التوليف، تسليم الخلوية و في الجسم الحي تطبيق مجسات درجة الحموضة مقرها Dendrimer-

الهدف العام من التجربة التالية هو تطوير مستشعرات فلورية جديدة تعتمد على عازفي طبول Dun مع خصائص محسنة لتصوير الأس الهيدروجيني في المختبر في الخلايا الحية وفي الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق اقتران الأصباغ الحساسة للأس الهيدروجيني أولا بسقالة شجيرية مع شقوق أخرى ، مثل مجموعات الاستهداف أو الأس الهيدروجيني في الأصباغ الحساسة. ويتم أخذ القياسات في المختبر لإنشاء منحنى معايرة الأس الهيدروجيني بجوار درجة الحموضة للصورة في الخلايا الحية.

يتم تسليم المستشعر عن طريق التثقيب الكهربائي ويتم إنشاء خرائط الأس الهيدروجيني باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتصوير الأس الهيدروجيني في الفضاء خارج الخلية في الدماغ. أثناء النشاط العصبي الفسيولوجي والمرضي ، يتم حقن المستشعر بشكل دقيق في دماغ الفئران المخدرة. ثم يتم الحصول على بيانات التألق باستخدام اثنين من المجهري الفوتون.

تظهر النتائج التي تم الحصول عليها أن المستشعرات القائمة على الحمامات تنجح في قياس تغيرات الأس الهيدروجيني بدقة مكانية وزمانية عالية ، سواء في الخلايا الحية أو في الجسم الحي. على الرغم من استخدام العديد من أصباغ المداخن ذات السلوك الحساس لدرجة الحموضة بالفعل ، إلا أنها تعاني من العديد من العيوب ، مثل ضعف الحركة وتسرب الخلايا. علاوة على ذلك ، فإنها لا تسمح بالقياس المطلق المتري الطفح الجلدي

لقد أظهرنا هنا ارتباط الأصباغ الحساسة للأس الهيدروجيني بالسقالة الجينية D ، وبما أن الأداء يسمح بقياس دقيق بدقة خاصة وزمنية ، يمكن أن تكون هذه الطريقة أداة مفيدة لدراسة العملية الفسيولوجية والمرضية التي ينظمها الرقم الهيدروجيني في الخلايا الحية. يرتبط الاضطراب في تنظيم الأس الهيدروجيني في الجهاز العصبي بالعديد من الحالات مثل السكتة الدماغية والصرع ، وقد أثبت مستشعر الأس الهيدروجيني المتاح أنه ضعيف الفعالية مما أدى إلى تصميم المستشعر المقدم. على الرغم من أن هذا قد تم تطبيقه هنا تصوير الأس الهيدروجيني ، إلا أنه نهج عام ويمكن تطبيقه على الأنواع البيولوجية الأخرى ذات الصلة.

من خلال اختيار صبغة استشعار الربح ، فإن النهج الاصطناعي السهل والمتعدد الاستخدامات يجعل هذه الإجراءات مباشرة. ويوضح الإجراء اليوم هو جيوفاني ري, باربرا تي, ماركو برودي, وسيباستيان سولي لاقتران مؤشرات الأس الهيدروجيني إلى بيام ديمرز. ابدأ بإذابة الحاجز في DMSO اللامائي بتركيز نهائي يبلغ 50 ميكرومولار.

قم بإعداد 10 محاليل مخزون ميكرومولار من الفلورسين NHS و Tetraethyl RUMINE NHS ، المعروف أيضا باسم TMR في اللامائي ، DMSO في أنبوب طرد مركزي صغير مجتمعة ، مليلتر واحد من محلول مزيل G four peram مع ثمانية مكافئات ، أو 40 ميكرولتر من الفلورسين وثمانية مكافئ ، أو 40 ميكرولتر من TMR. ستعكس النسبة المولية في الخليط كمية الأصباغ المحملة على الدمر. قلب المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة.

بعد ذلك ، قم بتخفيف الخليط من واحد إلى 10 بالماء منزوع الأيونات وقم بتحميل خليط التفاعل في كيس غسيل الكلى بقطع الوزن الجزيئي 10 كيلو دالتون للغسيل الكلى ضد الماء منزوع الأيونات واستبدال الماء في الخزان ثلاث مرات خلال 24 ساعة. في اليوم التالي ، انقل المحلول إلى قارورة زجاجية وقم بتجميده عند 80 تحت الصفر لبضع ساعات. عندما يتم تجميد المحلول تماما ، انقل القارورة إلى مجفف بالتجميد وتجفيفها لمدة 24 ساعة.

يجب الحصول على مسحوق أرجواني ، والحصول على مادة صلبة متموجة ، وإذابته في ماء mqe. بتركيز نهائي من 10 ميكرومولار. قم بتوزيع المحلول في 50 ميكرولتر في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.

للمعايرة في المختبر ، قم بإعداد محلول 500 نانومولار من D Drummer في اثنين من PBS المليمولي في طبيب بيطري كوارتز كيو. يتم استخدام مخزن مؤقت PBS مخفف للغاية لتجنب التغيرات المفاجئة في الأس الهيدروجيني أثناء المعايرة بالتحليل الحجمي. قم بقياس أطياف انبعاث الفلورسين و TMR وتحسين الإعدادات البصرية لمقياس الفلور لتحقيق نسبة إشارة جيدة إلى الضوضاء.

بعد ذلك، قم بإجراء معايرة الأس الهيدروجيني عن طريق إضافة كميات صغيرة من 0.1 هيدروكسيد الصوديوم العادي و0.1 حمض الهيدروكلوريك العادي. بعد كل إضافة ، رج الطبيب البيطري Q للخلط. انتظر دقيقة واحدة حتى يتم التوازن ثم قم بقياس الرقم الهيدروجيني عن طريق الرقم الهيدروجيني.

يجب تسجيل أطياف انبعاث الأقطاب الكهربائية الدقيقة من الفلورسين و TMR لكل خطوة دون أي تغيير. في الإعدادات البصرية ، ارسم شدة التألق مقابل الرقم الهيدروجيني. بالنسبة للمعايرة بالتحليل الحجمي ، يجب ألا تتأثر إشارة دومين القضيب بدرجة الحموضة.

يجب أن تكون إشارة الفلورسين منحنى سيني ويجب أن تكون مزودة بنموذج ربط واحد مع PK 6.4 للتثقيب الكهربائي. انقل ستة مرات 10 إلى خلايا هيلا الخامسة في 72 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر إلى الخلايا المعلقة. أضف التغصنات أو المحلول المائي بتركيز اثنين من الضرس الصغير ، أضف ثلاثة ملليلتر ، مخزن مؤقت للتثقيب الكهربائي إلى أنبوب تنقية دقيقة.

ثم باستخدام طرف التثقيب الكهربائي سعة 10 ميكرولتر ، قم بشفط الخلية ومخاليط الحافة. بعد ذلك ، أدخل الماصة الدقيقة في محطة الماصة واضبط ظروف نبضة التنقية الدقيقة هنا. يتم ضبط جهد النبض على 1005 فولت.

يتم ضبط عرض النبضة على 35 مللي ثانية ، ويتم ضبط رقم النبضة على اثنين بعد لوحة النبض. 20 ميكرولتر من الخلايا المكتبسة بالكهرباء على أطباق ذات قاع زجاجي مع وسط طازج بدون مضادات حيوية. بعد 12 ساعة من التثقيب الكهربائي ، قم بتصوير الخلايا بمجهر متحد البؤر باستخدام مجموعة مرشح قياسية للفلورسين و r domine.

ركز على العينة واضبط طاقة الليزر وكسب الكاشف لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. إذا نجحت التثقيب الكهربائي ، فيجب أن تكون الخلايا فلورية زاهية في كلتا القناتين. يعتمد التوطين على حجم وشحنة D يتم استخدامها. غالبا ما.

التوطين الليزوزومي الشمسي ، والذي ينظر إليه على أنه حويصلات صغيرة حول النواة موجود بسبب الالتقام الخلوي أو التجزئة. إذا كان التوطين الليزوزومي هو السائد حيث يتم توطين معظم التألق داخل الحويصلات ويلاحظ إشارة المسام في العصارة الخلوية. هذا يدل على السمية ويجب التخلص من القياسات.

احصل على القناتين بالتتابع ، واحصل على العديد من الصور ومتوسط الصور لتحسين جودة الصورة. لإنشاء منحنى معايرة الأس الهيدروجيني ، استخدم المخازن المؤقتة مع opfor عند درجات هيدروجيني مختلفة لتجميع الأس الهيدروجيني داخل الخلية وخارجها بنفس القيمة. احصل على ما لا يقل عن 20 صورة خلية لكل درجة حموضة وقم بقياس خمس نقاط على الأقل من الرقم الهيدروجيني 5.5 إلى الرقم الهيدروجيني 7.5.

يذكر أن درجة الحموضة B ستة سامة للخلايا ولكن يمكن تحملها لفترة قصيرة من الوقت ، لذا احصل على الصور في أقصر وقت ممكن. إذا رأيت علامة موت الخلايا المبرمج ، فتخلص من الخلايا وأعد تشغيلها. بعد الاستحواذ.

استخدم الصورة J أو برنامج مماثل لتحليل البيانات. أولا ، حدد النسبة الخضراء إلى الحمراء. ثم ارسم النسبة مقابل الأس الهيدروجيني لإنتاج اتجاه خطي يعطي منحنى معايرة يمكن استخدامه لتحويل النسبة إلى الأس الهيدروجيني في التجارب المستقبلية.

لتحضير العينة في الجسم الحي ، ابدأ ب C 57 Black six J وإناث الفئران بين اليوم 28 و 70 بعد الولادة. بعد تخدير الفئران باليوريثان ، قم بإجراء قرصة إصبع القدم للتأكد من أن مخدر تماما وقم بتطبيق مرهم العين لتقليل استجابة الإجهاد القشري والوذمة الدماغية. أثناء الجراحة, حقن ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم من ديكساميثازون, فوسفات الصوديوم في العضل.

بعد ذلك ، باستخدام المقصات الجراحية ، احلق رأس ، ثم ضع ستارة جراحية وقم بتطبيق جل ليدوكائين بنسبة 2.5٪ على فروة الرأس. استخدم المقص لقص سديلة الجلد التي تغطي جمجمة نصفي الكرة الأرضية. اغسل العظم المكشوف بالمحلول الملحي والملقط ، وقم بإزالة السمحاق برفق.

سيوفر هذا سطح التصاق أفضل. بالنسبة للغراء والأسمنت للأسنان ، قم بتطبيق عمود رأس فولاذي مصنوع خصيصا مع غرفة تصوير مركزية وباستخدام cyanoacrylate ، قم بلصقه في مكانه في مكان عادي مواز تقريبا للجمجمة فوق المنطقة القشرية محل الاهتمام. ثبت العمود في مكانه باستخدام أسمنت الأسنان الأبيض.

قم بإصلاح رأس الماوس وإجراء بضع قحف بقطر من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات عن طريق الحفر فوق منطقة الاهتمام. في كثير من الأحيان طوال عملية الحفر ، يستخدم حقنة لتطبيق السائل الدماغي النخاعي المعقم الطازج على الجمجمة لتقليل تسخين القشرة أثناء الجراحة. بعد بضع القحف ، انقل إلى مرحلة التصوير لإبقاء الرأس ثابتا تحت الهدف.

قم بربط غرفة التصوير بالعمود القابل للتعديل. ضع كمامة بلاستيكية مخصصة متصلة بالأكسجين. سيوفر هذا هواء غني بالأكسجين أثناء التجربة للمساعدة في تنفس.

لحقن المستشعر في قشرة الدماغ، قم بتحميل ماصة زجاجية يبلغ قطرها أربعة ملليمترات وقطب كهربائي من كلوريد الفضة. باستخدام محلول ER للحفارة الدقيقة ، سيسهل القطب تسجيل إمكانات المجال خارج الخلية مع إعداد الحقن المجهري. أدخل الماصة في القشرة على عمق 150 ميكرون تقريبا.

حقن لمدة دقيقة إلى دقيقتين عند ضغط 0.5 رطل لكل بوصة مربعة لتحسين الإعداد البصري للتصوير. اضبط طاقة الليزر لتقليل تبييض الصور وتلف الصورة. عادة ما تكون طاقة الليزر المستخدمة حوالي 20 مللي واط ، ويتم الحفاظ على كسب PMT ثابتا عند 667 فولت.

اضبط الطول الموجي لليزر لإثارة المستشعر على 820 نانومتر وقم بتوجيه البرنامج للكشف عن فلورسين ومضان قضيب الدومين في وقت واحد من خلال مرشحات FTSE و trit القياسية. قم أيضا بتعيين تردد الاستحواذ على معدل إطارات قدره اثنين هرتز لتصحيح الخلفية. احصل على إطار داكن مع إغلاق غالق الليزر لقياس متوسط الضوضاء الحرارية الناشئة في PMTs والقاعدة.

أخيرا ، احصل على صور مضان تعتمد على الأس الهيدروجيني وقم بتخزينها للتحليل اللاحق. قم بتحليل البيانات كما كان من قبل لتقييم السلوك المختبري للفلورسين والرومين. تم إجراء معايرة الأس الهيدروجيني التي تم تحميلها على الميكرومتر باستخدام مقياس الفلور.

يوضح هذا الشكل معايرة نموذجية لمستشعر الأس الهيدروجيني. يمكن إثارة الفلورسين والكرم بشكل منفصل عند 488 نانومتر و 550 نانومتر على التوالي ، مما يسمح بالحد الأدنى من الحديث المتبادل بين القناتين كما يمكن رؤيته بوضوح. يظهر الفلورسين سلوكا يعتمد على الأس الهيدروجيني بينما لا تتغير إشارة الرقم الهيدروجيني R بشكل كبير في نطاق الأس الهيدروجيني الفسيولوجي.

لذلك ، لا تعتمد نسبة هاتين الإشارتين على تركيز المستشعر ، ولكن فقط على الأس الهيدروجيني. بعد ذلك ، تم توصيل المؤشر ، تم تزويد خلايا hela داخل الخلايا بالكهرباء باستخدام مستشعرات إزالة الحشرات وتم إجراء التصوير متحد البؤر كما هو موضح في هذا الفيديو. تظهر هذه الصور متحدة البؤر الخلايا الموجودة في قناة الفلورسين على اليسار ، وقناة R domine في المنتصف ، ويتم عرضها كخريطة مترية لنسبة الأس الهيدروجيني على اليمين.

لوحظت إشارات قوية من الفلورسين و r domine ، والتي تشارك في توطينها مما يدل على سلامة هيكل المستشعر. يتم إعادة بناء خريطة مقياس النسبة بقسمة الصورتين بكسل على بكسل ويتم تمثيلها بمقياس ألوان زائف. لمعايرة استجابة المستشعر داخل الخلايا ، تم إجراء تثبيت الأس الهيدروجيني باستخدام الأيونوفورات كما هو موضح هنا.

تستجيب المؤشرات بسهولة لدرجة الحموضة مع تغيير النسبة الخضراء إلى الحمراء. تم استخدام البيانات الناتجة لإنشاء منحنى معايرة لقياسات الأس الهيدروجيني الدقيقة. يوضح الاتجاه الخطي في المعايرة قدرة المستشعر على الاستجابة لدرجة الحموضة دون أي اضطراب من البيئة الخلوية.

لتوضيح كيفية استخدام المستشعرات القائمة على التغصنات للتصوير في الجسم الحي ، تم إجراء تصوير الأس الهيدروجيني في دماغ التغصنات أو الفأر المخدر المحقون. تم الحصول على إشارات الفلورسين و r domine في وقت واحد مع إثارة 820 نانومتر ، وتم بناء خريطة النسبة على أساس بكسل تلو الآخر على غرار قياسات الخلايا الحية. والجدير بالذكر أن المؤشرات مترجمة في الفضاء خارج الخلية ، حيث تحدد المناطق غير الفلورية في الصورة الأجسام الخلوية أو الأوعية الدموية الصغيرة للتحقق من استجابة المستشعر لدرجة الحموضة.

استخدمنا استخدام فرط الوقوف. في الواقع ، من المعروف أن ثاني أكسيد الكربون يغير توازن مخازن الكربونات في الدم والأنسجة مما يؤدي إلى تحمض الأنسجة. كما هو موضح في هذه المؤامرة ، فإن استنشاق 30٪ من ثاني أكسيد الكربون يكفي للحث على استجابة قوية للمستشعر يمكن عكسها تماما عند تهوية دورة الماوس.

توضح هذه النتائج إمكانية أجهزة الاستشعار القائمة على الرقم الهيدروجيني لتسليط الضوء على التغيرات الفسيولوجية والمرضية لدرجة الحموضة في الخلايا الحية وفي الجسم الحي. أ ، إجراءنا متوافق مع القياسات الأخرى مثل التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية. سمح ذلك بتحقيق معلومات تكميلية في وقت واحد حول العملية البيولوجية الجارية.

مهدت هذه الطريقة ، بعد تطويرها ، الطريق للباحث في بيولوجيا الخلية والبيولوجيا العصبية لاستكشاف العمليات المنظمة للأس الهيدروجيني في الخلايا المزروعة وفي الجسم الحي.