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Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Arizona State University 

Pyruvate carboxylase (PYC) is an ecologically, medically, and industrially important enzyme. It is widespread in all three domains of life, the archaea, bacteria, and eukarya. PYC catalyzes ATP-dependent carboxylation of pyruvate to oxaloacetate. Detailed structure-function studies of this enzyme have been hampered due to the unavailability of a facile recombinant overexpression system. Except for the alpha4 enzyme from a thermophilic Bacillus species, Escherichia coli has been unsuitable for overexpression of PYCs. We show that a Pseudomonas aeruginosa strain carrying the T7 polymerase gene can serve as a host for the overexpression of Mycobacterium smegmatis alpha4 PYC and Pseudomonas aeruginosa alpha4beta4 PYC under the control of the T7 promoter from a broad-host-range conjugative plasmid. Overexpression occurred both in aerobic (LB medium) and nitrate-respiring anaerobic (LB medium plus glucose and nitrate) cultures. The latter system presented a simpler option because it involved room temperature cultures in stationary screw-cap bottles. We also developed a P. aeruginosa Deltapyc strain that allowed the expression of recombinant PYCs in the absence of the native enzyme. Since P. aeruginosa can be transformed genetically and lysed for cell extract preparation rather easily, our system will facilitate site-directed mutagenesis, kinetics, X-ray crystallographic, and nuclear magnetic resonance-based structure-function analysis of PYCs. During this work we also determined that, contrary to a previous report (C. K. Stover et al., Nature 406:959-964, 2000), the open reading frame (ORF) PA1400 does not encode a PYC in P. aeruginosa. The alpha4beta4 PYC of this organism was encoded by the ORFs PA5436 and PA5435.

Identification of pyruvate carboxylase genes in Pseudomonas aeruginosa PAO1 and development of a P. aeruginosa-based overexpression system for alpha4- and alpha4beta4-type pyruvate carboxylases.

Pyruvate carboxylase (PYC) est un point de vue &eacute;cologique, m&eacute;dicalement et industriellement importante enzyme. Il est r&eacute;pandu dans toutes les trois domaines de la vie, les archaea, bact&eacute;ries et eukarya. PYC catalyse la carboxylation ATP-d&eacute;pendante du pyruvate &agrave; l&#39;oxaloac&eacute;tate. Des &eacute;tudes d&eacute;taill&eacute;es structure-fonction de cette enzyme ont &eacute;t&eacute; entrav&eacute;s en raison de l&#39;indisponibilit&eacute; d&#39;un syst&egrave;me facile de surexpression recombinante. &Agrave; l&#39;exception de l&#39;enzyme alpha4 d&#39;une esp&egrave;ce thermophile de Bacillus, Escherichia coli a &eacute;t&eacute; impropre &agrave; la surexpression de la PYCs. Nous montrons qu&#39;une souche de Pseudomonas aeruginosa porteuses du g&egrave;ne de polym&eacute;rase T7 peut servir d&#39;h&ocirc;tes pour la surexpression de Mycobacterium smegmatis alpha4 PYC et Pseudomonas aeruginosa alpha4beta4 PYC sous le contr&ocirc;le du promoteur T7 d&#39;un plasmide conjugatif de large-gamme d&#39;h&ocirc;tes. Surexpression s&#39;est produite en a&eacute;robie (milieu LB) et nitrate-bact&eacute;ries ana&eacute;robies (milieu LB plus glucose et nitrate) cultures. Ce dernier syst&egrave;me pr&eacute;sente une option plus simple parce qu&#39;il portait des cultures de la temp&eacute;rature ambiante dans des bouteilles &agrave; bouchon viss&eacute;-stationnaire. Nous avons &eacute;galement &eacute;labor&eacute; une souche Deltapyc qui a permis l&#39;expression de recombinaison PYCs en l&#39;absence de l&#39;enzyme de P. aeruginosa. &Eacute;tant donn&eacute; que P. aeruginosa peut &ecirc;tre transform&eacute; g&eacute;n&eacute;tiquement et lys&eacute;e pour pr&eacute;paration d&#39;extrait de cellules assez facilement, notre syst&egrave;me facilitera la mutagen&egrave;se dirig&eacute;e, cin&eacute;tique, analyse cristallographique et ax&eacute;e sur la r&eacute;sonance magn&eacute;tique nucl&eacute;aire structure-fonction des rayons x de PYCs. Au cours de ce travail nous avons aussi d&eacute;termin&eacute; que, contrairement &agrave; un pr&eacute;c&eacute;dent rapport (C. K. Stover et al., Nature 406:959-964, 2000), le cadre de lecture ouvert (ORF) PA1400 n&#39;encode pas un PYC chez P. aeruginosa. La PYC alpha4beta4 de cet organisme a &eacute;t&eacute; cod&eacute;e par l&#39;ORF PA5436 et PA5435.

Identification des g&egrave;nes de la carboxylase de pyruvate dans Pseudomonas aeruginosa PAO1 et le d&eacute;veloppement d&#39;un syst&egrave;me P. aeruginosa-bas&eacute; la surexpression des carboxylases pyruvate type alpha4 et alpha4beta4.

Carbossilasi del piruvato (PYC) sono un ecologicamente, medico e su scala industriale importante enzima. &Egrave; diffusa in tutti i tre domini della vita, il archaea, batteri ed eucarioti. PYC catalizza la carbossilazione di trifosfato di Adenosina-dipendente del piruvato ad ossalacetato. Studi dettagliati di struttura-funzione di questo enzima sono stati ostacolati a causa dell&#39;indisponibilit&agrave; di un sistema di facile sovraespressione ricombinante. Fatta eccezione per l&#39;enzima alpha4 da una specie di bacillo termofila, Escherichia coli &egrave; stato inadatto per la sovraespressione di PYCs. Ci mostrano che un ceppo di Pseudomonas aeruginosa che trasportano il gene della polimerasi T7 pu&ograve; servire come un host per la sovraespressione di Mycobacterium smegmatis alpha4 PYC e Pseudomonas aeruginosa PYC alpha4beta4 sotto il controllo del promotore T7 da un plasmide coniugativi broad-host-gamma. Sovraespressione si &egrave; verificato sia in aerobico (LB medium) e nitrato-respiring anaerobici (LB medium plus glucosio e nitrato) culture. Il sistema di quest&#39;ultimo ha presentato un&#39;opzione pi&ugrave; semplice perch&eacute; ha coinvolto temperatura ambiente culture in bottiglie tappo a vite stazionari. Abbiamo anche sviluppato un ceppo di Deltapyc che ha permesso l&#39;espressione della ricombinante PYCs in assenza dell&#39;enzima nativo di p. aeruginosa. Dal momento che p. aeruginosa pu&ograve; essere trasformato geneticamente e lisato per la preparazione di Estratto di cellule piuttosto facilmente, il nostro sistema faciliter&agrave; mutagenesi luogo-diretta, cinetica, analisi cristallografica e basata sulla risonanza magnetica nucleare struttura-funzione dei raggi x di PYCs. Durante questo lavoro abbiamo anche stabilito che, contrariamente a una relazione precedente (C. K. Stover et al., Nature 406:959-964, 2000), l&#39;open reading frame (ORF) PA1400 non codificare un PYC in p. aeruginosa. La PYC alpha4beta4 di questo organismo &egrave; stato codificato dall&#39;ORF PA5436 e PA5435.

Identificazione di Piruvato carbossilasi geni in Pseudomonas aeruginosa PAO1 e lo sviluppo di un sistema di p. aeruginosa-based sovraespressione di carbossilasi del piruvato alpha4 - e alpha4beta4-tipo.

Usine de vecteurs viraux ont un grand potentiel dans la production rapide de prot&eacute;ines pharmaceutiques importantes. Cependant, la production de prot&eacute;ines h&eacute;t&eacute;ro-oligom&egrave;res qui n&eacute;cessitent l&#39;expression &agrave; haut rendement et l&#39;assemblage de deux ou de plusieurs sous-unit&eacute;s prot&eacute;iques souvent souffre de probl&egrave;mes en raison de la nature &laquo; oppos&eacute;e &raquo; de vecteurs viraux provenant du m&ecirc;me virus. Pr&eacute;c&eacute;demment, nous avons rapport&eacute; qu&#39;un virus nain jaune de haricot (BeYDV)-syst&egrave;me de r&eacute;plicon ADN d&eacute;riv&eacute;e, trois composantes permet la production rapide de prot&eacute;ines recombinantes unique chez les plantes (Huang et al., 2009. Biotechnol Bioeng 103:706-714). Dans cet article, nous rapportons plus loin le d&eacute;veloppement de ce syst&egrave;me d&#39;expression pour son application &agrave; haut rendement de production des complexes de prot&eacute;ine oligom&eacute;rique incluant des anticorps monoclonaux (ACM) chez les plantes. Nous avons montr&eacute; que le syst&egrave;me de r&eacute;plicon BeYDV permet une r&eacute;plication efficace simultan&eacute;e des deux r&eacute;plicons ADN et ainsi, accumulation de haut niveau des deux prot&eacute;ines recombinantes dans la m&ecirc;me cellule de la plante. Nous avons aussi d&eacute;montr&eacute; qu&#39;un vecteur unique qui contient plusieurs cassettes r&eacute;plicon &eacute;tait aussi efficace que le syst&egrave;me de trois composantes dans l&#39;expression de deux prot&eacute;ines distinctes au volant. Utilisez le syst&egrave;me non concurrentes, les trois vecteurs ou le vecteur unique multi-replicon, nous avons produit les deux sous-unit&eacute;s des cha&icirc;nes lourdes et l&eacute;g&egrave;res d&#39;une protectrice IgG mAb 6 8 contre le virus Ebola GP1 (Wilson et al., 2000. Science 287 : 1664-1666) &agrave; 0,5 mg de mAb par gramme de poids frais feuille dans post-infiltration de 4 jours de Nicotiana benthamiana quitte. De plus, nous avons d&eacute;montr&eacute; que grandeur nature t&eacute;tram&eacute;rique IgG complexe contenant deux lourdes et deux cha&icirc;nes l&eacute;g&egrave;res a &eacute;t&eacute; assembl&eacute; efficacement et facilement purifi&eacute; et conserv&eacute; sa fonctionnalit&eacute; dans la liaison sp&eacute;cifique inactiv&eacute; contre le virus Ebola. Ainsi, notre syst&egrave;me single-vecteur r&eacute;plicon offre une capacit&eacute; de production &agrave; haut rendement pour les prot&eacute;ines h&eacute;t&eacute;ro-oligom&egrave;res, mais &eacute;limine la t&acirc;che difficile d&#39;identifier les virus non concurrentes et la n&eacute;cessit&eacute; d&#39;une co-infection de plusieurs modules d&#39;expression. Le vecteur multi-replicon repr&eacute;sente une avanc&eacute;e significative dans la technologie d&#39;expression transitoire pour la production d&#39;anticorps chez les plantes.

Haut niveau production rapide d&#39;anticorps monoclonaux pleine grandeur dans les plantes par un syst&egrave;me de r&eacute;plicon ADN vecteur unique.

Plant viral vectors have great potential in rapid production of important pharmaceutical proteins. However, high-yield production of hetero-oligomeric proteins that require the expression and assembly of two or more protein subunits often suffers problems due to the "competing" nature of viral vectors derived from the same virus. Previously we reported that a bean yellow dwarf virus (BeYDV)-derived, three-component DNA replicon system allows rapid production of single recombinant proteins in plants (Huang et al., 2009. Biotechnol Bioeng 103: 706-714). In this article, we report further development of this expression system for its application in high-yield production of oligomeric protein complexes including monoclonal antibodies (mAbs) in plants. We showed that the BeYDV replicon system permits simultaneous efficient replication of two DNA replicons and thus, high-level accumulation of two recombinant proteins in the same plant cell. We also demonstrated that a single vector that contains multiple replicon cassettes was as efficient as the three-component system in driving the expression of two distinct proteins. Using either the non-competing, three-vector system or the multi-replicon single vector, we produced both the heavy and light chain subunits of a protective IgG mAb 6D8 against Ebola virus GP1 (Wilson et al., 2000. Science 287: 1664-1666) at 0.5 mg of mAb per gram leaf fresh weight within 4 days post-infiltration of Nicotiana benthamiana leaves. We further demonstrated that full-size tetrameric IgG complex containing two heavy and two light chains was efficiently assembled and readily purified, and retained its functionality in specific binding to inactivated Ebola virus. Thus, our single-vector replicon system provides high-yield production capacity for hetero-oligomeric proteins, yet eliminates the difficult task of identifying non-competing virus and the need for co-infection of multiple expression modules. The multi-replicon vector represents a significant advance in transient expression technology for antibody production in plants.

High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system.

Pianta di vettori virali hanno un grande potenziale in rapida produzione di importanti proteine farmaceutiche. Tuttavia, ad alto rendimento la produzione delle proteine etero-oligomerica che richiedono l&#39;espressione e l&#39;assemblaggio di due o pi&ugrave; subunit&agrave; proteiche spesso soffre di problemi a causa della natura &quot;concorrente&quot; di vettori virali derivate dal virus stesso. In precedenza abbiamo segnalato che un virus nano giallo fagiolo (BeYDV)-derivato, tre componenti del DNA replicone sistema consente rapida produzione di proteine ricombinanti singole nelle piante (Huang et al., 2009. Biotechnol Bioeng 103:706-714). In questo articolo riportiamo ulteriormente lo sviluppo di questo sistema di espressione per la sua applicazione in produzione ad alto rendimento dei complessi della proteina oligomerica tra cui anticorpi monoclonali (mAbs) nelle piante. Abbiamo dimostrato che il sistema replicone BeYDV consente la replica efficiente simultanea di due replicons di DNA e, quindi, ad alto livello accumulo di due proteine ricombinanti nella stessa cella di pianta. Abbiamo anche dimostrato che un singolo vettore che contiene pi&ugrave; cassette replicone era pi&ugrave; efficiente il sistema di tre componenti in guida l&#39;espressione delle due proteine distinte. Utilizzando il sistema non concorrenti, tre-vector o il singolo vettore multi-replicon, abbiamo prodotto entrambe le subunit&agrave; di catena pesante e leggera di un protettivo mAb IgG 6 8 contro il virus Ebola GP1 (Wilson et al., 2000. Scienza 287: 1664-1666) a 0,5 mg di mAb per grammo di peso fresco foglia all&#39;interno di post-infiltration 4 giorni di Nicotiana benthamiana lascia. Abbiamo dimostrato ulteriormente full-size tetramerica IgG complessi contenenti due pesanti e due catene leggere &egrave; stato assemblato in modo efficiente e facilmente purificato che mantenne la sua funzionalit&agrave; in particolare associazione di Ebola virus inattivati. Cos&igrave;, il nostro sistema single-vector replicone fornisce capacit&agrave; di produzione ad alto rendimento per le proteine etero-oligomerica, eppure elimina il difficile compito di identificare virus non concorrenti e l&#39;esigenza di co-infezione di pi&ugrave; moduli di espressione. Il vettore multi-replicon rappresenta un progresso significativo nella tecnologia di espressione transitoria per la produzione di anticorpi nelle piante.

Produzione rapida ad alto livello di anticorpi monoclonali full-size in piante da un sistema di replicone DNA single-vettore.

Over the past decade, West Nile virus (WNV) has spread to all 48 of the lower United States as well as to parts of Canada, Mexico, the Caribbean, and South America, with outbreaks of neuroinvasive disease occurring annually. At present, no therapeutic or vaccine is available for human use. Epidemics of WNV and other emerging infectious disease threats demand cost-efficient and scalable production technologies that can rapidly transfer effective therapeutics into the clinical setting. We have previously reported that Hu-E16, a humanized anti-WNV mAb, binds to a highly conserved epitope on the envelope protein, blocks viral fusion, and shows promising postexposure therapeutic activity. Herein, we generated a plant-derived Hu-E16 mAb that can be rapidly scaled up for commercial production. Plant Hu-E16 was expressed at high levels within 8 days of infiltration in Nicotiana benthamiana plants and retained high-affinity binding and potent neutralizing activity in vitro against WNV. A single dose of plant Hu-E16 protected mice against WNV-induced mortality even 4 days after infection at rates that were indistinguishable from mammalian-cell-produced Hu-E16. This study demonstrates the efficacy of a plant-produced mAb against a potentially lethal infection several days after exposure in an animal challenge model and provides a proof of principle for the development of plant-derived mAbs as therapy against emerging infectious diseases.

Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice.

Ces dix derni&egrave;res ann&eacute;es, le virus du Nil occidental (VNO) s&#39;est propag&eacute;e &agrave; tous les 48 inf&eacute;rieur aux &Eacute;tats-Unis ainsi que les r&eacute;gions du Canada, Mexique, les Cara&iuml;bes et l&#39;Am&eacute;rique du Sud &agrave; des flamb&eacute;es de maladie neuro-invasive survenant chaque ann&eacute;e. &Agrave; pr&eacute;sent, non th&eacute;rapeutique ou d&#39;un vaccin est disponible pour l&#39;usage humain. &Eacute;pid&eacute;mies du VNO et autres menaces de maladies infectieuses &eacute;mergentes exigent des technologies de production rentable et &eacute;volutive qui peuvent transf&eacute;rer rapidement des produits th&eacute;rapeutiques efficaces dans le contexte clinique. Nous avons d&eacute;j&agrave; rapport&eacute; que Hu-E16, un ACM humanis&eacute; contre le VNO, se lie &agrave; un &eacute;pitope hautement conserv&eacute; sur la prot&eacute;ine d&#39;enveloppe, bloque la fusion virale et montre une activit&eacute; th&eacute;rapeutique prometteuse post-exposition. Ici, nous avons g&eacute;n&eacute;r&eacute; un mAb Hu-E16 v&eacute;g&eacute;tale qui peut &eacute;voluer rapidement vers le haut pour la production commerciale. Plante Hu-E16 a &eacute;t&eacute; exprim&eacute;e &agrave; des niveaux &eacute;lev&eacute;s dans les 8 jours d&#39;infiltration dans les usines de Nicotiana benthamiana et conserv&eacute; la liaison de haute affinit&eacute; et activit&eacute; neutralisante efficace in vitro contre le VNO. Une dose unique de plantes Hu-E16 prot&eacute;geait les souris contre la mortalit&eacute; induite par le VNO m&ecirc;me 4 jours apr&egrave;s l&#39;infection &agrave; des taux qui &eacute;taient impossibles &agrave; distinguer de mammif&egrave;res-cellule-produit Hu-E16. Cette &eacute;tude d&eacute;montre l&#39;efficacit&eacute; d&#39;une usine-produit mAb contre une infection potentiellement mortelle plusieurs jours apr&egrave;s l&#39;exposition dans un mod&egrave;le animal de d&eacute;fi et fournit une preuve de principe pour le d&eacute;veloppement du mAbs v&eacute;g&eacute;tale comme th&eacute;rapie contre les maladies infectieuses &eacute;mergentes.

Anticorps monoclonal produit chez les plantes efficacement traite l&#39;infection par le virus du Nil occidental chez les souris.

Nell&#39;ultimo decennio, virus del Nilo occidentale (WNV) &egrave; diffusa in tutti i 48 di bassa Stati Uniti anche per quanto riguarda parti del Canada, Messico, i Caraibi e America del sud, con focolai di malattia neuroinvasive che si verificano ogni anno. Al presente, non terapeutico o vaccino &egrave; disponibile per uso umano. Epidemie di WNV e altre minacce di malattie infettive emergenti richiedono tecnologie di produzione efficiente e scalabile che possono trasferire rapidamente efficace terapie in ambito clinico. In precedenza abbiamo segnalato che Hu-E16, un mAb umanizzato anti-WNV, si lega ad un epitopo altamente conservato sulla proteina busta, blocca la fusione virale e dimostra promettente postexposure attivit&agrave; terapeutica. Nel presente documento, abbiamo generato un mAb Hu-E16 vegetali che possono essere rapidamente scalato per produzione commerciale. Pianta Hu-E16 &egrave; stata espressa a livelli elevati entro 8 giorni dall&#39;infiltrazione nelle piante di Nicotiana benthamiana e mantenuto ad alta affinit&agrave; legame e potente attivit&agrave; neutralizzante in vitro contro WNV. Una singola dose di pianta Hu-E16 protetto topi contro la mortalit&agrave; indotta da WNV anche 4 giorni dopo l&#39;infezione ai tassi che erano indistinguibili da mammiferi-cella-prodotto Hu-E16. Questo studio dimostra l&#39;efficacia di un prodotto vegetale mAb contro un&#39;infezione potenzialmente letale diversi giorni dopo l&#39;esposizione in un modello animale di sfida e fornisce una prova di principio per lo sviluppo di vegetali mAbs come terapia contro le malattie infettive emergenti.

Anticorpo monoclonale prodotto negli impianti in modo efficiente tratta infezione da virus del Nilo occidentale nei topi.

Filoviruses (Ebola and Marburg viruses) cause severe and often fatal haemorrhagic fever in humans and non-human primates. The US Centers for Disease Control identifies Ebola and Marburg viruses as 'category A' pathogens (defined as posing a risk to national security as bioterrorism agents), which has lead to a search for vaccines that could prevent the disease. Because the use of such vaccines would be in the service of public health, the cost of production is an important component of their development. The use of plant biotechnology is one possible way to cost-effectively produce subunit vaccines. In this work, a geminiviral replicon system was used to produce an Ebola immune complex (EIC) in Nicotiana benthamiana. Ebola glycoprotein (GP1) was fused at the C-terminus of the heavy chain of humanized 6D8 IgG monoclonal antibody, which specifically binds to a linear epitope on GP1. Co-expression of the GP1-heavy chain fusion and the 6D8 light chain using a geminiviral vector in leaves of N.Â benthamiana produced assembled immunoglobulin, which was purified by ammonium sulphate precipitation and protein G affinity chromatography. Immune complex formation was confirmed by assays to show that the recombinant protein bound the complement factor C1q. Size measurements of purified recombinant protein by dynamic light scattering and size-exclusion chromatography also indicated complex formation. Subcutaneous immunization of BALB/C mice with purified EIC resulted in anti-Ebola virus antibody production at levels comparable to those obtained with a GP1 virus-like particle. These results show excellent potential for a plant-expressed EIC as a human vaccine.

Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana.

Filovirus (virus Ebola et Marburg) provoquent fi&egrave;vre h&eacute;morragique grave et souvent mortelle chez les humains et les primates non humains. Les U.S. Centers for Disease Control identifie les virus Ebola et Marburg comme pathog&egrave;nes &laquo; cat&eacute;gorie A &raquo; (d&eacute;finis comme posant un risque pour la s&eacute;curit&eacute; nationale en tant qu&#39;agents de bioterrorisme), qui a conduit &agrave; la recherche de vaccins susceptibles de pr&eacute;venir la maladie. Parce que l&#39;utilisation de ces vaccins serait au service de la sant&eacute; publique, le co&ucirc;t de production est un &eacute;l&eacute;ment important de leur d&eacute;veloppement. L&#39;utilisation de la biotechnologie v&eacute;g&eacute;tale est une fa&ccedil;on possible de produire des vaccins sous-unitaires rentable. Dans ce travail, un syst&egrave;me de r&eacute;plicon geminiviral a &eacute;t&eacute; utilis&eacute; pour produire un complexe immun Ebola (CPN) de Nicotiana benthamiana. Ebola glycoprot&eacute;ine (GP1) a &eacute;t&eacute; fusionn&eacute;e &agrave; l&#39;extr&eacute;mit&eacute; C-terminale de la cha&icirc;ne lourde de humanis&eacute; 6 8 anticorps monoclonal IgG, qui se lie sp&eacute;cifiquement &agrave; un &eacute;pitope lin&eacute;aire sur GP1. Co-expression de la fusion de cha&icirc;ne GP1-lourds et les 8 6 cha&icirc;nes l&eacute;g&egrave;res &agrave; l&#39;aide d&#39;un vecteur de geminiviral dans des feuilles de N. benthamiana produit assembl&eacute; immunoglobuline, ce qui a &eacute;t&eacute; purifi&eacute;e par pr&eacute;cipitation au sulfate d&#39;ammonium et chromatographie d&#39;affinit&eacute; de la prot&eacute;ine G. Formation de complexes immunis&eacute;e a &eacute;t&eacute; confirm&eacute;e par des analyses de montrer que la prot&eacute;ine recombinante li&eacute;e aux mesures de taille de facteur C1q. compl&eacute;ment de prot&eacute;ine recombinante purifi&eacute;e par diffusion dynamique de la lumi&egrave;re et chromatographie d&#39;exclusion st&eacute;rique a &eacute;galement indiqu&eacute; la formation de complexes. Vaccination sous-cutan&eacute;e de souris BALB/C avec CPN purifi&eacute; a abouti &agrave; la production d&#39;anticorps anti-Ebola virus &agrave; des niveaux comparables &agrave; ceux obtenus avec une particule de type viral GP1. Ces r&eacute;sultats montrent l&#39;excellent potentiel pour un EIC exprim&eacute;s par les plantes comme un vaccin pour les humains.

Expression d&#39;un complexe immun immunog&egrave;ne de virus Ebola dans Nicotiana benthamiana.

Filoviruses (virus Ebola e Marburg) causa febbre emorragica grave e spesso fatale nell&#39;uomo e nei primati non umani. L&#39;US Centers for Disease Control identifica i virus Ebola e Marburg come agenti patogeni &#39;categoria A&#39; (definiti come che presentano un rischio per la sicurezza nazionale come agenti di bioterrorismo), che ha portato alla ricerca di vaccini che potrebbero prevenire la malattia. Perch&eacute; l&#39;uso di tali vaccini sarebbe al servizio della salute pubblica, il costo di produzione &egrave; una componente importante del loro sviluppo. L&#39;uso delle biotecnologie vegetali &egrave; un modo possibile per produrre a costi vaccini di subunit&agrave;. In questo lavoro, un sistema replicone geminiviral &egrave; stato usato per produrre un complesso immune Ebola (EIC) in Nicotiana benthamiana. Ebola glicoproteina (GP1) &egrave; stato fuso al C-terminale della catena pesante di 8 6 umanizzato anticorpo monoclonale IgG, che specificamente si lega a un epitopo lineare sul GP1. Co-Expression di fusione GP1-pesante catena e 8 6 catena leggera utilizzando un vettore di geminiviral in foglie di N. benthamiana prodotto assemblato immunoglobulina, che &egrave; stato purificato da precipitazione del solfato dell&#39;ammonio e cromatografia di affinit&agrave; della proteina G. Formazione dei complessi immuni &egrave; stata confermata da prove per dimostrare che la proteina ricombinante associato misurazioni complemento fattore C1q. dimensioni della proteina ricombinante purificata dalla diffusione dinamica della luce e cromatografia di esclusione di formato indicato anche formazione complessa. Immunizzazione sottocutanea di topi BALB/C con EIC purificata ha portato nella produzione di anticorpi anti-Ebola virus a livelli comparabili a quelli ottenuti con delle particelle virus-simili GP1. Questi risultati mostrano potenziale eccellente per un EIC pianta-espresso come un vaccino umano.

Espressione di un complesso immune Ebola immunogenico Nicotiana benthamiana.

La production de prot&eacute;ines pharmaceutiques chez les plantes a &eacute;t&eacute; largement promue par le d&eacute;veloppement de vecteurs de base virale et des syst&egrave;mes d&#39;expression transitoire. Tabac et esp&egrave;ces apparent&eacute;es de Nicotiana sont actuellement les plus courantes plantes h&ocirc;tes pour la production de prot&eacute;ines pharmaceutiques v&eacute;g&eacute;tale (PGR). En aval de traitement des PMPs cible de ces plantes, cependant, est entrav&eacute;e par des difficult&eacute;s techniques et r&eacute;glementaires potentielles en raison de la pr&eacute;sence de niveaux &eacute;lev&eacute;s de compos&eacute;s ph&eacute;noliques et des alcalo&iuml;des toxiques. Ici, nous avons explor&eacute; l&#39;utilisation de la laitue, qui cro&icirc;t rapidement, mais produit de faibles concentrations de m&eacute;tabolites secondaires et syst&egrave;mes d&#39;expression transitoire virale vectoriel pour d&eacute;velopper une plate-forme de production PMP robuste. Nos r&eacute;sultats ont montr&eacute; qu&#39;un syst&egrave;me de r&eacute;plicon geminiviral bas&eacute; sur le haricot nain jaune permet de haut niveau expression chez la laitue des Pseudo-particules virales (VLP) d&eacute;riv&eacute; de la prot&eacute;ine de capside des virus Norwalk et th&eacute;rapeutiques anticorps monoclonaux (ACM) contre les virus Ebola et du Nil occidental. Ces vaccins et les candidats th&eacute;rapeutiques peuvent &ecirc;tre facilement &eacute;pur&eacute;es de feuilles de laitue avec des m&eacute;thodes de transformation &eacute;volutive tout en conservant int&eacute;gralement l&#39;activit&eacute; fonctionnelle. En outre, cette &eacute;tude a &eacute;galement d&eacute;montr&eacute; la faisabilit&eacute; d&#39;utiliser commercialement produite laitue pour haut niveau production PMP. Cela permet &agrave; notre syst&egrave;me de production d&#39;avoir acc&egrave;s &agrave; des quantit&eacute;s illimit&eacute;es de mati&egrave;res v&eacute;g&eacute;tales &agrave; bon march&eacute; pour la production &agrave; grande &eacute;chelle. Ces r&eacute;sultats &eacute;tablissent une nouvelle plateforme de production pour les agents biologiques pharmaceutiques qui sont efficaces, s&ucirc;rs, faible co&ucirc;t et se pr&ecirc;tent &agrave; la fabrication &agrave; grande &eacute;chelle.

Production robuste des Pseudo-particules virales et anticorps monoclonaux avec vecteurs r&eacute;plicon geminiviral chez la laitue.

Pharmaceutical protein production in plants has been greatly promoted by the development of viral-based vectors and transient expression systems. Tobacco and related Nicotiana species are currently the most common host plants for the generation of plant-made pharmaceutical proteins (PMPs). Downstream processing of target PMPs from these plants, however, is hindered by potential technical and regulatory difficulties owing to the presence of high levels of phenolics and toxic alkaloids. Here, we explored the use of lettuce, which grows quickly yet produces low levels of secondary metabolites and viral vector-based transient expression systems to develop a robust PMP production platform. Our results showed that a geminiviral replicon system based on the bean yellow dwarf virus permits high-level expression in lettuce of virus-like particles (VLP) derived from the Norwalk virus capsid protein and therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) against Ebola and West Nile viruses. These vaccine and therapeutic candidates can be readily purified from lettuce leaves with scalable processing methods while fully retaining functional activity. Furthermore, this study also demonstrated the feasibility of using commercially produced lettuce for high-level PMP production. This allows our production system to have access to unlimited quantities of inexpensive plant material for large-scale production. These results establish a new production platform for biological pharmaceutical agents that are effective, safe, low cost, and amenable to large-scale manufacturing.

Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce.

Produzione farmaceutica della proteina nelle piante &egrave; stato notevolmente promosso dallo sviluppo di vettori virali-based e sistemi di espressione transiente. Tabacco e relative specie di Nicotiana sono attualmente le pi&ugrave; comuni piante ospite per la generazione di fatto pianta farmaceutiche proteine (PMP). A valle di elaborazione della destinazione PMP da queste piante, tuttavia, &egrave; ostacolato da potenziali difficolt&agrave; tecniche e normative, a causa della presenza di elevati livelli di composti fenolici e alcaloidi tossici. Qui, abbiamo esplorato l&#39;uso della lattuga, che cresce rapidamente ma produce bassi livelli di metaboliti secondari e sistemi virali espressione transitoria vettoriale per sviluppare una robusta piattaforma di produzione PMP. I nostri risultati hanno mostrato che un sistema replicone geminiviral basato sul virus Fagiolo nano giallo permette espressione ad alto livello nella lattuga di particelle virus-simili (VLP) derivato dalle proteine del capside di Norwalk virus e terapeutici anticorpi monoclonali (mAbs) contro il virus Ebola e West Nile. Questi vaccini e terapeutici dei candidati possono essere facilmente purificati da foglie di lattuga con metodi di elaborazione scalabile mantenendo completamente attivit&agrave; funzionale. Inoltre, questo studio ha dimostrato anche la possibilit&agrave; di utilizzare commercialmente prodotto lattuga per la produzione di PMP ad alto livello. In questo modo il nostro sistema di produzione di avere accesso a quantit&agrave; illimitata di materiale poco costoso impianto per la produzione su larga scala. Questi risultati stabiliscono una nuova piattaforma di produzione per gli agenti biologici farmaceutici che sono efficaci, sicuri, basso costo e suscettibili di produzione su larga scala.

Robusta produzione di particelle virus-simili e anticorpi monoclonali con vettori replicone geminiviral nella lattuga.

Despite the success in expressing a variety of subunit vaccine proteins in plants and the recent stride in improving vaccine accumulation levels by transient expression systems, there is still no plant-derived vaccine that has been licensed for human use. The lack of commercial success of plant-made vaccines lies in several technical and regulatory barriers that remain to be overcome. These challenges include the lack of scalable downstream processing procedures, the uncertainty of regulatory compliance of production processes, and the lack of demonstration of plant-derived products that meet the required standards of regulatory agencies in identity, purity, potency and safety. In this study, we addressed these remaining challenges and successfully demonstrate the ability of using plants to produce a pharmaceutical grade Norwalk virus (NV) vaccine under current Good Manufacture Practice (cGMP) guidelines at multiple gram scales. Our results demonstrate that an efficient and scalable extraction and purification scheme can be established for processing virus-like particles (VLPs) of NV capsid protein (NVCP). We successfully operated the upstream and downstream NVCP production processes under cGMP regulations. Furthermore, plant-derived NVCP VLP demonstrates the identity, purity, potency and safety that meet the preset release specifications. This material is being tested in a Phase I human clinical trial. This research provides the first report of producing a plant-derived vaccine at scale under cGMP regulations in an academic setting and an important step for plant-produced vaccines to become a commercial reality.

Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations.

Malgr&eacute; le succ&egrave;s dans l&#39;expression de diverses prot&eacute;ines vaccin sous-unit&eacute; chez les plantes et la foul&eacute;e r&eacute;cente dans l&#39;am&eacute;lioration des niveaux d&#39;accumulation de vaccin en syst&egrave;mes d&#39;expression transitoire, il n&#39;y a encore aucun vaccin d&#39;origine v&eacute;g&eacute;tale qui a obtenu une licence &agrave; usage humain. Le manque de succ&egrave;s commercial de l&#39;usine de fabrication de vaccins r&eacute;side dans plusieurs obstacles techniques et r&eacute;glementaires qui restent &agrave; surmonter. Ces d&eacute;fis comprennent l&#39;absence de proc&eacute;dures de traitement en aval &eacute;volutive, l&#39;incertitude de la conformit&eacute; r&eacute;glementaire des processus de production et l&#39;absence de d&eacute;monstration de produits d&eacute;riv&eacute;s de plantes qui r&eacute;pondent aux normes requises des organismes de r&eacute;glementation dans l&#39;identit&eacute;, de puret&eacute;, de puissance et de s&eacute;curit&eacute;. Dans cette &eacute;tude, nous avons abord&eacute; ces d&eacute;fis persistants et r&eacute;ussit &agrave; d&eacute;montrer la capacit&eacute; d&#39;utiliser des plantes pour produire une vaccin contre le virus (NV) Norwalk en vertu des lignes directrices de bonnes pratiques de fabrication (cGMP) actuelles &agrave; plusieurs &eacute;chelles de gramme de qualit&eacute; pharmaceutique. Nos r&eacute;sultats d&eacute;montrent qu&#39;un r&eacute;gime efficace et &eacute;volutif d&#39;extraction et de purification peut &ecirc;tre &eacute;tabli pour le traitement des Pseudo-particules virales (VLP) de la prot&eacute;ine de capside NV (NVCP). Nous avons exploit&eacute; avec succ&egrave;s les processus de production de NVCP en amont et en aval en vertu de r&egrave;glements de cGMP. En outre, les v&eacute;g&eacute;taux NVCP VLP d&eacute;montre l&#39;identit&eacute;, la puret&eacute;, la puissance et la s&eacute;curit&eacute; qui r&eacute;pondent aux sp&eacute;cifications de sortie pr&eacute;d&eacute;fini. Ce mat&eacute;riel est actuellement test&eacute; dans une Phase I essai clinique chez l&#39;humain. Cette recherche fournit le premier rapport de produire un vaccin d&#39;origine v&eacute;g&eacute;tale &agrave; l&#39;&eacute;chelle en vertu des r&egrave;glements de cGMP dans le milieu universitaire et une &eacute;tape importante pour les vaccins produits plante devienne une r&eacute;alit&eacute; commerciale.

Biotraitement des v&eacute;g&eacute;taux des Pseudo-particules virales de la prot&eacute;ine de capside de virus de Norwalk en vertu du r&egrave;glement actuel sur les bonnes pratiques de fabrication.

Nonostante il successo nell&#39;esprimere una variet&agrave; di proteine vaccine subunit&agrave; nelle piante e il recente stride nel miglioramento dei livelli di accumulo di vaccino da sistemi di espressione transiente, non c&#39;&egrave; ancora nessun vaccino di origine vegetale che ha ottenuto la licenza per uso umano. La mancanza di successo commerciale dei vaccini fatti in pianta si trova in diversi ostacoli tecnici e normativi che restano ancora da superare. Queste sfide comprendono la mancanza di procedure di elaborazione scalabile a valle, l&#39;incertezza della conformit&agrave; normativa dei processi produttivi e la mancanza di dimostrazione di prodotti di origine vegetale che soddisfano gli standard richiesti di agenzie di regolamentazione in identit&agrave;, purezza, potenza e sicurezza. In questo studio, abbiamo affrontato queste rimanenti sfide e dimostrare con successo la capacit&agrave; di utilizzo di piante per produrre una qualit&agrave; farmaceutica Norwalk (NV) vaccino sotto le attuali linee guida di buona pratica di fabbricazione (cGMP) a pi&ugrave; scale di grammo. I nostri risultati dimostrano che pu&ograve; essere stabilito un sistema di estrazione e purificazione efficiente e scalabile per la lavorazione di particelle virus-simili (VLP) della proteina del capside di NV (NVCP). Abbiamo operato con successo a monte e a valle NVCP processi produttivi secondo normative cGMP. Inoltre, vegetali NVCP VLP dimostra l&#39;identit&agrave;, purezza, potenza e sicurezza che soddisfano le specifiche di rilascio preimpostato. Questo materiale &egrave; stato testato in una fase I trial clinici umani. Questa ricerca fornisce il primo rapporto di produrre un vaccino vegetali alla scala sotto normative cGMP in un&#39;impostazione accademica e un passo importante per i vaccini prodotti vegetali a diventare una realt&agrave; commerciale.

Bioprocessing di vegetali particelle virus-simili di proteina di capside virus Norwalk sotto le vigenti norme di buona pratica di fabbricazione.

The threat of West Nile virus (WNV) epidemics necessitates the development of a technology platform that can produce reagents to support detection and diagnosis rapidly and inexpensively. A plant expression system is attractive for protein production due to its low-cost and high-scalability nature and its ability to make appropriate posttranslational modifications. Here, we investigated the feasibility of using plants to produce two WNV detection and diagnostic reagents to address the current cost and scalability issues. We demonstrated that WNV DIII antigen and E16 monoclonal antibody are rapidly produced at high levels in two plant species and are easily purified. Furthermore, they are effective in identifying WNV and in detecting human IgM response to WNV infection. E16 mAb does not cross-react with other flaviviruses, therefore, is valuable for improving diagnostic accuracy. This study provides a proof of principle for using plants as a robust and economical system to produce diagnostic reagents for arboviruses.

A novel system for rapid and cost-effective production of detection and diagnostic reagents of West Nile virus in plants.

La menace d&#39;&eacute;pid&eacute;mies de West Nile virus (VNO) n&eacute;cessite le d&eacute;veloppement d&#39;une plate-forme technologique qui peut produire des r&eacute;actifs pour soutenir le d&eacute;pistage et le diagnostic rapidement et &agrave; moindre co&ucirc;t. Un syst&egrave;me d&#39;expression de plante est attrayant pour la production de prot&eacute;ines en raison de sa nature de faible co&ucirc;t et haute-&eacute;volutivit&eacute; et sa capacit&eacute; &agrave; faire des modifications post-traductionnelles appropri&eacute;es. Ici, nous avons &eacute;tudi&eacute; la faisabilit&eacute; d&#39;utiliser des plantes pour produire deux de d&eacute;tection de l&#39;infection par le VNO et de r&eacute;actifs de diagnostic pour r&eacute;soudre les probl&egrave;mes de co&ucirc;t et de l&#39;&eacute;volutivit&eacute; actuelles. Nous avons d&eacute;montr&eacute; que l&#39;antig&egrave;ne WNV DIII et anticorps monoclonal E16 sont produits rapidement &agrave; des niveaux &eacute;lev&eacute;s chez deux esp&egrave;ces de plantes et sont facilement purifi&eacute;s. En outre, ils sont efficaces dans l&#39;identification du VNO et dans la d&eacute;tection de r&eacute;ponse IgM humaine &agrave; l&#39;infection par le VNO. E16 mAb ne pas de r&eacute;action crois&eacute;e avec les autres flavivirus, par cons&eacute;quent, il est pr&eacute;cieux pour am&eacute;liorer la pr&eacute;cision diagnostique. Cette &eacute;tude fournit une d&eacute;monstration des principes pour l&#39;utilisation de plantes comme un syst&egrave;me robuste et &eacute;conomique pour produire des r&eacute;actifs de diagnostic pour les arbovirus.

Un nouveau syst&egrave;me pour la production rapide et rentable de d&eacute;tection et de r&eacute;actifs de diagnostic du virus du Nil occidental chez les plantes.

La minaccia di epidemie di West Nile virus (WNV) richiede lo sviluppo di una piattaforma tecnologica in grado di produrre reagenti per supportare l&#39;individuazione e la diagnosi rapidamente ed a buon mercato. Un sistema di espressione dell&#39;impianto &egrave; attraente per la produzione di proteine a causa della sua natura di basso costo e ad alta scalabilit&agrave; e la sua capacit&agrave; di rendere opportune modifiche di posttranslational. Qui, abbiamo studiato la fattibilit&agrave; dell&#39;utilizzo di piante per produrre due WNV rilevamento e i reagenti diagnostici per affrontare i problemi di scalabilit&agrave; e costi attuali. Abbiamo dimostrato che WNV DIII antigene e anticorpo monoclonale E16 sono prodotte rapidamente ad alti livelli in due specie di piante e sono facilmente purificati. Inoltre, essi sono efficaci nell&#39;identificare WNV e nella rilevazione di risposta IgM umana all&#39;infezione WNV. E16 mAb non reazioni incrociate con altri flavivirus, pertanto, &egrave; prezioso per migliorare l&#39;accuratezza diagnostica. Questo studio fornisce una prova di principio per l&#39;utilizzo di piante come un sistema affidabile ed economico per produrre i reagenti diagnostici per gli arbovirus.

Un innovativo sistema per la produzione rapida e conveniente di rilevazione e i reagenti diagnostici del virus di West Nile in piante.

To develop a hydroponic Nicotiana cultivation system for rapid and high-yield transient expression of recombinant proteins under laboratory conditions.

[A hydroponic cultivation system for rapid high-yield transient protein expression in Nicotiana plants under laboratory conditions].

Pour d&eacute;velopper un syst&egrave;me de culture hydroponique Nicotiana pour expression transitoire rapide et &agrave; rendement &eacute;lev&eacute; de prot&eacute;ines recombinantes dans des conditions de laboratoire.

[Un syst&egrave;me de culture hydroponique pour l&#39;expression de la prot&eacute;ine transitoire de rapide haut rendement en conditions de laboratoire, les plantes de Nicotiana].

Per sviluppare un sistema di coltivazione idroponico Nicotiana per rapida e ad alto rendimento transitoria espressione di proteine ricombinanti in condizioni di laboratorio.

[Un sistema di coltivazione idroponica per espressione rapida ad alto rendimento transitoria della proteina nelle piante di Nicotiana in condizioni di laboratorio].

Virus-like particles (VLPs) are self-assembled structures derived from viral antigens that mimic the native architecture of viruses but lack the viral genome. VLPs have emerged as a premier vaccine platform due to their advantages in safety, immunogenicity, and manufacturing. The particulate nature and high-density presentation of viral structure proteins on their surface also render VLPs as attractive carriers for displaying foreign epitopes. Consequently, several VLP-based vaccines have been licensed for human use and achieved significant clinical and economical success. The major challenge, however, is to develop novel production platforms that can deliver VLP-based vaccines while significantly reducing production times and costs. Therefore, this review focuses on the essential role of plants as a novel, speedy and economical production platform for VLP-based vaccines. The advantages of plant expression systems are discussed in light of their distinctive posttranslational modifications, cost-effectiveness, production speed, and scalability. Recent achievements in the expression and assembly of VLPs and their chimeric derivatives in plant systems as well as their immunogenicity in animal models are presented. Results of human clinical trials demonstrating the safety and efficacy of plant-derived VLPs are also detailed. Moreover, the promising implications of the recent creation of "humanized" glycosylation plant lines as well as the very recent approval of the first plant-made biologics by the U. S. Food and Drug Administration (FDA) for plant production and commercialization of VLP-based vaccines are discussed. It is speculated that the combined potential of plant expression systems and VLP technology will lead to the emergence of successful vaccines and novel applications of VLPs in the near future.

Plant-derived virus-like particles as vaccines.

Pseudo-particules virales (VLP) sont des structures auto-assembl&eacute;es d&eacute;riv&eacute;s des antig&egrave;nes viraux qui imitent l&#39;architecture native du virus mais n&#39;ont pas le g&eacute;nome viral. Les PPV sont apparus comme une plateforme de premier vaccin en raison de leurs avantages dans la s&eacute;curit&eacute; et l&#39;immunog&eacute;nicit&eacute; fabrication. La nature particulaire et la pr&eacute;sentation haute densit&eacute;e des prot&eacute;ines de structure virale sur leur surface &eacute;galement rendent les PPV comme transporteurs attrayants pour l&#39;affichage des &eacute;pitopes &eacute;trangers. En cons&eacute;quence, plusieurs vaccins VLP ont &eacute;t&eacute; licenci&eacute;s pour homme utiliser et obtenu des succ&egrave;s cliniques et &eacute;conomiques importants. Le d&eacute;fi majeur, cependant, est de d&eacute;velopper des plates-formes de production novatrice qui peuvent fournir des vaccins VLP tout en r&eacute;duisant consid&eacute;rablement les co&ucirc;ts et les d&eacute;lais de production. Par cons&eacute;quent, cette revue met l&#39;accent sur le r&ocirc;le essentiel des plantes comme une plate-forme de production nouvelle, rapide et &eacute;conomique pour les vaccins VLP. Les avantages des syst&egrave;mes d&#39;expression de plante sont discut&eacute;s &agrave; la lumi&egrave;re de leurs modifications post-traductionnelles distinctives, rentabilit&eacute;, vitesse de production et d&#39;&eacute;volutivit&eacute;. Les auteurs pr&eacute;sentent les r&eacute;alisations r&eacute;centes dans l&#39;expression et de r&eacute;union de PPV et leurs d&eacute;riv&eacute;s chim&eacute;riques dans des syst&egrave;mes v&eacute;g&eacute;taux ainsi que leur immunog&eacute;nicit&eacute; chez les mod&egrave;les animaux. R&eacute;sultats des essais cliniques humains d&eacute;montrant l&#39;innocuit&eacute; et l&#39;efficacit&eacute; d&#39;origine v&eacute;g&eacute;tale PPV sont &eacute;galement d&eacute;taill&eacute;es. En outre, les implications prometteuses de la cr&eacute;ation r&eacute;cente de glycosylation &laquo; humanis&eacute; &raquo; usine lignes ainsi que la tr&egrave;s r&eacute;cente approbation de la premi&egrave;re biologics v&eacute;g&eacute;tale par l&#39;u. s. Food et pharmaceutiques (FDA) pour production de v&eacute;g&eacute;taux et commercialisation des vaccins VLP sont discut&eacute;s. Il est sp&eacute;cul&eacute; que le potentiel combin&eacute; de plante des syst&egrave;mes d&#39;expression et de la technologie VLP conduira &agrave; l&#39;apparition des vaccins efficaces et de nouvelles applications de PPV dans un proche avenir.

Pseudo-particules virales v&eacute;g&eacute;tales comme les vaccins.

Particelle virus-simili (VLP) sono strutture auto-assemblate derivati da antigeni virali che imitano l&#39;architettura nativa del virus, ma mancano il genoma virale. Le VLP sono emersi come una piattaforma premier vaccino a causa della loro vantaggi in sicurezza, l&#39;immunogenicit&agrave; e produzione. La natura di particolato e la presentazione ad alta densit&agrave; di proteine virali struttura sulla loro superficie anche rendering VLP come vettori attraenti per la visualizzazione di epitopi stranieri. Di conseguenza, molti vaccini VLP-based sono stati concessi per umani utilizzare e raggiunto il successo clinico ed economico significativo. La grande sfida, tuttavia, &egrave; di sviluppare piattaforme di produzione romanzo che possono offrire vaccini VLP-based riducendo notevolmente i costi e tempi di produzione. Pertanto, questa recensione si concentra sul ruolo essenziale delle piante come una piattaforma di produzione romanzo, veloce ed economico per i vaccini VLP-based. I vantaggi dei sistemi di espressione pianta sono discussi alla luce del loro distintive modifiche di posttranslational, economicit&agrave;, velocit&agrave; di produzione e scalabilit&agrave;. Recenti successi nella espressione e nell&#39;assemblaggio di VLP e loro derivati chimerici in sistemi vegetali e loro immunogenicit&agrave; in modelli animali sono presentati. Risultati di studi clinici umani, dimostrando la sicurezza e l&#39;efficacia di VLP vegetali sono anche dettagliati. Inoltre, le implicazioni promettenti di recente creazione di glicosilazione &quot;umanizzato&quot; pianta linee cos&igrave; come molto recente approvazione del primo impianto realizzato biologics dalla u. s. Food and Drug Administration (FDA) per impianto di produzione e commercializzazione di vaccini VLP-based sono discussi. &Egrave; stato ipotizzato che il potenziale combinato di espressione impianti e tecnologia VLP porter&agrave; ad applicazioni romanzo di VLP e l&#39;emergere di vaccini successo nel prossimo futuro.

Article	Year
Identification of pyruvate carboxylase genes in Pseudomonas aeruginosa PAO1 and development of a P. aeruginosa-based overexpression system for alpha4- and alpha4beta4-type pyruvate carboxyla... Applied and environmental microbiology\| PubMed ID: 16997990	2006
High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnology and bioengineering\| PubMed ID: 20047189	2010
Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 20133644	2010
Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant biotechnology journal\| PubMed ID: 21281425	2011
Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant biotechnology journal\| PubMed ID: 21883868	2012
Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant cell reports\| PubMed ID: 22134876	2012
A novel system for rapid and cost-effective production of detection and diagnostic reagents of West Nile virus in plants. Journal of biomedicine & biotechnology\| PubMed ID: 22187532	2012
[A hydroponic cultivation system for rapid high-yield transient protein expression in Nicotiana plants under laboratory conditions]. Nan fang yi ke da xue xue bao = Journal of Southern Medical University\| PubMed ID: 22699052	2012
Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human vaccines & immunotherapeutics\| PubMed ID: 22995837	2013

Huafang Lai

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