التصور التنمية الجمجمة في sox10: Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الخط الوقت الفاصل بين متحد البؤر المجهري

الهدف العام من التجربة التالية هو إنشاء تسجيل مباشر لانتقال خلايا القمة العصبية من أجل إظهار تكوين هياكل الوجه القحفية النامية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تركيب سمكة الزرد المعدلة وراثيا SOX 10 KD المخدرة أولا في الاغاروز من أجل تقليل الحركة طوال التجربة. بعد ذلك ، تحت المجهر متحد البؤر ، يتم إجراء تنشيط صور الأشعة فوق البنفسجية لتحويل الديكورات الكويتية من الأخضر إلى الأحمر في خلايا القمة العصبية.

ثم التركيز على الصورة المحولة خلايا القمة العصبية. يتم إنشاء Zack للهيكل المتطور قبل تسجيل فيديو بفاصل زمني. تم الحصول على النتائج التي تظهر تطور خلايا القمة العصبية القحفية في الحنك الأولي لسمك الزرد في جنين سمكة الزرد المعدلة وراثيا SOX 10 KD.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل التصوير الثابت ، هي أنه يمكن تصور العمليات التنموية المعقدة مثل هجرة الخلايا في الوقت الفعلي. هذا يجعل النتائج في متناول المجتمع العلمي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء التنموي ، مثل كيفية تشكل الهياكل المشتقة من خلايا القمة العصبية ، وكيف تؤثر جينات PTO على تطورها.

للتحضير لتركيب الأجنة ، استخدم قارورة سعة 125 مليلتر لخلط E ثلاثة ماء مع ميكروويف منخفض نقطة انصهار لإذابة المحلول. ثم أضف trica وضع القارورة في حمام مائي 50 درجة مئوية للتدفئة وتعشيش الروابط الفلورية الزاهية من أجنة أسماك الحمار الوحشي الفلورية الزاهية في 60 ساعة بعد الإخصاب. ثم انقلهم إلى شريحة غرفة مع المناديل الورقية.

امتص الماء الزائد E ثلاثة ثم استخدم محلول الأجارو لتغطية الجنين. استخدم طرف محمل صغير لوضع الجنين في الظهر تماما ، مما يضمن أن الأجنة مغمورة بالكامل في الأجارو. بعد مجموعات الأجارو ، استخدم E ثلاثة 0.015٪ trica لملء شريحة الغرفة لإجراء تحويل الصورة.

ابدأ باستخدام هدف غمر الهواء 20 × للتركيز على الجنين. ثم اضغط على زر الضوء L 100 على المجهر وحدد القنوات في البرنامج. افتح الرموز.

عرض عناصر التحكم في الاكتساب إعدادات واحدة ، وانقر فوق زر الإعداد متحد البؤر. بعد ذلك ، انقر فوق تلقائي وحدد DPI 4 88 و 561.9 للقنوات 1 و 2 و 3 على التوالي قبل إغلاق النافذة مرة أخرى. ثم قم بإيقاف تشغيل القناتين الأولى والثالثة قبل النقر فوق زر إزالة التعشيق والضغط على زر المسح بدءا من إطار واحد في الثانية و HV 200.

ابدأ في التركيز على الخلايا ذات الأهمية. زيادة الإطارات تدريجيا في الثانية إلى إطار واحد لكل 32 ، وتقليل الجهد إلى 100 إلى 120 اعتمادا على ضوضاء الخلفية. عندما يكون الجنين في بؤرة التركيز ، أمسك الحافة الخضراء على الحافة اليمنى للشاشة وقم بتقليصها لتناسب المنطقة المراد تحويل الصورة قبل النقر بزر الماوس الأيمن.

قم بتغيير الإطارات في الثانية إلى واحدة والجهد العالي إلى 200 واضغط على مسح ضوئي. ستظهر الآن صورة مكبرة لمنطقة تحويل الصورة. الصورة التالية.

قم بتحويل الخلايا عن طريق تشغيل القناة الأولى لمدة تتراوح من خمس إلى 60 ثانية حتى تغيب إشارة KD الخضراء تقريبا. ثم قم بإيقاف تشغيل القناة الضعيفة. قم بتشغيل القناتين الثانية والثالثة للعودة إلى التكبير/التصغير الأصلي.

انقر بزر الماوس الأيمن على نافذة التكبير / التصغير واختر العودة إلى الحجم الأصلي للتحقق مما إذا كانت الخلايا المطلوبة قد تم تحويل الصورة بشكل مناسب. قم بتعيين حدود Zack عن طريق اختيار أيقونة Capture Z Series في شريط القائمة. اضبط جداول البحث أو uts لإعداد فاصل زمني.

اختر مربع واجهة المستخدم الرسومية البسيط وحدد الإعدادات التالية. واحد لكل 32 إطارا في الثانية. الحجم 1024 ومتوسط أربعة أو ثمانية x اعتمادا على عدد مكدسات Z التي يجب أخذها في حلقة واحدة.

بعد ذلك ، انتقل إلى عرض اكتساب عناصر التحكم في اكتساب تسلسل ND وتعيين الإطار الزمني. ثم انقر فوق مستمر ، ثم Zack. قم بتعيين الحدود كما هو موضح سابقا.

ابدأ الفيلم ، وأضف E ثلاثة محلول trica 0.015٪ إلى الغرفة ، وانزلق طوال اليوم واملأ الغرفة بالكامل للتصوير طوال الليل. عند اكتمال التصوير، قم بإنشاء فيديو عالي الجودة من ملف التصوير بالنقر فوق إظهار الإسقاط الأقصى للكثافة. ثم انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وأنشئ مستندا جديدا.

احذف الإطارات غير الضرورية واضبط L uts. في هذا الفيلم الذي يظهر Palato Genesis في سمك الزرد ، يتم استخدام الخط المعدل وراثيا SOX 10 K لمتابعة خلايا القمة العصبية القحفية أثناء تطورها لتشكيل الحنك الأساسي. يتم تحويل الخلايا الأمامية للحنك المشكل من الأخضر إلى الأحمر بعد 60 ساعة من الإخصاب.

عندما تلتقي التربيق المزدوج لتشكيل الحنك الأولي ، يتم بعد ذلك اتباع هذه الخلايا حتى تصل إلى وجهتها النهائية. يوضح هذا الفيلم تطور الحنك المضطرب مما يؤدي إلى تكوين شق فموي وجهي ، ضربة قاضية بوساطة مورينو للبقعة. رطل واحد ، يتم استخدام جين يشارك في شق الوجه المائل كمثال.

في 60 HPF ، يظهر تحويل الصور أحادي الجانب لخلايا الصفيحة الغربالية الأمامية فشلا بين الخلايا المتوسطة وخلايا الصفيحة الغربالية الجانبية. يشبه هذا العيب التسبب في تطور شق الوجه المائل عند البشر حيث يحدث انصباب فشل بين عملية الأنف الجانبية والبروز الفكي العلوي. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء التنموي لاستكشاف تطور خلايا القمة العصبية في أسماك الزرد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام هذه الطريقة لالتقاط عملية التطوير التي تهمك.