوري أو اللاحق.
الآن بعد أن عرفت كيفية تمرير الخلايا ، دعنا نلقي نظرة على بعض التطبيقات المختلفة للطريقة.
كما ذكرنا سابقا ، فإن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية هي نوع من الخلايا التي يجب مرورها. عادة ما يتم زراعتها مع الخلايا الليفية الجنينية للفأر ، أو MEFs ، والتي توفر العوامل التي تساعد الخلايا الجذعية على الاحتفاظ بحالتها متعددة القدرات.
تحتاج مستعمرات الخلايا الجذعية المزروعة على الخلايا المغذية إلى "القطف" بمجرد وصولها إلى المرحلة المناسبة من التطور. يمكن اختيارها عن طريق الماصة الدقيقة أو عن طريق الكشط اللطيف باستخدام أداة التقاط الزجاج ثم طلاءها في ثقافة جديدة للتوسع.
بعض خطوط الخلايا حساسة للهضم الأنزيمي أو ملتصقة بإحكام بحيث لا يمكن تعليقها بعلاج التربسين وحده. يمكن استخدام مكشطة الخلية لإزالة الخلايا برفق من أسفل لوحة الثقافة. إذا كانت الخلايا ملتصقة بشكل خاص ، فحاول تحريك الماصة المصلية بحركة كشط ثابتة أثناء شطف قاع حاوية الخلية بوسائط أو محلول مناسب آخر. توخ الحذر مع هذه الطريقة ، حيث يمكن أن تتلف الخلايا الحساسة بسبب هذه الطريقة الميكانيكية للتفكك.
لزيادة توسع خلاياك بسرعة أكبر وبشكل متكرر أكثر مما يمكن تحقيقه في قوارير أحادية الطبقة ، يمكن استخدام قوارير متعددة الطبقات ، والتي يمكنها توسيع مزارع الخلايا 3-5 أضعاف مقارنة بالقوارير أحادية الطبقة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لخلايا المرور. في هذا الفيديو ، استعرضنا ماهية خط الخلية ، وكيفية الزراعة الفرعية ، وبعض التطبيقات المختلفة للخلايا المارة. شكرا على المشاهدة وتذكر أن تحافظ على الوسائط الخاصة بك جديدة!
كثيرا ما تستخدم خطوط الخلايا في التجارب الطبية الحيوية ، لأنها تسمح بالزراعة السريعة والتوسع في أنواع الخلايا للتحليل التجريبي. يتم استزراع خطوط الخلا…
يعد تمرير الخلايا أو تثقيفها الفرعي إجراء شائعا يتم فيه تقسيم الخلايا من ثقافة معينة أو "تقسيمها" إلى ثقافات جديدة وتغذيتها بوسائط جديدة لتسهيل المزيد من التوسع. في حين أن المفهوم نفسه بسيط نسبيا ، سنناقش في هذا الفيديو بعض الخطوات الأكثر أهمية للصيانة الناجحة وتوسيع خطوط الخلايا.
تتراكم المستقلبات السامة في وسط زراعة الخلايا بمرور الوقت. عند توسيع الخلايا ، من المهم بشكل خاص تغيير الوسائط بانتظام للحفاظ على صحة الخلية ومراقبة توسع الخلية لتجنب فرط نمو الخلايا.
بشكل عام ، يتم زراعة نوعين رئيسيين من الخلايا: خطوط الخلايا الخالدة وخطوط الخلايا الجذعية
خطوط الخلايا الخالدة هي خلايا مشتقة من كائنات متعددة الخلايا تعرضت لنوع من الطفرات التي تؤثر على تنظيم دورة الخلية ، مما يسمح لها بالتكاثر إلى أجل غير مسمى. ربما يكون خط الخلايا الأكثر شهرة هو خط خلايا HeLa ، والذي اشتق من آفة سرطان عنق الرحم الموجودة في خزعة مأخوذة من السيدة هنريتا لاكس في عام 1951.
على عكس خطوط الخلايا التي خلدها السرطان ، يتم إنشاء خطوط الخلايا الجذعية عن طريق عزل الخلايا المتجددة ذاتيا ومتعددة القدرات من مجموعة متنوعة من الأنسجة من الأنسجة البالغة والجنينية. في ظل الظروف المناسبة ، يمكن الحفاظ على هذه الخلايا ، مثل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي تراها هنا ، في الثقافة إلى أجل غير مسمى.
يتم استزراع الخلايا على النحو الأمثل في معلق ، مثل الخلايا الخالدة المعزولة من الدم ، أو تنمو بشكل أفضل عند الالتصاق بالسطح ، كما هو الحال بالنسبة للعديد من الخلايا المشتقة من الأنسجة.
يجب مراقبة نمو هذه الخلايا الملتصقة عن كثب لضمان صحة الخلية. اعتمادا على نوع الخلية ، يجب تمرير معظم الخلايا الملتصقة عندما تكون متقاربة بنسبة 70-90٪ ، أي عندما تغطي 70-90٪ من سطح حاوية الزراعة.
ضع في اعتبارك أن خطوط الخلايا تحتفظ بالعديد من خصائص ثقافة الخلية الأصلية ، ولكن مع كل مقطع متتالي يمكنها أيضا البدء في اكتساب خصائص فريدة للثقافة الموسعة. لذلك ، ضع في اعتبارك الحد من عدد المرات التي تستمر فيها في اجتياز مزرعة خلوية فردية.
عند مرور الخلايا ، من المهم استخدام تقنية معقمة والكواشف والمعدات المناسبة.
من الضروري استخدام الوسائط المناسبة للنمو والتوسع الأمثل لخط الخلية الخاص بك. سيتطلب كل خط خلوي كوكتيل مكمل نمو محدد ، ومع ذلك ، فإن معظم خطوط الخلايا على الأقل تتطلب مكملات بما يلي: المصل ، مثل مصل الأبقار الجنيني ، والذي يجب معالجته بالحرارة لتعطيل مكمل البقر والذي يوفر عوامل نمو حيوية للخلايا ، والمضادات الحيوية ، مثل البنسلين والستربتومايسين ، والتي تساعد على الحد من النمو الملوث في الثقافة ، وعوامل النمو الأخرى ، مثل عامل نمو الخلايا الليفية ، للمساعدة في إطالة نمو وتوسع خطوط الخلايا. قم بتخزين وسائط زراعة الخلايا المكملة أو "الكاملة" في درجة حرارة 4 درجات مئوية عند عدم استخدامها.
أولا ، لاحظ لون وسط زراعة الأنسجة. وسائط زراعة الخلايا الطازجة غنية بالعناصر الغذائية وتظهر بلون برتقالي واضح ، ويرجع ذلك جزئيا إلى إضافة مؤشر الأس الهيدروجيني ، أحمر الفينول.
عندما تبدأ الخلايا في استخدام العناصر الغذائية في الوسائط ، تبدأ النفايات والحمض في التراكم في مزرعة الخلايا ، مما يؤدي إلى خفض درجة الحموضة. لهذا السبب ، تحتوي العديد من وسائط زراعة الأنسجة على الفينول الأحمر ، مما يحول الوسائط من البرتقالي إلى الأصفر عندما تحول الخلايا إلى حمضية المزرعة. قم بتغيير الوسائط قبل أن تتحول إلى هذا اللون!
عندما يحول الفينول الأحمر الوسائط إلى اللون الوردي ، مما يشير إلى أن الرقم الهيدروجيني أصبح أساسيا جدا لنمو الخلايا الصحية ، فقد يكون الوقت قد حان لتغيير خزان ثاني أكسيد الكربون وكذلك الوسائط الخاصة بك.
ترتبط معظم خطوط الخلايا الملتصقة بشكل طبيعي بالبلاستيك غير المطلي. لذلك ، كثيرا ما تستخدم ألواح زراعة الخلايا البلاستيكية ، مثل أطباق بتري أو 6 ألواح آبار ، لزراعة الخلايا الفرعية.
كما تستخدم قوارير زراعة الخلايا البلاستيكية. غالبا ما تستخدم قارورة ثقافة الخلايا T25 ، على سبيل المثال ، لتوسيع مجموعات خطوط الخلايا الصغيرة أو لبدء نمو خط خلوي يتوسع ببطء. تستخدم قوارير ثقافة T75 بشكل شائع لخطوط الخلايا التي تتكاثر بسرعة أكبر أو لتوليد أعداد أكبر من الخلايا مما يمكن وضعه في قارورة T25.
عند إزالة الخلايا الملتصقة ، يجب أولا شق البروتينات التي تربط الخلايا بالبلاستيك. لهذا الغرض ، يتم استخدام إنزيم التربسين الهضمي بشكل متكرر. من المهم تحديد وقت التعرض للتربسين بعناية ، لأن العلاج لفترة طويلة يمكن أن يؤدي إلى تلف بروتينات سطح الخلية الأخرى.
يمكن أن تحتوي وسائط زراعة الخلايا على معادلات التربسين. لذلك ، غالبا ما يستخدم محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS ، لغسل الخلايا قبل التربسين.
يستخدم EDTA ، وهو مخلب الكالسيوم ، أحيانا أيضا لتعزيز وظيفة التحلل للبروتين في التربسين.
لتوسيع مستعمرة الخلية ، تزرع الخلايا التي تم تمريرها حديثا في حاضنة زراعة الخلايا في ظل الظروف المناسبة لخط الخلية هذا ، عادة عند حوالي 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، و 95٪ رطوبة.
قبل أن تبدأ ، من المهم أن تفهم عدد المرات التي يجب فيها مراقبة خلاياك ، والتي ستعتمد على مدى سرعة تكاثر خلاياك.
الآن بعد أن أصبحت الوسائط الخاصة بك ذات لون برتقالي سعيد ، راقب ظروف الثقافة الأخرى ، مثل ما إذا كانت الثقافة غائمة أم لا - ربما تشير إلى تلوث - حجم وكثافة مستعمرات الخلايا ، والجودة الإجمالية للخلايا.
إذا وصلت الخلايا إلى حوالي 90٪ من التقاء ، فقم بإزالة وسط زراعة الأنسجة وغسل الخلايا باستخدام PBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم.
أضف الآن التربسين إلى الخلايا ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية. بعد حوالي 5 دقائق ، تأكد من انفصال الخلايا ، ثم أوقف التحلل البروتيني عن طريق إضافة وسائط زراعة الأنسجة الطازجة.
انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي الشكل للطرد المركزي. ثم ، بعد تدوير الخلايا ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات وإعادة تعليق الخلايا في وسائط جديدة. احسب عدد الخلايا التي جمعتها ثم قم بزرع الخلايا وفقا للكثافة المناسبة للتوسع الفوري أو اللاحق.
الآن بعد أن عرفت كيفية تمرير الخلايا ، دعنا نلقي نظرة على بعض التطبيقات المختلفة للطريقة.
كما ذكرنا سابقا ، فإن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية هي نوع من الخلايا التي يجب مرورها. عادة ما يتم زراعتها مع الخلايا الليفية الجنينية للفأر ، أو MEFs ، والتي توفر العوامل التي تساعد الخلايا الجذعية على الاحتفاظ بحالتها متعددة القدرات.
تحتاج مستعمرات الخلايا الجذعية المزروعة على الخلايا المغذية إلى "القطف" بمجرد وصولها إلى المرحلة المناسبة من التطور. يمكن اختيارها عن طريق الماصة الدقيقة أو عن طريق الكشط اللطيف باستخدام أداة التقاط الزجاج ثم طلاءها في ثقافة جديدة للتوسع.
بعض خطوط الخلايا حساسة للهضم الأنزيمي أو ملتصقة بإحكام بحيث لا يمكن تعليقها بعلاج التربسين وحده. يمكن استخدام مكشطة الخلية لإزالة الخلايا برفق من أسفل لوحة الثقافة. إذا كانت الخلايا ملتصقة بشكل خاص ، فحاول تحريك الماصة المصلية بحركة كشط ثابتة أثناء شطف قاع حاوية الخلية بوسائط أو محلول مناسب آخر. توخ الحذر مع هذه الطريقة ، حيث يمكن أن تتلف الخلايا الحساسة بسبب هذه الطريقة الميكانيكية للتفكك.
لزيادة توسع خلاياك بسرعة أكبر وبشكل متكرر أكثر مما يمكن تحقيقه في قوارير أحادية الطبقة ، يمكن استخدام قوارير متعددة الطبقات ، والتي يمكنها توسيع مزارع الخلايا 3-5 أضعاف مقارنة بالقوارير أحادية الطبقة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لخلايا المرور. في هذا الفيديو ، استعرضنا ماهية خط الخلية ، وكيفية الزراعة الفرعية ، وبعض التطبيقات المختلفة للخلايا المارة. شكرا على المشاهدة وتذكر أن تحافظ على الوسائط الخاصة بك جديدة!
يعد تمرير الخلايا أو تثقيفها الفرعي إجراء شائعا يتم فيه تقسيم الخلايا من ثقافة معينة أو "تقسيمها" إلى ثقافات جديدة وتغذيتها بوسائط جديدة لتسهيل المزيد من التوسع. في حين أن المفهوم نفسه بسيط نسبيا ، سنناقش في هذا الفيديو بعض الخطوات الأكثر أهمية للصيانة الناجحة وتوسيع خطوط الخلايا.
تتراكم المستقلبات السامة في وسط زراعة الخلايا بمرور الوقت. عند توسيع الخلايا ، من المهم بشكل خاص تغيير الوسائط بانتظام للحفاظ على صحة الخلية ومراقبة توسع الخلية لتجنب فرط نمو الخلايا.
بشكل عام ، يتم زراعة نوعين رئيسيين من الخلايا: خطوط الخلايا الخالدة وخطوط الخلايا الجذعية
خطوط الخلايا الخالدة هي خلايا مشتقة من كائنات متعددة الخلايا تعرضت لنوع من الطفرات التي تؤثر على تنظيم دورة الخلية ، مما يسمح لها بالتكاثر إلى أجل غير مسمى. ربما يكون خط الخلايا الأكثر شهرة هو خط خلايا HeLa ، والذي اشتق من آفة سرطان عنق الرحم الموجودة في خزعة مأخوذة من السيدة هنريتا لاكس في عام 1951.
على عكس خطوط الخلايا التي خلدها السرطان ، يتم إنشاء خطوط الخلايا الجذعية عن طريق عزل الخلايا المتجددة ذاتيا ومتعددة القدرات من مجموعة متنوعة من الأنسجة من الأنسجة البالغة والجنينية. في ظل الظروف المناسبة ، يمكن الحفاظ على هذه الخلايا ، مثل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي تراها هنا ، في الثقافة إلى أجل غير مسمى.
يتم استزراع الخلايا على النحو الأمثل في معلق ، مثل الخلايا الخالدة المعزولة من الدم ، أو تنمو بشكل أفضل عند الالتصاق بالسطح ، كما هو الحال بالنسبة للعديد من الخلايا المشتقة من الأنسجة.
يجب مراقبة نمو هذه الخلايا الملتصقة عن كثب لضمان صحة الخلية. اعتمادا على نوع الخلية ، يجب تمرير معظم الخلايا الملتصقة عندما تكون متقاربة بنسبة 70-90٪ ، أي عندما تغطي 70-90٪ من سطح حاوية الزراعة.
ضع في اعتبارك أن خطوط الخلايا تحتفظ بالعديد من خصائص ثقافة الخلية الأصلية ، ولكن مع كل مقطع متتالي يمكنها أيضا البدء في اكتساب خصائص فريدة للثقافة الموسعة. لذلك ، ضع في اعتبارك الحد من عدد المرات التي تستمر فيها في اجتياز مزرعة خلوية فردية.
عند مرور الخلايا ، من المهم استخدام تقنية معقمة والكواشف والمعدات المناسبة.
من الضروري استخدام الوسائط المناسبة للنمو والتوسع الأمثل لخط الخلية الخاص بك. سيتطلب كل خط خلوي كوكتيل مكمل نمو محدد ، ومع ذلك ، فإن معظم خطوط الخلايا على الأقل تتطلب مكملات بما يلي: المصل ، مثل مصل الأبقار الجنيني ، والذي يجب معالجته بالحرارة لتعطيل مكمل البقر والذي يوفر عوامل نمو حيوية للخلايا ، والمضادات الحيوية ، مثل البنسلين والستربتومايسين ، والتي تساعد على الحد من النمو الملوث في الثقافة ، وعوامل النمو الأخرى ، مثل عامل نمو الخلايا الليفية ، للمساعدة في إطالة نمو وتوسع خطوط الخلايا. قم بتخزين وسائط زراعة الخلايا المكملة أو "الكاملة" في درجة حرارة 4 درجات مئوية عند عدم استخدامها.
أولا ، لاحظ لون وسط زراعة الأنسجة. وسائط زراعة الخلايا الطازجة غنية بالعناصر الغذائية وتظهر بلون برتقالي واضح ، ويرجع ذلك جزئيا إلى إضافة مؤشر الأس الهيدروجيني ، أحمر الفينول.
عندما تبدأ الخلايا في استخدام العناصر الغذائية في الوسائط ، تبدأ النفايات والحمض في التراكم في مزرعة الخلايا ، مما يؤدي إلى خفض درجة الحموضة. لهذا السبب ، تحتوي العديد من وسائط زراعة الأنسجة على الفينول الأحمر ، مما يحول الوسائط من البرتقالي إلى الأصفر عندما تحول الخلايا إلى حمضية المزرعة. قم بتغيير الوسائط قبل أن تتحول إلى هذا اللون!
عندما يحول الفينول الأحمر الوسائط إلى اللون الوردي ، مما يشير إلى أن الرقم الهيدروجيني أصبح أساسيا جدا لنمو الخلايا الصحية ، فقد يكون الوقت قد حان لتغيير خزان ثاني أكسيد الكربون وكذلك الوسائط الخاصة بك.
ترتبط معظم خطوط الخلايا الملتصقة بشكل طبيعي بالبلاستيك غير المطلي. لذلك ، كثيرا ما تستخدم ألواح زراعة الخلايا البلاستيكية ، مثل أطباق بتري أو 6 ألواح آبار ، لزراعة الخلايا الفرعية.
كما تستخدم قوارير زراعة الخلايا البلاستيكية. غالبا ما تستخدم قارورة ثقافة الخلايا T25 ، على سبيل المثال ، لتوسيع مجموعات خطوط الخلايا الصغيرة أو لبدء نمو خط خلوي يتوسع ببطء. تستخدم قوارير ثقافة T75 بشكل شائع لخطوط الخلايا التي تتكاثر بسرعة أكبر أو لتوليد أعداد أكبر من الخلايا مما يمكن وضعه في قارورة T25.
عند إزالة الخلايا الملتصقة ، يجب أولا شق البروتينات التي تربط الخلايا بالبلاستيك. لهذا الغرض ، يتم استخدام إنزيم التربسين الهضمي بشكل متكرر. من المهم تحديد وقت التعرض للتربسين بعناية ، لأن العلاج لفترة طويلة يمكن أن يؤدي إلى تلف بروتينات سطح الخلية الأخرى.
يمكن أن تحتوي وسائط زراعة الخلايا على معادلات التربسين. لذلك ، غالبا ما يستخدم محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS ، لغسل الخلايا قبل التربسين.
يستخدم EDTA ، وهو مخلب الكالسيوم ، أحيانا أيضا لتعزيز وظيفة التحلل للبروتين في التربسين.
لتوسيع مستعمرة الخلية ، تزرع الخلايا التي تم تمريرها حديثا في حاضنة زراعة الخلايا في ظل الظروف المناسبة لخط الخلية هذا ، عادة عند حوالي 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، و 95٪ رطوبة.
قبل أن تبدأ ، من المهم أن تفهم عدد المرات التي يجب فيها مراقبة خلاياك ، والتي ستعتمد على مدى سرعة تكاثر خلاياك.
الآن بعد أن أصبحت الوسائط الخاصة بك ذات لون برتقالي سعيد ، راقب ظروف الثقافة الأخرى ، مثل ما إذا كانت الثقافة غائمة أم لا - ربما تشير إلى تلوث - حجم وكثافة مستعمرات الخلايا ، والجودة الإجمالية للخلايا.
إذا وصلت الخلايا إلى حوالي 90٪ من التقاء ، فقم بإزالة وسط زراعة الأنسجة وغسل الخلايا باستخدام PBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم.
أضف الآن التربسين إلى الخلايا ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية. بعد حوالي 5 دقائق ، تأكد من انفصال الخلايا ، ثم أوقف التحلل البروتيني عن طريق إضافة وسائط زراعة الأنسجة الطازجة.
انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي الشكل للطرد المركزي. ثم ، بعد تدوير الخلايا ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات وإعادة تعليق الخلايا في وسائط جديدة. احسب عدد الخلايا التي جمعتها ثم قم بزرع الخلايا وفقا للكثافة المناسبة للتوسع الفوري أو اللاحق.
الآن بعد أن عرفت كيفية تمرير الخلايا ، دعنا نلقي نظرة على بعض التطبيقات المختلفة للطريقة.
كما ذكرنا سابقا ، فإن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية هي نوع من الخلايا التي يجب مرورها. عادة ما يتم زراعتها مع الخلايا الليفية الجنينية للفأر ، أو MEFs ، والتي توفر العوامل التي تساعد الخلايا الجذعية على الاحتفاظ بحالتها متعددة القدرات.
تحتاج مستعمرات الخلايا الجذعية المزروعة على الخلايا المغذية إلى "القطف" بمجرد وصولها إلى المرحلة المناسبة من التطور. يمكن اختيارها عن طريق الماصة الدقيقة أو عن طريق الكشط اللطيف باستخدام أداة التقاط الزجاج ثم طلاءها في ثقافة جديدة للتوسع.
بعض خطوط الخلايا حساسة للهضم الأنزيمي أو ملتصقة بإحكام بحيث لا يمكن تعليقها بعلاج التربسين وحده. يمكن استخدام مكشطة الخلية لإزالة الخلايا برفق من أسفل لوحة الثقافة. إذا كانت الخلايا ملتصقة بشكل خاص ، فحاول تحريك الماصة المصلية بحركة كشط ثابتة أثناء شطف قاع حاوية الخلية بوسائط أو محلول مناسب آخر. توخ الحذر مع هذه الطريقة ، حيث يمكن أن تتلف الخلايا الحساسة بسبب هذه الطريقة الميكانيكية للتفكك.
لزيادة توسع خلاياك بسرعة أكبر وبشكل متكرر أكثر مما يمكن تحقيقه في قوارير أحادية الطبقة ، يمكن استخدام قوارير متعددة الطبقات ، والتي يمكنها توسيع مزارع الخلايا 3-5 أضعاف مقارنة بالقوارير أحادية الطبقة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لخلايا المرور. في هذا الفيديو ، استعرضنا ماهية خط الخلية ، وكيفية الزراعة الفرعية ، وبعض التطبيقات المختلفة للخلايا المارة. شكرا على المشاهدة وتذكر أن تحافظ على الوسائط الخاصة بك جديدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between immortalized cell lines and stem cell lines?
Immortalized cell lines derive from multicellular organisms with mutations affecting cell cycle regulation, allowing indefinite proliferation. Stem cell lines are generated by isolating self-renewing, multipotent cells from adult or embryonic tissues. Both can be maintained indefinitely in culture under appropriate conditions, but stem cells retain pluripotency while immortalized cells do not.
Q2: Why is it important to change cell culture media regularly?
Toxic metabolites accumulate in cell culture media over time, lowering pH and reducing nutrient availability. Fresh media maintains cell health and supports continued expansion. Media color indicators like phenol red signal when changes are needed—orange indicates fresh media, yellow indicates acidic conditions requiring immediate media change, and pink suggests pH is too basic.
Q3: What does 90% confluency mean and why does it matter for cell passaging?
Confluency refers to the percentage of culture container surface covered by cells. At 90% confluency, adherent cells cover most of the container bottom and must be passaged to prevent overgrowth and maintain cell health. Monitoring confluency ensures cells are split at the optimal time for expansion and prevents toxic metabolite accumulation.
Q4: What are the essential components of complete cell culture media?
Complete media requires serum such as heat-treated Fetal Bovine Serum for growth factors, antibiotics like penicillin and streptomycin to prevent contamination, and additional growth factors such as fibroblast growth factor to prolong expansion. Each cell line requires a specific growth supplement cocktail tailored to its needs. Store complete media at 4°C when not in use.
Q5: How is trypsin used to remove adherent cells from culture plates?
Trypsin is a digestive enzyme that cleaves proteins binding cells to plastic surfaces. Cells are first washed with calcium- and magnesium-free phosphate buffered saline, then trypsin is added and incubated at 37°C for approximately 5 minutes. Careful timing is critical to avoid damaging cell surface proteins. Fresh media is added to stop proteolysis before transferring cells to a conical tube for counting using hemacytometer methods and applications.
Q6: What are alternative methods for removing cells that are too adherent for standard trypsin treatment?
For cells sensitive to enzymatic digestion or extremely adherent to plates, a cell scraper can gently remove cells from the culture container bottom. Alternatively, a serological pipette can be used in a firm scraping motion while rinsing with media. Mechanical dissociation requires care, as delicate cells can be damaged by these methods.
Q7: How can cell cultures be expanded more rapidly than single-layer flasks allow?
Multilayer flasks expand cell cultures 3-5 fold compared to single-layer flasks, enabling faster and more reproducible scale-up of cell expansion. These specialized culture vessels provide increased surface area for cell growth, making them ideal for generating large numbers of cells efficiently while maintaining appropriate culture conditions.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:40
Basic Principles of Subculturing Cells
2:59
Common Equipment/Reagents for Passaging Cells
6:36
How to Passage Cells
8:03
Applications
9:36
Summary
Videos from this collection: