تعديل متعدد مقياس من يزرع لامع مع التدرجات مسام، مركبات البولي الكتروليت والمراقبة غير المباشرة في الجسم الحي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تعديل الغرسات المعدنية بمقاييس طول متعددة للتحكم في سلوك الخلية في المختبر وفي الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك من خلال إنتاج تدرج بحجم المسام أولا داخل غرسات أنبوبية ثلاثية الأبعاد ، طريقة استخراج Biofreeze. تتمثل الخطوة الثانية في تطوير تقليد الغشاء القاعدي الليفي النانوي على أساس الكولاجين والألجينات حسب منهجية طبقة تلو الأخرى.

بعد ذلك ، طريقة غير مباشرة لمراقبة مثل هذه الغرسات بعد الزرع باستخدام تحليل بلازما الدم. يتم عرض HPLC وتسلسل الببتيد اللاحق في النهاية على أنه غرسة حيث يمكن للمناطق المختلفة أن تستوعب أنواعا مختلفة من الخلايا حسب الضرورة. بالنسبة لبعض الأنسجة متعددة الخلايا ، يمكن الحصول عليها على الرغم من أن هذا النظام يمكن أن يوفر طريقة لتعديل الغرسات المعدنية.

يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة نموذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد مثل الأنسجة الاصطناعية أو نماذج الأمراض. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نحاول إيجاد تقنية للتحكم في حركة الخلايا حول غرسات التيتانيوم المسامية في الجسم الحي. لبدء هذا الإجراء ، قم بتنظيف الغرسات وتصميم وتصنيع قوالب التفلون كما هو موضح في النص المكتوب للتجميد والاستخراج.

تحضير محلول البوليمر الاصطناعي PLLA في خليط ثنائي من الديوكسين والماء عن طريق إدخال مسحوق البوليمر في المذيب العضوي. على ستار مغناطيسي ، سخني الخليط إلى 60 درجة مئوية للحصول على محلول متجانس. يتم تحديد درجة الحرارة هذه لأنها الحد الأعلى لمقاومة درجات الحرارة للمحاقن الزجاجية الدقيقة التي سيتم استخدامها لإدخال المحلول في الغرسات.

وفي الوقت نفسه ، احسب حجم محلول البوليمر الضروري فيما يتعلق بمسامية الغرسة مع مراعاة التغيير في حجم المحلول المجمد. بعد ذلك ، أدخل المحلول في الغرسات باستخدام محاقن زجاجية دقيقة بدقة 0.1 ميكرولتر. الحد الأدنى لتركيز البوليمر هو 3٪ لتكوين تدرج PO القابل للتكرار ، أو عندما يصبح من الصعب الحصول على توزيع متجانس في العينات السميكة فوق 6٪ ، قم بتجميد العينات إما مباشرة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر أو مع فترة حضانة سابقة مدتها 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

تحدد ظروف التجميد جزئيا تكوين المسام. لذلك التجميد شروط يستطيع كنت كيفت وفقا ل المسامية يهدف. احتفظ بالعينات طوال الليل عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

يعد فصل العفن في الحالة المجمدة خطوة صعبة للغاية. يجب توخي الحذر لتقليل ملامسة محلول القاع المجمد مع القالب ، بمساعدة فروة الرأس ، اغمر الغرسات في 80٪ من الإيثانول المبرد مسبقا للحصول على تدرجات المسامية. استخدم مشرطا مبردا مسبقا لإزالة جميع أجزاء القالب باستثناء المغزل ، للغرسات الأنبوبية وجميع الأجزاء باستثناء الجزء السفلي للغرسات على شكل قرص ، قم بإجراء الاستخراج عند 20 درجة مئوية تحت الصفر بين عشية وضحاها.

بعد الاستخراج ، قم بإزالة أجزاء القالب المتبقية وجفف الغرسات بالهواء. لتوصيف المسامية الكلية للهيكل. تحليل مقياس التأكسج الزئبقي ضروري.

في هذا المثال ، تظهر قياسات مقياس التأكسج الزئبقي قمم مميزة تتوافق مع المسام على جانبي الغرسة والمسام الصغيرة المتناثرة. ومع ذلك ، فإن البيانات الأكثر أهمية هي الفرق بين مسامية الأسطح داخل اللمعة وخارج اللمعان ، والتي يمكن تحليلها بواسطة الصورة J لتوزيع حجم المسام. بعد الكسر بالتجميد للعينات من خلال مراقبة المقطع العرضي بالمجهر الإلكتروني الماسح.

نظرا للطبيعة المسامية المفتوحة للغرسات المستخدمة وقدرة التيتانيوم على عكس الضوء ، فمن الممكن عمل مداخن Z من الخلايا المسماة داخل الغرسات المسامية. يمكن استخدام الخلايا المسماة ب PKH 26 أو الكالسيوم AM لتصور الغرسات باستخدام الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر لتراكم طبقات متعددة. يتم الحصول على أعلى قابلية للتكرار باستخدام روبوتات الغمس.

ومع ذلك ، إذا لم يكن روبوت الغمس متاحا ، فيمكن تنفيذ هذه الخطوات يدويا. لتحضير محلول الكولاجين ، استخدم الكولاجين الطبي من النوع الأول وألجينات الصوديوم. التركيزات المحسنة هي 0.5 جرام لكل لتر لكل 150 ملليمول.

يعمل المخزن المؤقت لسترات كلوريد الصوديوم عند درجة الحموضة 3.8 على إذابة محلول الكولاجين طوال الليل لضمان التجانس. الرقم الهيدروجيني الحمضي للمحلول 3.8 ضروري للتراكم المستقر للطبقات لأن الهيكل غير مستقر. قبل الربط المتقاطع.

في تصميم الأس الهيدروجيني المحايد حامل محدد لاستخدام الغرسات مع روبوتات الغمس المستخدمة في إنتاج متعدد الطبقات بالكهرباء البولي. قم بإيداع الطبقات على سطح غرسات التيتانيوم فقط أو الغرسات المعدلة كما هو موضح في النص. باستخدام نظام روبوت الغمس عن طريق غمر الغرسات أولا في محلول الجينات لمدة 15 دقيقة ، ثم شطف الهيكل بكلوريد الصوديوم 150 ملليمولار عند درجة الحموضة 3.8 لمدة خمس دقائق.

اتبعيه بالغمر في محلول الكولاجين لمدة 15 دقيقة. لتثبيت الغشاء القاعدي أولا ، قم بإعداد محلول الربط المتقاطع عند 100 مللي مولار. في المخزن المؤقت للسترات A-D-M-S-O بنسبة حجم واحد إلى أربعة أحجام ، قم بإذابة الجينين في مكون DMSO ثم في مكون الماء لتجنب التكتل ، وربط العينات عن طريق الغمر في محلول الربط المتقاطع بين 12 و 24 ساعة بعد ذلك.

اشطفها بكميات وفيرة من محلول السترات عند درجة الحموضة 3.8 بعد غسل الخطوات ، قم بتعقيم العينات إما بالعلاج بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة أو في حمام مضاد للمضادات الحيوية المضاد للفطريات. المعلمات الرئيسية التي تحدد جودة تقليد الغشاء القاعدي هي سمكه وقطر الألياف. احسب أقطار الألياف باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية أو صور FM التي تم الحصول عليها في وضع الاتصال.

بعد تجفيف العينات بتدفق النيتروجين ، قبل التصوير ، حدد سمك ما لا يقل عن 10 ألياف لكل صورة لتحديد متوسط سمك الليف. باستخدام برنامج Image J بعد تجفيف أفلام الكولاجين متعددة الطبقات ثنائية الطبقات من الكولاجين ألجينات 24 ، يمكن بعد ذلك تحديد سمك الأغشية عن طريق اختبارات الخدش. باستخدام FM أولا ، استخدم إبرة حقنة لخدش الفيلم بعد توطين الخدش بمجهر ضوئي ، واحصل على صور بتردد FM على أسطح ميكرون مربعة 10 × 10 عند حدود الخدش.

احسب الارتفاعات من ملفات التعريف التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج A FM ، والذي يوفر سمك طبقة الفيلم. بعد زرع الجهاز في القصبة الهوائية للأرانب كما هو موضح في النص ، احصل على عينات دم من الأوردة الأذنية ، وقم بالطرد المركزي للعينات عند 5 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. استخدم المادة الطافية التي تم الحصول عليها للتحليل بعد استخراج بلازما الأرانب مع 0.1٪ من حمض الخليك تريور.

قم بإجراء تنقية HPLC في المرحلة العكسية لمحتوى بروتين البلازما عن طريق تنقية المستخلص باستخدام عمود المرحلة العكسية لخلية النواة 305 C 18. سجل الامتصاص عند 214 و 280 نانومتر باستخدام نظام المذيبات ومعدل التدفق الموجود في بروتوكول النص. اجمع أجزاء الذروة قبل تركيزها من خلال التبخر.

باستخدام تطبيق الفراغ السريع ، من المهم إيقاف فراغ السرعة قبل الجفاف الكامل. ربط القمم التي تم الحصول عليها في نقاط زمنية مختلفة على مدار فترة الزرع. استخدم الببتيدات المنقاة التي تظهر اتجاهات ثابتة أثناء عملية الزرع لتحديد هويتها عن طريق تسلسل إدموند التلقائي.

قم بتحميل العينة على مرشحات الألياف الزجاجية المعالجة بالدماغ المتعدد لتحديد التسلسل الطرفي النهائي للببتيدات المنقاة عن طريق تحلل إدموند التلقائي باستخدام جهاز تسلسل دقيق احترافي. الخطوة التالية هي تحديد الفينيل و واحد من الأحماض الأمينية عن طريق الكروماتوغرافيا على عمود C 18. بعد الحصول على التسلسل ، يمكن التعرف عليه بواسطة برنامج الانفجار باستخدام قاعدة بيانات Swiss Prote.

من خلال تغيير تركيز محلول PLLA ، من الممكن التحكم في حجم المسام على الجانب اللمعي الإضافي من الغرسات. تأثر حجم المسام وشكلها بشكل كبير بوجود غرسات التيتانيوم. تراوحت أحجام المسام من 40 إلى 100 ميكرومتر مع استخدام تركيزات أقل مما أدى إلى مسام أصغر ، في حين أن حجم المسام الجانبية داخل اللمعة كان محكوما بالاستخراج المقيد وكان حوالي تسعة ميكرون ، وهو أقل من متوسط حجم الخلايا الليفية.

عن طريق إضافة خطوة حضانة في درجة حرارة الغرفة ، يمكن الحصول على هياكل مسامية مزدوجة حيث يكون لجدران المسام الكبيرة مساميتها الخاصة. هذه الميزة مهمة للغرسات السميكة لأنها ستسهل حركة الغازات والمغذيات. بعد تشكيل تدرج المسام ، من الممكن إضافة طبقة فيلم ألجينات الكولاجين أعلى الهيكل.

طبقة الفيلم هذه مستقرة فوق رغوة PLLA ويمكن أيضا الحفاظ عليها على السطح في حالة عدم وجود شكل ألياف الكولاجين النانوية الرغوية. مع نمو طبقة الفيلم ، يكون نمو الفيلم أسيا. وبالتالي ، يمكن الحصول على فيلم سميك من عدة مئات من النانومتر.

تتكامل غرسات التيتانيوم المسامية مع الأنسجة المضيفة ويتم ملؤها بالكامل بين أربعة وستة أسابيع في الجسم الحي ، كما هو موضح في المقاطع العرضية للغرسة المزروعة. الأنسجة الموجودة داخل المسام عبارة عن نسيج ضام ناضج بمستوى جيد من الأوعية الدموية. خلال هذه الفترة ، أظهر تحليل HPLC قمم مميزة تتقلب خلال المسار الزمني للزرع.

تم تسلسل أجزاء الذروة ذات الأهمية وتحديدها على أنها سلاسل نصف هيموجلوبين ألفا وبيتا ، والتي أظهرت اتجاها مشابها مع قراءات البروتين التفاعلي C. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء هذه التقنية في يوم واحد إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج تدرجات PO ثلاثية الأبعاد متعددة النطاقات لتعديل الغرسات المعدنية وتجارب زراعة الخلايا.

يعد الاستخراج بالتجميد والطبقة عن طريق تكوين الفيلم معادن بسيطة لتطوير الغرسات المعدلة أو البيئات الدقيقة للخلايا.