حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور الهياكل تحت الخلوية في الغدد اللعابية في الفئران. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعريض الغدد اللعابية جراحيا أولا دون إتلافها. في الخطوة الثانية ، يتم تجميد المخدر في مرحلة المجهر.

بعد ذلك ، يتم وضع الغدد اللعابية بعناية حتى لا تضر بوظيفتها في الخطوة النهائية. يتم تثبيت الماوس بحامل مخصص لتقليل أي قطع أثرية متحركة بسبب نبضات قلب أو تنفسه. في النهاية ، يمكن تصوير ديناميكيات الهياكل تحت الخلوية عن طريق الفحص المجهري الحيوي الداخلي.

قبل التخدير ، قم بوزن الفئران لتحديد الجرعة المناسبة من التخدير. بعد ذلك ، قم بتحفيز التخدير المسبق عن طريق استنشاق الفلور. بمجرد أن تفقد الوعي ، تأكد من التخدير كل 15 دقيقة عن طريق قرصة فرقعة واحتفظ بالفئران تحت مصباح الحرارة طوال مدة الجراحة.

راقب درجة حرارة جسم باستخدام مقياس حرارة مسبار المستقيم. الآن احلق عنق الماوس باستخدام زوج من المقصات الكهربائية ، ثم استخدم إسفنجة شاش مبللة بالإيثانول لمسح الجانب البطني من الرقبة ، وتجفيف الكحول الزائد بمنديل كيم. بعد ذلك ، استخدم زوجا من الملقط المنحني الباهت لرفع قطعة صغيرة من الجلد في الطرف السفلي من عضلات المداس وعمل شق صغير.

أدخل المقص في الشق ، ووجه الأطراف لأعلى نحو الجانب السفلي من الجلد وافتح الشفرات عدة مرات حتى ينفصل الجلد عن الأنسجة الأساسية. ثم ابدأ بالقرب من قاعدة الغدد اللعابية حيث تربط القناة العصبية والأوعية الدموية الغدة ببقية الجسم. استخدم المقص لقص شريط من الجلد المترهل بعرض ثلاثة ملليمترات وطول 10 ملليمترات.

بعد تنظيف منطقة الجرح ، ستكون الفتحة الناتجة بيضاوية الشكل ويبلغ قياسها حوالي ثمانية × 12 ملم. ستكون كلتا الغدد اللعابية مرئية. استخدم حقنة لتطبيق جل التوصيل البصري في منتصف الجرح ، ثم استخدم قطعا جديدة من الشاش المعقم لمسح الجل باتجاه الخارج من الفتحة حتى تتم إزالة كل الدم والشعر المتساقط.

الآن ، استخدم زوجا من الملقط رقم سبعة للعثور على طرف الغدة اللعابية اليمنى ، مع الإمساك بالنسيج الضام على بعد بضعة ملليمترات فوق الجزء العلوي من الغدة. ثم قم بتمزيق النسيج الضام حول الغدة دون إصابة الحمة. بمجرد تعرض الغدة ، افصل النسيج الضام برفق عن الغدة ، وقم بغسل أي نزيف بالمحلول الملحي.

تأكد من فصل جميع الأنسجة الضامة وتعرض الغدة بالكامل. قبل إحضار إلى المجهر ، ضع قطعة سميكة من الشاش وحزمة حرارية على مرحلة المجهر ، وقم بتغطية الجزء العلوي من العبوة الحرارية بقطعة رقيقة من الشاش أيضا. ضع زلة غطاء فوق منتصف المسرح.

ثم ضع الماوس على جانبه الأيمن أعلى الشاش ، وقم بتأمين بقطعة من الشريط اللاصق على الجانب البطني من المخلب الأيمن الأمامي وخياطة حريرية معلقة حول القواطع. قم بإنشاء بعض التوتر بين الخيط والمخلب وإرفاقهما على المسرح. مع وجود المزيد من الشريط اللاصق ، يجب أن ترتاح الغدة اللعابية بشكل طبيعي.

في منتصف زلة الغطاء. استخدم أسافين بلاستيكية مقترنة بمرحلة المجهر لزيادة استقرار رأس الفأر والصدر. بعد ذلك ، ضع قطعة صغيرة من العدسات لتنظيف المنديل فوق الغدة.

تمديد الغدة قليلا ووضع حامل مخصص على الغدة. ثم بإحكام ، قم بإقران المثبت بالمسرح بمشبك معدني وشريط لاصق. قم بتغطية بشاش ووسادة حرارية وراقب درجة حرارة الغدد المكشوفة باستخدام مقياس حرارة مرن مزود بمسبار حراري مباشرة بعد تثبيت ، استخدم إضاءة التألق epi للتركيز على سطح الغدة.

تقييم تدفق الدم في الشعيرات الدموية والتشكل العام للأنسجة. لإثارة جين GFP ، استخدم ليزر 488 نانومتر. اضبط طاقة الذروة على 0.5 مللي واط لتجنب التبييض الضوئي لبروتين الطماطم الترادفي.

استخدم ليزر 561 نانومتر ، واضبط طاقة الذروة على مللي واط واحد. الآن قم بتقييم استقرار الأنسجة عن طريق المسح المسبق للمنطقة المحددة. إذا لم يكن المستحضر مستقرا ، فاضبط وفقا لذلك للعثور على المستوى البؤري المناسب.

في الوضع المسبق. حرك الهدف تدريجيا نحو زلة الغطاء حتى تصبح هياكل aser والحبيبات الإفرازية وغشاء البلازما مرئية بوضوح. ثم لتصوير ديناميكيات الحبيبات الإفرازية ، استخدم سرعة مسح من 0.5 إلى ثانيتين لكل إطار و 256 × 256 بكسل بمقياس مكاني 0.2 ميكرومتر لكل بكسل.

من أجل تصور الحبيبات وغشاء البلازما على النحو الأمثل ، اضبط السماكة البصرية بين 0.9 إلى 1.2 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بتسجيل صورة لمجال الرؤية لاستخدامها كنقطة مرجعية. أخيرا ، قم بتحفيز إفراز الخلايا عن طريق حقن 0.1 ملليغرام تحت الجلد لكل كيلوغرام من الأيزوبروتيرينول والمحلول الملحي المحضر حديثا.

بعد دقيقة واحدة من الحقن. سيتم الكشف عن اندماج الحبيبات الإفرازية مع غشاء البلازما من خلال زيادة مضان GFP حول الحبيبات وانتشار ببتيد الطماطم الترادفي في أغشيتها المحددة. في فأر الطماطم GFPM ، يظهر الأسينين كهياكل مميزة بوضوح تعبر عن GFP العصاري الخلوي وببتيد الطماطم الترادفي المستهدف بالغشاء كما هو موضح في الخطوط المكسورة.

في الخلايا asinine aser الفردية يتم تحديدها بواسطة ببتيد الطماطم الترادفية كما هو موضح في الأسهم. يتم اكتشاف GFP أيضا في النوى التي يمكن رؤيتها بوضوح داخل خلايا aser. يتم استبعاد GFP العصاري الخلوي المشار إليه بواسطة رأس السهم من الحبيبات الإفرازية التي تظهر على شكل حويصلات دائرية داكنة يبلغ قطرها حوالي واحد إلى 1.5 ميكرومتر.

لتصور الأحداث الغريبة ، تظهر منطقة تمثيلية لغشاء البلازما المخصب بحبيبات إفرازية كما هو موضح في علامة النجمة بعد حقن الأيزوبروتيرينول. يمكن ملاحظة زيادة في مستويات مضان GFP التي يشار إليها بالسهام الخضراء حول بعض الحبيبات الإفرازية التي تقع على مقربة من غشاء البلازما. بالإضافة إلى ذلك ، بعد الاندماج مع غشاء البلازما ، ينتشر ببتيد الطماطم الترادفي في الأغشية المحددة للحبيبات الإفرازية كما هو موضح في الأسهم الحمراء.

بعد 30 إلى 40 ثانية ، تنهار حبيبات السكرتير تدريجيا ويتم دمج أغشيتها المحددة في غشاء البلازما القمي. يمثل النهج المقدم هنا طفرة كبيرة في بيولوجيا الخلية لأنه يتيح تصوير ديناميكيات عملية تهريب أغشية معينة في الفئران الحية.