Agroinfiltration كفاءة من النباتات للتعبير عابر الرفيع المستوى من البروتينات المؤتلف

يستخدم هذا النظام التجريبي الترشيح الزراعي (agro infiltration) لإيصال البنى الجينية بفعالية إلى الأوراق لإنتاج مستويات عالية من البروتين المؤتلف. أولاً، يتم تنمية نباتات end hamana في بيئة محكومة لمدة ستة أسابيع، وذلك قبل ثلاثة أيام من عملية الترشيح. يتم تحضير مستنبتات agrobacterium التي تحتوي على الجين المستهدف المراد التعبير عنه في النباتات في يوم الترشيح.

أدخل مزارع Agrobacterium إلى أنسجة النبات إما باستخدام المحقنة أو عن طريق الترشيح الفراغي. وتظهر النتائج، مثل كثافة الفلورة الخضراء لبروتين GFP في أوراق التبغ تحت الأشعة فوق البنفسجية UV، تعبيراً قوياً للبروتينات المؤشبة في النباتات يضاهي أنظمة التعبير الحالية القائمة على الثدييات والبكتيريا والحشرات. ويعد الترشيح بواسطة Agrobacterium طريقة فعالة لإدخال الجينات المنقولة إلى الخلايا النباتية، مما يؤدي إلى مستوى عالٍ من التعبير عن البروتينات المؤشبة.

يمكن استخدام هذه الطريقة مع نطاق واسع من الأنواع النباتية. والأهم من ذلك، أنه يمكن توسيع نطاقها للإنتاج التجاري للبروتينات الصيدلانية. لذا، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول حركية وتعبير GFP، كما يمكن تطبيقها على بروتينات أخرى مثل اللقاحات الفرعية، والأجسام المضادة أحادية النسيلة المؤتلفة، ويمكن استخدامها في علاجات السرطان والأمراض المعدية.

تتطلب التجربة الناجحة ظروفاً مثالية لكل من المزرعة البكتيرية والمواد النباتية. وتكون عملية الترشيح هذه أسهل في التكرار بعد العرض المرئي. ابدأ بوضع ما يصل إلى 60 قرصاً من البيتموس في صينية إكثار.

أضف أربعة لترات من ماء الصنبور واترك حبيبات البيتموس تمتص الماء لمدة ساعتين. الآن، أضف بذرتين من hamana إلى كل حبيبة بيتموس وغطِ الصينية بقبة بلاستيكية شفافة لعملية الإنبات. ضع البذور في بيئة تبلغ درجة حرارتها 25 degree Celsius ورطوبتها 84%humidity.

بعد أسبوعين من الزراعة، قم بإزالة الغطاء ونقل النباتات إلى صينية جديدة. ثم أضف لترين من سماد Jack's بتركيز 1.48 grams per liter. استمر في تنمية النباتات في درجة حرارة 25 degrees Celsius.

بيئة ذات رطوبة 50% كل يومين. يتم تزويد كل صينية بلترين من سماد Jack's. وفي الأسبوع الرابع، تُنقل النباتات مع كريات البيتموس إلى صينية جديدة تتسع لستة نباتات لمواصلة النمو حتى تبلغ ستة أسابيع من العمر.

اختر أربعة نباتات hamama بعمر ستة أسابيع، بحيث تحتوي كل نبتة على خمس إلى ست أوراق؛ استخدم ثلاث أوراق للترشيح الكامل باستخدام سلالات agro bacterial التي تحمل الجينات المستهدفة، وورقة واحدة كعنصر تحكم سلبي، وورقة واحدة للترشيح الموضعي. اصنع شقاً صغيراً باستخدام إبرة في البشرة على الجانب الخلفي للورقة، مع الحرص على عدم ثقب الورقة من كلا الجانبين.

أمسك الجانب الأمامي للورقة الأولى بإحكام مع تطبيق ضغط عكسي خفيف على العنق، باستخدام إبهام إحدى اليدين. ثم احقن مخاليط agrobacterium في محلول الترشيح المنظم (infiltration buffer) في العنق باستخدام حقنة وإبرة.

استمر في حقن مخاليط agrobacterium في الشق حتى تتوقف الدائرة الخضراء الداكنة عن التوسع. بعد ذلك، قم بعمل شق آخر وكرر عمليات الحقن حتى يتم ترشيح الورقة بأكملها وتتحول الورقة كاملةً إلى اللون الأخضر الداكن. أتمم عمليات الترشيح لأول ثلاث أوراق، وبالنسبة للورقة الرابعة من كل نبات، قم بالترشيح باستخدام تركيبات ناقلة تتكون إما من جميع ناقلات Gemini الفيروسية الأربعة أو ثلاثة من ناقلات magcon.

كذلك، قم بعمل شق واحد لكل تركيبة من سلالات agrobacterium وقم بتسريب كل شق بتركيبة واحدة. بعد عملية التسريب، انقل النباتات مجددًا إلى غرفة النمو وراقب تعبير البروتين في الفترة ما بين يومين و15 يومًا. بعد التسريب، ضع حوضًا في مجفف تفريغ وانقل إليه ثلاثة لترات من محلول التسريب المنظم الذي يحتوي على سلالات agrobacterium.

ثم قم بتوصيل المجفف بمضخة فراغ غشائية من علامة تجارية معروفة. والآن، ضع النبات مقلوباً على لوحة المجفف وقم بخفض اللوحة مع النبات حتى ينغمر نظام الورقة والساق بالكامل في محلول التسلل المنظم، مع استقرار اللوحة على الجزء العلوي من الحوض. بعد ذلك، ضع الحلقة الدائرية للمجفف على طول الحافة.

بعد وضع غطاء المجفف على الحجرة، قم بتشغيل مضخة التفريغ وابدأ حساب الوقت عندما يصل ضغط التفريغ إلى 100 millibar. بعد إيقاف تشغيل مضخة التفريغ، افتح صمام التنفيس الموجود في المجفف ببطء بعد مرور دقيقة واحدة عند ضغط 100 millibar للسماح بدخول agro bacteria إلى المسافات البينية لأنسجة النبات المغمورة. كرر عملية التسلل هذه.

الخطوة الأولى لضمان حدوث عملية الترشيح بشكل جيد. ثم قم بإزالة النبات من المادة المجففة وأعده إلى وضعه القائم. انقل النباتات مرة أخرى إلى غرفة النمو وراقب تعبير البروتين في الفترة ما بين يومين و15 يوماً بعد عملية الترشيح.

لإثبات فعالية تسلل الأجروبكتيريوم (agrobacterium) إلى أنسجة النبات باستخدام الحقنة، قمنا باختبار تعبير بروتينين فلوريين، GFP و Ds red، بواسطة ناقلين فيروسيين نباتيين مفككين ومختلفين، وهما Gemini viral و magcon for end. تم تسليل أوراق نبات الهامانا (Hamana) بالكامل باستخدام بكتيريا الأجروبكتيريوم التي تحتوي على ناقلات Gemini viral. وقد لوحظ تعبير GFP على كامل مساحة الورقة تحت الأشعة فوق البنفسجية، بدءًا من اليوم الثاني بعد التلقيح (2D PI)، ووصل التراكم إلى ذروته في اليوم الرابع بعد التلقيح (four DPI).

في المقابل، أظهرت الأوراق التي تم حقنها بناقل magcon الذي يحتوي على تركيبات agrobacterium فلورة GFP فقط بعد خمسة DPI، ووصل تراكمها إلى الحد الأقصى عند سبعة DPI. ولم تُلاحظ أي فلورة خضراء في الأوراق التي حُقنت بخليط agrobacterium للضابط السلبي المكون من EP one 10 plus P 19، مما يشير إلى أن الفلورة كانت خاصة بجين GFP ولم تكن نتيجة لفلورة خلفية من الأوراق. وعند ذروة التراكم، كانت فلورة GFP التي تم التعبير عنها بواسطة ناقل magcon أكثر كثافة من تلك الخاصة بناقل Gemini الفيروسي.

لم يُلاحظ أي نخر كبير في الأوراق التي تم حقنها بتركيبات GFP؛ فعندما تم التعبير عن كلا البروتينين الفلوريين على نفس الورقة عبر نواقل فيروس Gemini باستخدام طريقة الحقن موضعيًا بالسرنجة، تم اكتشافهما بلونهما الفلوري المتوقع في بقعة الحقن. ومن المثير للاهتمام أن الحقن المشترك لـ GFP و DS RED أدى إلى ظهور فلورة مائلة للصفرة. كما تم فحص طريقة الحقن بالتفريغ لتطوير منهجية حقن زراعية قابلة للتوسع يمكن استخدامها لإنتاج البروتينات المؤتلفة على نطاق واسع من خلال أنظمة التعبير العابر في النباتات.

كما هو متوقع، لوحظ وميض GFP في جميع أوراق النبات الذي تم إيصاله بالترشيح مقارنة بالترشيح باستخدام السرنجة. وتُعد هذه الطريقة أكثر قوة ويمكنها تحقيق ترشيح كل نبات في إطار زمني أقصر بكثير. وبمجرد إتقانها، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون 48 ساعة.

في معظم الأحيان، تُستخدم هذه العملية لزراعة البكتيريا الزراعية (Agrobacterium)، حيث أن وقت التسريب الفعلي يستغرق بضع دقائق فقط. ولتحقيق الكفاءة المثلى في التسريب البكتيري والتعبير البروتيني المستهدف، يجب اتباع البروتوكول بدقة. تذكر التحكم في المعايير الحرجة، بما في ذلك ظروف نمو النبات، وتركيز البكتيريا الزراعية، وضغط التفريغ، والمدة الزمنية في مجال التكنولوجيا الحيوية النباتية.

يمكن استخدام هذا النهج التجريبي لاستكشاف تطوير والإنتاج الحيوي لبروتينات صيدلانية جديدة في مجموعة واسعة من الأنواع النباتية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك تصور جيد حول كيفية استخدام الترشيح الزراعي (agro infiltration) لإدخال تركيبات الجينات المستهدفة إلى النبات، وللسماح لأنظمة التعبير العابر في النباتات بإنتاج بروتين مأشوب يضاهي ما تنتجه مزارع الخلايا الثديية والبكتيرية والحشرية.