كله جبل تلوين مناعي للشبكية الفأر حديثي الولادة المعنية بالتحقيق في الأوعية الدموية في الجسم الحي
July 9th, 2013
يوفر شبكية العين الفئران حديثي الولادة نموذجا الفسيولوجية تتميز كذلك من الأوعية الدموية، والذي يسمح التحقيقات عن دور الجينات المختلفة أو الأدوية التي تعدل الأوعية الدموية في في الجسم الحي السياق. تلوين مناعي لتصور بدقة الضفيرة الوعائية هي محوريا في نجاح هذه الأنواع من الدراسات.
الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في تكوين الأوعية الدموية في شبكية الفئران الوليدية. يتم تحقيق ذلك عن طريق نواة عيون ما بعد الولادة أولا ، ثم تطبيق مثبت للخطوة الثالثة هو تشريح شبكية العين بعد الولادة بعناية إلى شكل بتلة ، والخطوة الأخيرة هي تلطيخ الأوعية الدموية في الشبكية. في النهاية ، يتم تحقيق تصور الأوعية الدموية لشبكية العين في الفأر من خلال تلطيخ الفلورسنت والفحص المجهري متحد البؤر.
سيوضح هذا الإجراء الدكتور سيمون تلو ، وهو ما بعد الدكتوراه في مختبري ، وكاثلين ألينسون ، عضو سابق في مختبري. خلال هذا الإجراء ، تكون درجة الحرارة الافتراضية هي درجة حرارة الغرفة. ابدأ بوضع جرو فأر مقتول إنسانيا على جانبه بالمقص.
إزالة الجلد الذي يغطي العين. بعد ذلك ، مع وضع المقص أسفل العين ، قم بقطع العصب البصري والأنسجة المحيطة به وارفع العين. انقل العين المنزوعة إلى صفيحة 24 بئرا تحتوي على مثبت ، وهو 4٪ PFA في مرتين.
يشرع PBS في تشريح العين التالية أثناء وجود واحدة في التثبيت. سيكون التأرجح بين تشريح العينين نصف دقيقة. مع الممارسة.
اسمح لكل عين بالثبات لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم انقلها إلى البرد مرتين PBS على الجليد لمدة خمس إلى 10 دقائق على الأقل. قبل عزل شبكية العين ، اجمع أكبر عدد ممكن من العيون في PBS حسب الرغبة ، باستخدام ماصة المراعي البلاستيكية التي تم قطعها لتوسيع الخنزير.
انقل العينين إلى طبق بتري يحتوي على مرتين PBS تحت مجهر تشريح. قم بإزالة أي دهون حول العين باستخدام الملقط والمقص. اخترق حافة القرنية بمقص حاد وقطع حول القرنية والقزحية ، وتخلص من هذه الأنسجة.
بعد ذلك ، أدخل الملقط بين شبكية العين والصلبة. قم بإزالة الصلبة مع الحرص على عدم تمزق الشبكية. يمكن أيضا إزالة الطبقة المشيمية طالما لا يوجد خطر إتلاف شبكية العين.
يجب ألا يؤثر ترك طبقة المشيمية بشكل كبير على جودة التلوين المناعي. الآن باستخدام الملقط ، قم بإزالة العدسة والفكاهة الزجاجية. اتبع إزالة أوعية الصبار.
استخدم ملقطا دقيقا لتجميعها معا في وسط العين. ثم اسحبهم بسرعة بعيدا عن مركز شبكية العين. توخي الحذر الشديد لإزالة كل الشوك الأصفر لأنه إذا تركت بعضا من الركب ، فقد يحجب نتائج الوقوف.
يجب الآن نقل شبكية العين على شكل كوب إلى طبق بتري نظيف وشطفها نظيفة باستخدام PBS. الآن في شبكية العين. قم بعمل أربعة إلى خمسة شقوق شعاعية تصل إلى حوالي ثلثي الطريق نحو المركز.
استخدم مقص زنبركي لإنشاء شبكية العين على شكل دواسة. هذه الخطوة تتطلب الصبر والممارسة حتى تتقن. الآن اسحب معظم PBS باستخدام ماصة المراعي.
سيؤدي ذلك إلى تسطيح شبكية العين. ثم قم بإزالة أي PBS زائد بقطعة صغيرة من الورق الماص. بعد ذلك ، ضع الميثانول تحت الصفر 20 درجة قطرة قطرة على سطح شبكية العين حتى يتم غمرها في الغالب ، ثم أضف الميثانول بحرية.
سوف تتحول شبكية العين إلى اللون الأبيض. تساعد هذه الخطوة في إصلاح شبكية العين وستسهل التغلغل. انقل شبكية العين في الميثانول البارد إلى أنبوب صغير.
باستخدام ماصة بلاستيكية واسعة التجويف. اسمح لهم باحتضان الميثانول البارد لمدة 20 دقيقة على الأقل إذا لزم الأمر ، يمكن أن تبقى شبكية العين في الميثانول عند 20 درجة تحت الصفر لعدة أشهر. استخدام الجسم المضاد هنا فقط.
لا يمكن استخدام السينما بنجاح على شبكية العين الثابتة للأمهات. في هذه الحالة ، تحتاج شبكية العين إلى المضي قدما مباشرة في التلوين المناعي بعد تسطيحها إلى شكل بتلة. ابدأ بسحب الميثانول بعناية من شبكية العين.
ثم اشطف شبكية العين سريعا ولطيفا في مرة واحدة PBS. قم بإزالة PBS وقم بتغطية شبكية العين ب 100 ميكرولتر من محلول كتلة التجعيد مع 5٪ من المصل المناسب. اضبطي شبكية العين على الاهتزاز برفق لمدة ساعة بعد ذلك.
قم بإزالة محلول كتلة التجعيد بماصة واستبدله ب 100 ميكرولتر من محلول كتلة التجعيد الذي يحتوي على الجسم المضاد الأساسي أو يتم اختياره من قبل. ثم اضبط شبكية العين على الحضانة طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع التأرجح في صباح اليوم التالي. اغسل شبكية العين أربع مرات في PBS TX لمدة 10 دقائق لكل غسلة.
ضعي هزازا لطيفا أثناء جميع خطوات الغسيل. إذا كان الجسم المضاد الأساسي غير مترافق ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي الفلوري المناسب ، المخفف من واحد إلى 200 في PBS tx. احتضان شبكية العين طوال الليل عند أربع درجات مئوية أو لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف لإزالة الجسم المضاد الثانوي.
اغسل شبكية العين أربع مرات في PBS TX مع هزاز لطيف لمدة 15 دقيقة لكل غسلة. الآن تابع التركيب. انقل شبكية العين إلى شرائح باستخدام ماصة بلاستيكية عريضة التجويف وقم بإزالة أي فائض من P-B-S-T-X بمنديل ورقي.
ثم قم بتركيب شبكية العين في 50 ميكرولترا من الذهب المطول وقم بتغطية المحلول برفق بقلة غطاء. للسماح للذهب المطول de مجموعة قم بتبريد الشرائح طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، محمية من الضوء في اليوم التالي. استمر في تصوير شبكية العين بعد التشريح.
يجب أن تبدو شبكية العين وكأنها زهرة مسطحة باستخدام ISO selectin B four Alexa 4 88. كانت الخلايا البطانية ملطخة وتظهر باللون الأخضر. تم تصور خلايا العضلات الوعائية الداعمة باستخدام العضلات الملساء أنتيفا ، وعرض الطاقة المنخفضة باستخدام هدف خمس مرات ، مما سمح بنظرة عامة على تنظيم الأوعية الدموية لشبكية العين باستخدام مجموعة مختلفة من الأجسام المضادة.
يمكن رؤية الخلايا البطانية باستخدام تلطيخ مناعي مضاد للقرص المضغوط 31 ، مما يدعم الطفيليات حيث يتم تصورها باستخدام جسم مضاد ضد NG two. بدلا من ذلك ، تم تلطيخ الطفيليات الداعمة بمضاد للدسمين. يصور التلوين المضاد للديسمين العمليات الشبيهة بالأصابع للطفيليات ويساعد في تحديد ما إذا كانت مرتبطة ارتباطا وثيقا بالخلايا البطانية.
في المقابل ، يحدد التلوين المضاد ل NG نوى كل طفيلي ، وهو أمر مفيد عند تحديد عدد الخلايا الطفيلية في الأوعية الدموية. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر تجنب لمس سطح الشبكية وإتلافه باستخدام أدوات التشريح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طريقة أخرى مثل تلطيخ BD من أجل التحقيق في تكاثر خلايا معينة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تبحث هذه الإجراء في تكوين الأوعية الدموية في شبكية العين للفأر حديث الولادة، وهو نموذج متميز لدراسة تطور الأوعية الدموية. يتضمن ذلك تشريحًا دقيقًا وتلوينًا لشبكية العين لتصوير تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تكوين الأوعية الدموية
- تطور الشبكية
الخلفية
- إن شبكية عين الفأر حديث الولادة هي نموذج مثبت لدراسات تكوين الأوعية الدموية.
- فهم أدوار الجينات والعقاقير في تكوين الأوعية الدموية أمر حاسم للتطور العلاجي.
- التلوين المناعي الفلوريسنسي ضروري لتصوير الشبكة الوعائية.
- يسمح هذا النموذج بتحقيقات في الجسم الحي لتعديل الأوعية الدموية.
هدف الدراسة
- لدراسة آليات تكوين الأوعية الدموية في شبكية عين الفأر حديث الولادة.
- لتصوير شبكية العين الوعائية باستخدام تقنيات التلوين الفلوريسنسي.
- لعرض الإجراء لتطبيقات البحث المستقبلية.
الطرق المستخدمة
- استخراج عيون ما بعد الولادة من صغار الفئران.
- تطبيق مادة مثبتة للحفاظ على بنية الأنسجة.
- تشريح الشبكية إلى شكل بتلة للحصول على تلطيخ مثالي.
- استخدام التصوير المجهري المجسم لتصوير الشبكة الوعائية الملطخة.
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح للشبكة الوعائية للشبكية.
- عرض عملية تكوين الأوعية الدموية في بيئة خاضعة للرقابة.
- رؤى حول تعديل تكوين الأوعية الدموية بواسطة عوامل مختلفة.
- إنشاء طريقة موثوقة للدراسات المستقبلية.
الاستنتاجات
- تعمل شبكية عين الفأر حديث الولادة كنموذج فعال لأبحاث تكوين الأوعية الدموية.
- التلوين الفلوريسنسي والتصوير المجهري المجسم ضروريان لتصوير الهياكل الوعائية.
- يمكن لهذا الإجراء المساعدة في فهم التأثيرات الجينية والصيدلانية على تكوين الأوعية الدموية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
The neonatal mouse retina model enables mechanistic interrogation of angiogenic pathways critical for target validation in vascular disease research. Fluorescent staining of vascular structures provides quantitative, reproducible readouts that support preclinical de-risking of anti-angiogenic candidates. This approach bridges discovery biology with translational decision-making by visualizing vascular plexus formation in a disease-relevant, 2D-confined system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of angiogenic targets through direct visualization of endothelial and perivascular cell dynamics.
- Operational Value: Standardized whole-mount preparation supports consistent vascular plexus quantification across experimental conditions.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic or pharmacological modulation to vascular sprouting phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent isolectin and antibody staining generates standardized, multiplexable readouts for vascular density and branching analysis.
- Quantitative Output: Confocal imaging enables morphometric quantification of vascular plexus parameters essential for hit validation.
- Scalability: Whole-mount format allows parallel processing of multiple retinas for dose-response or time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathological angiogenesis relevant to ischemic retinopathy and tumor vascularization.
- Translational Continuity: Supports progression from target hit validation to preclinical efficacy testing in vascular modulation studies.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of vascular readouts with downstream functional outcomes such as perfusion or leakage.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing angiogenic phenotype data that informs target selection and lead optimization prior to in vivo efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic regulators through direct visualization of vascular network formation.
- Screening: Generates standardized, imaging-based vascular metrics for compound effect assessment in angiogenesis-focused assays.
- Analytics: Delivers quantitative vascular parameters (density, branch points, vessel area) that enable inter-group comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects mechanistic angiogenesis data to preclinical models of vascular disease through conserved molecular pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis-inducing or -suppressing conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, visual evidence of vascular modulation.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized dissection, staining, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early vascular phenotype data that predicts later-stage efficacy in angiogenesis-dependent models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of angiogenic targets based on functional vascular outcomes in a physiologically relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal tissue dissection and whole-mount preparation to preserve retinal integrity.
- Dependent on confocal microscopy and fluorescent imaging infrastructure for high-resolution vascular visualization.
- Necessitates standardization of staining protocols and antibody validation across users and sites.
- Adaptation to alternative models may require optimization of dissociation and staining conditions due to retinal-specific architecture.
- Practical limitations include tissue fragility during dissection and potential antibody penetration challenges in thicker preparations.
