Agroinfiltration كفاءة من النباتات للتعبير عابر الرفيع المستوى من البروتينات المؤتلف
يوليو 23, 2013
النباتات توفر نظام رواية لإنتاج البروتينات الدوائية على نطاق تجاري وهذا هو أكثر استيعابا، فعالة من حيث التكلفة وآمنة من نماذج التعبير الحالي. في هذه الدراسة، ونحن التقرير مقاربة بسيطة ومريحة، وحتى الآن قابلة لإدخال الجينات التي تحتوي على الهدف الأجرعية المورمة في النباتات على البروتين التعبير عابر.
يستخدم هذا النظام التجريبي التسلل الزراعي لتوصيل التركيبات الجينية بشكل فعال إلى الأوراق لإنتاج مستويات عالية من البروتين المؤتلف. أولا ، قم بزراعة نباتات الهامانا النهائية في بيئة خاضعة للرقابة لمدة ستة أسابيع ، قبل ثلاثة أيام من التسلل. تحضير مزارع البكتيريا الزراعية التي تحتوي على الجين المستهدف المراد التعبير عنه في النباتات يوم التسلل.
أدخل مزارع البكتيريا الزراعية في الأنسجة النباتية إما عن طريق الحقنة أو التسلل بالفراغ. تظهر النتائج مثل شدة التألق الأخضر ل GFP في أوراق التبغ تحت الأشعة فوق البنفسجية تعبيرا قويا عن البروتينات المؤتلفة في النباتات التي تنافس تلك الموجودة في أنظمة التعبير الحالية للبكتيريا والحشرات في الثدييات. يعد التسلل الزراعي طريقة فعالة لإدخال الجينات المتحولة في الخلايا النباتية ، مما يؤدي إلى تعبير عالي المستوى عن البروتينات المؤتلفة.
يمكن استخدامه لمجموعة واسعة من الأنواع النباتية. الأهم من ذلك ، يمكن توسيع نطاقه للإنتاج التجاري للبروتينات الصيدلانية. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على حركية GFP والتعبير عنه ويمكن تطبيقها على بروتينات أخرى مثل لقاحات الوحدات الفرعية ، والأجسام المضادة أحادية النسيلة المؤتلفة ، ويمكن استخدامها في علاجات السرطان والأمراض المعدية.
تتطلب التجربة الناجحة الظروف المثلى لكل من زراعة البكتيريا والمواد النباتية. عملية التسلل هذه أسهل في التكرار بعد العرض المرئي. ابدأ بوضع ما يصل إلى 60 حبة من الخث في صينية التكاثر.
أضف أربعة لترات من ماء الصنبور واترك حبيبات البازلاء تمتص الماء لمدة ساعتين. الآن ، أضف بذرتين وبذور هامانا إلى كل حبيبات من الخث وقم بتغطية الصينية بقبة بلاستيكية شفافة للإنبات. ضع البذور في بيئة رطوبة 25 درجة مئوية و 84٪.
بعد أسبوعين من البذر ، قم بإزالة القبة ونقل النباتات إلى صينية جديدة. ثم أضف لترين من 1.48 جرام لكل لتر. سماد جاك استمر في زراعة النباتات في درجة حرارة 25 درجة مئوية.
50٪ رطوبة البيئة كل يومين. قم بتوريد لترين من سماد جاك لكل صينية. في الأسبوع الرابع ، انقل النباتات التي تحتوي على حبيبات الخث إلى صينية جديدة تستضيف ستة نباتات لمزيد من النمو حتى عمر ستة أسابيع.
اختر أربعة أو ستة أسابيع ونباتات حمامة ذات خمس إلى ست أوراق لكل منها ثلاث أوراق للتسلل الكامل مع السلالات البكتيرية الزراعية التي تؤوي الجينات ذات الأهمية. ورقة واحدة للتحكم السلبي وورقة واحدة للتسلل الموضعي. قم بإنشاء شق صغير بإبرة في البشرة على الجانب الخلفي من الورقة ، مع التأكد من عدم اختراق الورقة من كلا الجانبين.
أمسك بقوة بالجانب الأمامي من الورقة الأولى أثناء الضغط المضاد اللطيف على الرقبة. بإبهام يد واحدة. حقن مخاليط agrobacterium في مخزن مؤقت للتسلل في الرقبة باستخدام حقنة وإبرة.
استمر في حقن مخاليط البكتيريا الزراعية في الشق حتى تتوقف الدائرة الخضراء الداكنة عن التمدد. ثم قم بإنشاء شق آخر وكرر الحقن حتى يتم اختراق الورقة بأكملها وتتحول الورقة بأكملها إلى اللون الأخضر الداكن. تتسلل عمليات التسلل الكاملة للأوراق الثلاث الأولى والورقة الأخيرة للورقة الرابعة من كل نبات بمجموعات ناقلات إما من جميع نواقل الجوزاء الفيروسية الأربعة أو نواقل ماغكون الثلاثة.
أيضا ، قم بعمل شق واحد لكل مجموعة من سلالات البكتيريا الزراعية وتسلل إلى كل شق بمجموعة واحدة. بعد التسلل ، انقل النباتات مرة أخرى إلى غرفة النمو وراقب تعبير البروتين بين يومين و 15 يوما. بعد التسلل ، ضع حوضا في فراغ مجفف وانقله في ثلاثة لترات من مخزن التسلل الذي يحتوي على سلالات البكتيريا الزراعية.
ثم قم بتوصيل المجفف بمضخة تفريغ الحجاب الحاجز ذات العلامة التجارية الفراغية. الآن ضع نباتا رأسا على عقب على صفيحة المجففة وقم بخفض اللوحة بالنبات حتى يتم غمر نظام الأوراق والساق بالكامل في مخزن التسلل مع وضع اللوحة أعلى الحوض. بعد ذلك ضع حلقة O المجففة على طول الحافة.
بعد وضع الغطاء المجفف على الغرفة ، قم بتشغيل مضخة التفريغ وابدأ التوقيت عندما يصل الفراغ إلى 100 ملليبار. بعد إيقاف تشغيل مضخة التفريغ ، افتح ببطء صمام التحرير على المجفف بعد دقيقة واحدة عند 100 مللي بار للسماح بدخول البكتيريا الزراعية إلى الفراغات الخلالية للأنسجة النباتية المغمورة. كرر هذا التسلل.
الخطوات الأولى لضمان التسلل الجيد. ثم قم بإزالة النبات من المجفف وأعده إلى وضعه الرأسي. انقل النباتات مرة أخرى إلى غرفة النمو وراقب تعبير البروتين بين يومين و 15 يوما بعد التسلل.
لإثبات فعالية المحقنة ، تسلل البكتيريا الزراعية إلى الأنسجة النباتية ، اختبرنا التعبير عن اثنين من البروتينات الفلورية ، GFP و Ds red بواسطة ناقلين فيروسيين نباتيين مختلفين مفككين ، الجوزاء ، الفيروسي والماغكون للنهاية. أوراق الهامانا التي تم اختراقها بالكامل بالبكتيريا الزراعية التي تحتوي على ناقلات فيروسية من الجوزاء. لوحظ تعبير GFP على مساحة الورقة بأكملها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، بدءا من 2D PI ووصل إلى ذروة التراكم عند أربعة DPI.
في المقابل ، أظهرت الأوراق التي تم اختراقها بناقل magcon الذي يحتوي على تركيبات البكتيريا الزراعية مضان GFP فقط بعد خمسة DPI ووصلت إلى الحد الأقصى لتراكمها عند سبعة DPI. لم يلاحظ أي مضان أخضر من الأوراق التي تم اختراقها بمخاليط البكتيريا الزراعية ذات التحكم السلبي من EP واحد 10 بالإضافة إلى P 19 ، مما يشير إلى أن التألق كان خاصا بجين GFP ولم يكن نتيجة لمضان الخلفية من الأوراق. في ذروة تراكمه ، يكون مضان ناقل magcon المعبر عنه في GFP أكثر كثافة من مضان ناقل الجوزاء الفيروسي.
لم يلاحظ أي نخر كبير على الأوراق التي تم اختراقها بتركيبات GFP عندما تم التعبير عن كلا البروتينين الفلوريين على نفس الورقة عبر ناقلات فيروسية من الجوزاء مع تسلل بقعة الحقنة ، تم اكتشافهما بلونهما الفلوري المتوقع في المكان الذي تم اختراقهما فيه. ومن المثير للاهتمام أن التسلل المشترك ل GFP و DS RED أدى إلى تألق مصفر. كما تم فحص التسلل الفراغي لتطوير طريقة تسلل زراعي قابلة للتطوير يمكن استخدامها لإنتاج البروتينات المؤتلفة على نطاق واسع بواسطة أنظمة التعبيرات العابرة للنبات.
كما هو متوقع ، لوحظ تألق GFP لجميع أوراق النبات المتسلل مقارنة بتسلل المحاقن. إنه أكثر قوة ويمكنه تحقيق تسلل كل نبات بإطار زمني أقصر بكثير. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في 48 ساعة.
في معظم الأحيان يكون الأمر مخصصا للثقافة البكتيرية الزراعية حيث أن وقت التسلل الفعلي لا يستغرق سوى بضع دقائق للحصول على كفاءة التسلل الزراعي المثلى والتعبير عن البروتين المستهدف. اتبع البروتوكول. تذكر التحكم في المعلمات الحرجة ، بما في ذلك ظروف نمو النبات ، وتركيز البكتيريا الزراعية ، وضغط الفراغ ، والمدة في مجال التكنولوجيا الحيوية النباتية.
يمكن استخدام هذا النهج التجريبي لاستكشاف التطور والإنتاج الحيوي للبروتينات الصيدلانية الجديدة في مجموعة واسعة من الأنواع النباتية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية استخدام التسلل الزراعي لتوصيل تركيبات الجينات المستهدفة إلى النبات والسماح لأنظمة التعبير العابر للنبات بإنتاج بروتين مؤتلف ، ينافس مزارع الخلايا البكتيرية والحشرية للثدييات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة قابلة للتطوير لإنتاج البروتينات الصيدلانية في النباتات باستخدام Agrobacterium tumefaciens. يعتمد النهج على الترشيح الزراعي لتوصيل بنى الجينات إلى أنسجة النبات، مما يمكّن من مستويات عالية من تعبير البروتين المؤتلف.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- التكنولوجيا الحيوية النباتية
- أنظمة تعبير البروتين
- الإنتاج الصيدلاني
الخلفية
- تعاني أنظمة تعبير البروتين الحالية من قيود في القابلية للتطوير والتكلفة.
- توفر النباتات بديلاً آمنًا لإنتاج البروتينات الصيدلانية.
- Agrobacterium tumefaciens هو أداة راسخة لنقل الجينات في النباتات.
- تستطيع أنظمة التعبير العابر أن تنتج مستويات عالية من البروتين بسرعة.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة بسيطة وقابلة للتطوير لتعبير البروتين في النباتات.
- إظهار فعالية الترشيح الزراعي لتوصيل بنى الجينات.
- مقارنة التعبير القائم على النباتات مع الأنظمة التقليدية.
الطرق المستخدمة
- تقنية الترشيح الزراعي لتوصيل الجينات.
- استخدام نباتات end hamana المزروعة في بيئة خاضعة للرقابة.
- إعداد ثقافات Agrobacterium التي تحتوي على الجينات المستهدفة.
- تقييم تعبير البروتين من خلال التصوير الفلوري.
النتائج الرئيسية
- تم التعبير بنجاح عن مستويات عالية من البروتين المؤتلف في أنسجة النباتات.
- أظهر التصوير الفلوري تعبيرًا قويًا لـ GFP في أوراق التبغ.
- أظهرت الطريقة مزايا على الأنظمة الثديية والبكتيرية.
- ثبت أن الترشيح الزراعي طريقة فعالة لإدخال الجينات.
الاستنتاجات
- تؤكد الدراسة جدوى استخدام النباتات لإنتاج البروتين على نطاق واسع.
- يعتبر الترشيح الزراعي تقنية واعدة للتعبير الجيني العابر.
- يمكن لهذا النهج أن يعزز كفاءة إنتاج البروتين الصيدلاني.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Plant-based transient expression systems address scalability and cost limitations of mammalian cell culture for recombinant protein production. Agroinfiltration enables rapid, high-level expression of therapeutic proteins such as subunit vaccines and monoclonal antibodies. This approach supports early-stage target validation and lead identification by providing a scalable, low-cost platform for protein expression and functional screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of therapeutic targets through high-level recombinant protein expression in planta.
- Operational Value: Provides a rapid, scalable system for protein production to support hypothesis testing and pathway analysis.
- Predictive Value: Facilitates comparative assessment of protein variants, vectors, or expression kinetics for lead selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts (e.g., GFP, DsRed) for assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Supports multi-target screening on single leaves via syringe infiltration for vector or construct comparison.
- Scalability: Vacuum infiltration enables scale-up for larger leaf areas and species not amenable to syringe methods.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Produces recombinant proteins in disease-relevant plant systems for preclinical evaluation.
- Mechanistic De-risking: Allows co-expression of multiple proteins (e.g., GFP and DsRed) to study interactions or fusion constructs.
- Continuity: Bridges discovery to preclinical work by providing scalable protein supply for functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
The agroinfiltration method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical protein supply, enabling rapid iteration and comparative analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via transient expression of gene constructs to assess protein function and localization.
- Screening: Enables reproducible, quantitative protein production for screening campaigns using fluorescence-based readouts.
- Analytics: Fluorescence intensity measurements under UV light provide quantitative data for comparing expression levels across conditions.
- Translational Research: Generates sufficient protein yields for downstream preclinical testing in vaccine or therapeutic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for protein expression across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-level transient expression reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Syringe infiltration offers simplicity and flexibility; vacuum infiltration enables robustness and scalability.
- Strategic Value: Low-cost, scalable production supports better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on protein yield, expression kinetics, and functional output.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant growth, Agrobacterium handling, and infiltration techniques.
- Needs controlled growth environments, infiltration buffers, and vacuum or syringe equipment.
- Standardization across teams requires consistent plant age, bacterial concentration, and infiltration parameters.
- Adaptation across species (e.g., tobacco, lettuce, Arabidopsis) may require optimization of vacuum pressure and incubation time.
- Practical limitations include species-specific infiltration efficiency and the need for fluorescence detection equipment.
