تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تفاعل البوليميراز المتسلسل هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتضخيم شظايا الحمض النووي. يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التدوير الحراري ، وهو التسخين والتبريد المتكرر للتفاعل عبر ثلاث درجات حرارة مميزة تسمى التمسخ والتلدين والتمدد أو الاستطالة.
يبدأ تفاعل التدوير الحراري بمجرد وضع كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز تدوير حراري ، وهو جهاز مبرمج لتسخين وتبريد التفاعل بدقة.
تبدأ دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتمسخ ، والذي يحدث لمدة 20 إلى 30 ثانية عند 95 درجة مئوية ، أعلى بكثير من درجة حرارة انصهار الحمض النووي. درجة حرارة الانصهار هي حالة يكون فيها نصف الحمض النووي عبارة عن حلزون مزدوج تقطعت بهم السبل والآخر عبارة عن ملف عشوائي واحد مجدول. درجة حرارة التمسخ أعلى بكثير من درجة حرارة الانصهار ، من أجل ضمان كسر جميع الروابط الهيدروجينية بين أزواج القواعد التكميلية مما ينتج عنه الحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل. تسمى الخيوط المفردة المزدوجة خيوط الإحساس والمضادة. تسلسل الإحساس ، أو خيط الترميز ، مطابق لتسلسل mRNA ، والذي سيرمز في النهاية للبروتين. لذلك ، من المنطقي. عند قراءتها من اليسار إلى اليمين ، تبدأ بالفوسفات 5 وتنتهي ب 3 'hydroxyl. يطلق على الخيط المضاد للمعنى أيضا اسم الخيط التكميلي ويبدأ ب 3 'هيدروكسيل وينتهي بالفوسفات 5' عند قراءته من اليسار إلى اليمين.
في الخطوة الثانية ، تلدين ، قطع قصيرة من الحمض النووي تسمى الاشعال ، والتي تكون خاصة بخيوط الإحساس أو المضادة للمعنى ترتبط عبر روابط هيدروجينية. التمهيدي الذي يرتبط بخيط مضاد للمعنى وله نفس تسلسل خيط الإحساس هو التمهيدي الأمامي أو الإحساسي. التمهيدي الذي يرتبط بخيط الإحساس وله تسلسل عكسي ومكمل لخيط الإحساس هو التمهيدي العكسي أو المضاد للحساس. اعتمادا على طول البادئات المستخدمة ، عادة ما تكون درجة حرارة التلدين لهذه الخطوة من 3 إلى 5 درجات مئوية أقل من درجة حرارة الانصهار المنخفضة للبادئات. يميل التلدين إلى الحدوث بين 50 و 65 درجة مئوية ويستمر لمدة 20 إلى 40 ثانية.
بمجرد أن ترتبط البادئات بالحمض النووي ، فإنها تهيئ التفاعل عن طريق إنشاء نهاية مجموعة هيدروكسيل 3 بوصات يرتبط بها البوليميراز ، وهو إنزيم يكرر الحمض النووي.
تحدث الخطوة التالية التي تسمى الاستطالة أو التمدد عند 72 درجة مئوية ، وهو مثالي لنشاط البوليميراز. بمجرد الارتباط ، يبدأ البوليميراز في إضافة ثلاثي فوسفات النيوكليوتيدات الحرة ، أو dNTPs ، إلى نهايات التمهيدي واحدا تلو الآخر في اتجاه 5 إلى 3 لصنع حمض نووي مزدوج تقطعت به السبل.
بمجرد اكتمال الاستطالة ، تبدأ الدورة التالية. في الدورة التالية ، سترتبط البادئات بالحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل والذي تم تشكيله عبر الامتداد السابق. الجزء القصير الذي تحاول تضخيمه ، الضخم ، سيتشكل في النهاية عندما يمتد البوليميراز من التمهيدي الأمامي على خيط تم إنشاؤه عن طريق التضخيم من التمهيدي العكسي أو العكس. بمجرد توليدها ، ستزداد كمية الamplicon بشكل كبير في الدورات اللاحقة. اعتمادا على الهدف من رد فعلك ، ستكون هناك حاجة إلى 20 إلى 40 دورة.
بالنسبة لمكبرات الصوت الطويلة ، عادة ما يتم تشغيل خطوة الاستطالة النهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 5 إلى 15 دقيقة لضمان أن كل الحمض النووي مزدوج تقطعت به السبل. عادة ، تتم برمجة خطوة التثبيت النهائية عند 4 درجات مئوية في جهاز التدوير الحراري كخطوة احترازية لضمان بقاء الحمض النووي مستقرا حتى يتم إخراجه من الدراجة الحرارية.
يتطلب تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل عدة كواشف رئيسية. الأول هو قالب الحمض النووي ، وهو عينة الحمض النووي التي سيتم تضخيم الجزء الخاص بك منها. ثم هناك البادئات الخاصة بك ، وهي القطع القصيرة من الحمض النووي أو قليل النوكليوتيدات التي تهيئ تفاعل البوليميراز.
هناك العديد من الاعتبارات المهمة التي يجب مراعاتها عند اختيار البرايمر الخاص بك. أولا ، يجب أن تكون مكملة للمنطقتين 5 و 3 من قالب الحمض النووي الخاص بك التي تحيط بالتسلسل الذي تريد تضخيمه. ثانيا ، يجب أن يتراوح طولها بين 15 و 30 زوجا أساسيا وأن تتكون من حوالي 50٪ من الجوانين والسيتوزينات. ثالثا ، يجب أن تكون درجات حرارة انصهار كلا البادئات أعلى من 50 درجة مئوية وفي حدود درجة إلى درجتين من بعضهما البعض حتى يتمكنوا من الارتباط بكفاءة في نفس درجة حرارة التلدين. رابعا ، لا يمكن أن تكون مكملة لبعضها البعض وتشكل ثنائيات أولية. وخامسا ، لا ينبغي أن تحتوي على بنية ثانوية ، والتي تتشكل عن طريق التلدين الذاتي داخل أحد البادئات.
بالإضافة إلى البادئات وقالب الحمض النووي ، يعد بوليميراز الحمض النووي ضروريا لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الإنزيم الأكثر استخداما في تفاعل البوليميراز المتسلسل هو Taq polymerase ، وهو إنزيم مقاوم للحرارة معزول من بكتيريا Thermus aquaticus التي تجعل موطنها في الينابيع الساخنة. يمكن أن يتحمل بوليميراز Taq درجات حرارة تزيد عن 90 درجة مئوية.
يجبأيضا إضافة dNTPs ، التي ستتألف من الأزواج الأساسية في الخيوط النامية ، إلى التفاعل. يعد المخزن المؤقت للتفاعل ، الذي يحافظ على درجة الحموضة ويحتوي على أيونات مهمة مثل المنغنيز والمغنيسيوم والبوتاسيوم ، أيضا مكونا ضروريا للتفاعل يعمل على استقرار التفاعل ويوفر عوامل مساعدة مهمة لإنزيم البوليميراز. مثل جميع التفاعلات ، يحتاج تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى مذيب ، وبالتالي يتم استخدام الماء من الدرجة PCR ، وهو خال من الأيونات التي يمكن أن تمنع التفاعل.
قبل البدء في PCR ، تأكد من نظافة بيئة العمل لتجنب التلوث. يجب دائما ارتداء القفازات.
للمساعدة في تتبع مكونات التفاعل المختلفة التي ستحتاجها. قم بعمل جدول بأحجام الكاشف وتركيزاته لكل عينة من عيناتك بما في ذلك عناصر التحكم. من حيث الأحجام ، يجب أن يحتوي التفاعل النموذجي على 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل 10X ، و 4 ميكرولتر من 25 ملي مولار MgCl2 ، و 1 ميكرولتر من dNTPs عند 10 ملي مولار ، و 2 ميكرولتر من البادئات الأمامية والخلفية عند 50 نانوغرام / ميكرولتر ، و 0.3 ميكرولتر من بوليميراز Taq عند 5 وحدة / ميكرولتر. تريد إضافة قالب كاف بحيث يكون 100 نانوغرام موجودا في التفاعل. أخيرا ، يتم إجراء معظم تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل بحجم إجمالي يبلغ 50 ميكرولتر. لذلك يجب استخدام حجم من الماء من فئة PCR لضمان أن الحجم الإجمالي هو بالفعل 50 ميكرولتر.
بمجرد تخطيط رد فعلك على الورق ، قم بتجميع الكواشف على الجليد.
بعد ذلك ، أضف الكواشف الخاصة بك إلى أنبوب PCR. أضف الماء أولا ، ثم القالب الخاص بك ، والبادئات ، والمخزن المؤقت ، وكلوريد المغنيسيوم ، و dNTPs ، أضف بوليميراز Taq أخيرا واخلطه جيدا.
بعد إعداد رد الفعل الخاص بك ، ضع عينتك في جهاز تدوير حراري وابدأ برنامج PCR الخاص بك. باختصار ، تتكون أجزاء الماكينة من كتلة حرارية ، حيث يتم إدخال أنبوب أو لوحة PCR وتخضع لتغيرات دقيقة في درجة الحرارة. غطاء ساخن يمنع التكثيف حتى لا تفقد أي عينة وواجهة مع شاشة لبرمجة درجات حرارة تفاعل البوليميراز المتسلسل ومدد الدورة. قم دائما بإعداد البرنامج الخاص بك قبل تجميع التفاعل.
بمجرد أن يقوم الناقل الحراري بعمله. أخرج رد فعلك وتحقق من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. إذا نجح تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فيجب أن ترى الهامبليكون بحجم الزوج الأساسي الصحيح.
والآن للحصول على بعض التلميحات المفيدة عند العمل مع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). عندما تحاول تضخيم نفس منتج PCR من عدد من القوالب المختلفة وبالتالي لديك الكثير من ردود الفعل المختلفة على الإعداد. من المفيد توسيع نطاق التفاعل لإنشاء مزيج رئيسي. المزيج الرئيسي PCR عبارة عن خليط كبير الحجم من جميع الكواشف المشتركة بين عيناتك ، والتي يتم توزيعها لاحقا في أنابيب تفاعل متعددة.
تبدأ معظم تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل بخطوة التمسخ الأولية ، والتي تحدث عند 95 درجة مئوية لمدة 1 إلى 9 دقائق. تضمن هذه الخطوة أن كل القالب مفرد تقطعت به السبل لدورة التضخيم الأولى.
غالبا ما يكون من المستحسن استخدام خزانة PCR عندما يكون خطر تلويث عينتك مرتفعا. للتحقق من وجود أي تلوث في رد فعلك ، من المفيد إعداد عنصر تحكم سلبي ، لا يحتوي على قالب DNA ولا ينبغي أن ينتج منتجا في هلام الحمض النووي الخاص بك.
في كثير من الأحيان يجب تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق ضبط درجات الحرارة أو تركيز كلوريد المغنيسيوم أو تجربة بادئات جديدة. بمجرد أن تعمل PCR الخاص بك. من الجيد دائما تشغيل قالب تحكم إيجابي ، والذي تعرف أنه سينتج منتجا.
توجد العديد من الاختلافات والتطبيقات في تفاعل البوليميراز المتسلسل لمجموعة متنوعة من الأغراض.
يتضمن أحد أشكال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وهو بدء التشغيل الساخن PCR ، حجب البوليميراز عن التفاعل حتى بعد خطوة التمسخ الأولى ، مما يمنع التضخيم غير المحدد الذي قد يحدث قبل ركوب الدراجات.
يمكن أيضا تعديل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم تسلسلات الحمض النووي المتعددة في وقت واحد عن طريق استخدام بادئات متعددة في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل واحد يسمى تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال.
بالاقتران مع مجسات قليل النوكليوتيدات الفلورية ، يمكن أن يصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الواقع تقنية يمكنها قياس المستويات النسبية أو المطلقة للتعبير الجيني أو مقدار الرنا المرسال الذي يتم إنتاجه لجين معين أو مجموعة من الجينات. يشار إلى هذه الطريقة باسم qPCR.
يمكن أيضا استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد وجود تسلسل معين من الحمض النووي في الكائن الحي. يشار إلى هذا الإجراء باسم التنميط الجيني. على سبيل المثال ، يمكن استخدام التنميط الجيني لتحديد أصالة عينات الأسماك من خلال معرفة ما إذا كان هناك تسلسل معين للأنواع موجودا في العينة. يستخدم التنميط الجيني أيضا في تحليل الطب الشرعي لتحديد ما إذا كان الحمض النووي الموجود في مسرح الجريمة يتطابق مع المشتبه به.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). في هذا الفيديو ، استعرضنا ماهية تفاعل البوليميراز المتسلسل وكيف يعمل ، والمكونات العديدة لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والآلية التي يمكن من خلالها لتفاعل البوليميراز المتسلسل تضخيم الحمض النووي والعديد من الاختلافات والتطبيقات لهذه التقنية المفيدة للغاية. شكرا للمشاهدة!
تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، هو تقنية تستخدم لتضخيم الحمض النووي من خلال التدوير الحراري - أطوانات التغيرات في درجات الحرارة على فترات زمنية محددة. باستخدام بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة ، يمكن ل PCR إنشاء نسخ عديدة من الحمض النووي من اللبنات الأساسية للحمض النووي تسمى dNTPs. هناك ثلاث خطوات في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): التمسخ ، والتلدين ، والاستطالة. التمسخ هو الخطوة الأولى في الدورة ويتسبب في ذوبان الحمض النووي عن طريق تعطيل الروابط الهيدروجينية بين القواعد مما يؤدي إلى الحمض النووي أحادي الشريطة. يخفض التلدين درجة الحرارة بدرجة كافية للسماح بربط بادئات قليل النوكليوتيدات بقالب الحمض النووي. خلال خطوة الاستطالة ، سيقوم بوليميراز الحمض النووي بتصنيع حمض نووي جديد مزدوج الشريطة.
يقدم هذا الفيديو مقدمة لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتم وصف المبادئ الأساسية لتفاعل البوليميراز المتسلسل بالإضافة إلى إجراء خطوة بخطوة لإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المعمم. يعرض الفيديو المكونات الضرورية لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ويتضمن تعليمات لتصميم التمهيدي ، ويقدم تلميحات مفيدة لضمان تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الناجحة.
تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تفاعل البوليميراز المتسلسل هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتضخيم شظايا الحمض النووي. يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التدوير الحراري ، وهو التسخين والتبريد المتكرر للتفاعل عبر ثلاث درجات حرارة مميزة تسمى التمسخ والتلدين والتمدد أو الاستطالة.
يبدأ تفاعل التدوير الحراري بمجرد وضع كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز تدوير حراري ، وهو جهاز مبرمج لتسخين وتبريد التفاعل بدقة.
تبدأ دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتمسخ ، والذي يحدث لمدة 20 إلى 30 ثانية عند 95 درجة مئوية ، أعلى بكثير من درجة حرارة انصهار الحمض النووي. درجة حرارة الانصهار هي حالة يكون فيها نصف الحمض النووي عبارة عن حلزون مزدوج تقطعت بهم السبل والآخر عبارة عن ملف عشوائي واحد مجدول. درجة حرارة التمسخ أعلى بكثير من درجة حرارة الانصهار ، من أجل ضمان كسر جميع الروابط الهيدروجينية بين أزواج القواعد التكميلية مما ينتج عنه الحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل. تسمى الخيوط المفردة المزدوجة خيوط الإحساس والمضادة. تسلسل الإحساس ، أو خيط الترميز ، مطابق لتسلسل mRNA ، والذي سيرمز في النهاية للبروتين. لذلك ، من المنطقي. عند قراءتها من اليسار إلى اليمين ، تبدأ بالفوسفات 5 وتنتهي ب 3 'hydroxyl. يطلق على الخيط المضاد للمعنى أيضا اسم الخيط التكميلي ويبدأ ب 3 'هيدروكسيل وينتهي بالفوسفات 5' عند قراءته من اليسار إلى اليمين.
في الخطوة الثانية ، تلدين ، قطع قصيرة من الحمض النووي تسمى الاشعال ، والتي تكون خاصة بخيوط الإحساس أو المضادة للمعنى ترتبط عبر روابط هيدروجينية. التمهيدي الذي يرتبط بخيط مضاد للمعنى وله نفس تسلسل خيط الإحساس هو التمهيدي الأمامي أو الإحساسي. التمهيدي الذي يرتبط بخيط الإحساس وله تسلسل عكسي ومكمل لخيط الإحساس هو التمهيدي العكسي أو المضاد للحساس. اعتمادا على طول البادئات المستخدمة ، عادة ما تكون درجة حرارة التلدين لهذه الخطوة من 3 إلى 5 درجات مئوية أقل من درجة حرارة الانصهار المنخفضة للبادئات. يميل التلدين إلى الحدوث بين 50 و 65 درجة مئوية ويستمر لمدة 20 إلى 40 ثانية.
بمجرد أن ترتبط البادئات بالحمض النووي ، فإنها تهيئ التفاعل عن طريق إنشاء نهاية مجموعة هيدروكسيل 3 بوصات يرتبط بها البوليميراز ، وهو إنزيم يكرر الحمض النووي.
تحدث الخطوة التالية التي تسمى الاستطالة أو التمدد عند 72 درجة مئوية ، وهو مثالي لنشاط البوليميراز. بمجرد الارتباط ، يبدأ البوليميراز في إضافة ثلاثي فوسفات النيوكليوتيدات الحرة ، أو dNTPs ، إلى نهايات التمهيدي واحدا تلو الآخر في اتجاه 5 إلى 3 لصنع حمض نووي مزدوج تقطعت به السبل.
بمجرد اكتمال الاستطالة ، تبدأ الدورة التالية. في الدورة التالية ، سترتبط البادئات بالحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل والذي تم تشكيله عبر الامتداد السابق. الجزء القصير الذي تحاول تضخيمه ، الضخم ، سيتشكل في النهاية عندما يمتد البوليميراز من التمهيدي الأمامي على خيط تم إنشاؤه عن طريق التضخيم من التمهيدي العكسي أو العكس. بمجرد توليدها ، ستزداد كمية الamplicon بشكل كبير في الدورات اللاحقة. اعتمادا على الهدف من رد فعلك ، ستكون هناك حاجة إلى 20 إلى 40 دورة.
بالنسبة لمكبرات الصوت الطويلة ، عادة ما يتم تشغيل خطوة الاستطالة النهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 5 إلى 15 دقيقة لضمان أن كل الحمض النووي مزدوج تقطعت به السبل. عادة ، تتم برمجة خطوة التثبيت النهائية عند 4 درجات مئوية في جهاز التدوير الحراري كخطوة احترازية لضمان بقاء الحمض النووي مستقرا حتى يتم إخراجه من الدراجة الحرارية.
يتطلب تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل عدة كواشف رئيسية. الأول هو قالب الحمض النووي ، وهو عينة الحمض النووي التي سيتم تضخيم الجزء الخاص بك منها. ثم هناك البادئات الخاصة بك ، وهي القطع القصيرة من الحمض النووي أو قليل النوكليوتيدات التي تهيئ تفاعل البوليميراز.
هناك العديد من الاعتبارات المهمة التي يجب مراعاتها عند اختيار البرايمر الخاص بك. أولا ، يجب أن تكون مكملة للمنطقتين 5 و 3 من قالب الحمض النووي الخاص بك التي تحيط بالتسلسل الذي تريد تضخيمه. ثانيا ، يجب أن يتراوح طولها بين 15 و 30 زوجا أساسيا وأن تتكون من حوالي 50٪ من الجوانين والسيتوزينات. ثالثا ، يجب أن تكون درجات حرارة انصهار كلا البادئات أعلى من 50 درجة مئوية وفي حدود درجة إلى درجتين من بعضهما البعض حتى يتمكنوا من الارتباط بكفاءة في نفس درجة حرارة التلدين. رابعا ، لا يمكن أن تكون مكملة لبعضها البعض وتشكل ثنائيات أولية. وخامسا ، لا ينبغي أن تحتوي على بنية ثانوية ، والتي تتشكل عن طريق التلدين الذاتي داخل أحد البادئات.
بالإضافة إلى البادئات وقالب الحمض النووي ، يعد بوليميراز الحمض النووي ضروريا لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الإنزيم الأكثر استخداما في تفاعل البوليميراز المتسلسل هو Taq polymerase ، وهو إنزيم مقاوم للحرارة معزول من بكتيريا Thermus aquaticus التي تجعل موطنها في الينابيع الساخنة. يمكن أن يتحمل بوليميراز Taq درجات حرارة تزيد عن 90 درجة مئوية.
يجبأيضا إضافة dNTPs ، التي ستتألف من الأزواج الأساسية في الخيوط النامية ، إلى التفاعل. يعد المخزن المؤقت للتفاعل ، الذي يحافظ على درجة الحموضة ويحتوي على أيونات مهمة مثل المنغنيز والمغنيسيوم والبوتاسيوم ، أيضا مكونا ضروريا للتفاعل يعمل على استقرار التفاعل ويوفر عوامل مساعدة مهمة لإنزيم البوليميراز. مثل جميع التفاعلات ، يحتاج تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى مذيب ، وبالتالي يتم استخدام الماء من الدرجة PCR ، وهو خال من الأيونات التي يمكن أن تمنع التفاعل.
قبل البدء في PCR ، تأكد من نظافة بيئة العمل لتجنب التلوث. يجب دائما ارتداء القفازات.
للمساعدة في تتبع مكونات التفاعل المختلفة التي ستحتاجها. قم بعمل جدول بأحجام الكاشف وتركيزاته لكل عينة من عيناتك بما في ذلك عناصر التحكم. من حيث الأحجام ، يجب أن يحتوي التفاعل النموذجي على 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل 10X ، و 4 ميكرولتر من 25 ملي مولار MgCl2 ، و 1 ميكرولتر من dNTPs عند 10 ملي مولار ، و 2 ميكرولتر من البادئات الأمامية والخلفية عند 50 نانوغرام / ميكرولتر ، و 0.3 ميكرولتر من بوليميراز Taq عند 5 وحدة / ميكرولتر. تريد إضافة قالب كاف بحيث يكون 100 نانوغرام موجودا في التفاعل. أخيرا ، يتم إجراء معظم تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل بحجم إجمالي يبلغ 50 ميكرولتر. لذلك يجب استخدام حجم من الماء من فئة PCR لضمان أن الحجم الإجمالي هو بالفعل 50 ميكرولتر.
بمجرد تخطيط رد فعلك على الورق ، قم بتجميع الكواشف على الجليد.
بعد ذلك ، أضف الكواشف الخاصة بك إلى أنبوب PCR. أضف الماء أولا ، ثم القالب الخاص بك ، والبادئات ، والمخزن المؤقت ، وكلوريد المغنيسيوم ، و dNTPs ، أضف بوليميراز Taq أخيرا واخلطه جيدا.
بعد إعداد رد الفعل الخاص بك ، ضع عينتك في جهاز تدوير حراري وابدأ برنامج PCR الخاص بك. باختصار ، تتكون أجزاء الماكينة من كتلة حرارية ، حيث يتم إدخال أنبوب أو لوحة PCR وتخضع لتغيرات دقيقة في درجة الحرارة. غطاء ساخن يمنع التكثيف حتى لا تفقد أي عينة وواجهة مع شاشة لبرمجة درجات حرارة تفاعل البوليميراز المتسلسل ومدد الدورة. قم دائما بإعداد البرنامج الخاص بك قبل تجميع التفاعل.
بمجرد أن يقوم الناقل الحراري بعمله. أخرج رد فعلك وتحقق من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. إذا نجح تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فيجب أن ترى الهامبليكون بحجم الزوج الأساسي الصحيح.
والآن للحصول على بعض التلميحات المفيدة عند العمل مع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). عندما تحاول تضخيم نفس منتج PCR من عدد من القوالب المختلفة وبالتالي لديك الكثير من ردود الفعل المختلفة على الإعداد. من المفيد توسيع نطاق التفاعل لإنشاء مزيج رئيسي. المزيج الرئيسي PCR عبارة عن خليط كبير الحجم من جميع الكواشف المشتركة بين عيناتك ، والتي يتم توزيعها لاحقا في أنابيب تفاعل متعددة.
تبدأ معظم تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل بخطوة التمسخ الأولية ، والتي تحدث عند 95 درجة مئوية لمدة 1 إلى 9 دقائق. تضمن هذه الخطوة أن كل القالب مفرد تقطعت به السبل لدورة التضخيم الأولى.
غالبا ما يكون من المستحسن استخدام خزانة PCR عندما يكون خطر تلويث عينتك مرتفعا. للتحقق من وجود أي تلوث في رد فعلك ، من المفيد إعداد عنصر تحكم سلبي ، لا يحتوي على قالب DNA ولا ينبغي أن ينتج منتجا في هلام الحمض النووي الخاص بك.
في كثير من الأحيان يجب تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق ضبط درجات الحرارة أو تركيز كلوريد المغنيسيوم أو تجربة بادئات جديدة. بمجرد أن تعمل PCR الخاص بك. من الجيد دائما تشغيل قالب تحكم إيجابي ، والذي تعرف أنه سينتج منتجا.
توجد العديد من الاختلافات والتطبيقات في تفاعل البوليميراز المتسلسل لمجموعة متنوعة من الأغراض.
يتضمن أحد أشكال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وهو بدء التشغيل الساخن PCR ، حجب البوليميراز عن التفاعل حتى بعد خطوة التمسخ الأولى ، مما يمنع التضخيم غير المحدد الذي قد يحدث قبل ركوب الدراجات.
يمكن أيضا تعديل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم تسلسلات الحمض النووي المتعددة في وقت واحد عن طريق استخدام بادئات متعددة في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل واحد يسمى تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال.
بالاقتران مع مجسات قليل النوكليوتيدات الفلورية ، يمكن أن يصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الواقع تقنية يمكنها قياس المستويات النسبية أو المطلقة للتعبير الجيني أو مقدار الرنا المرسال الذي يتم إنتاجه لجين معين أو مجموعة من الجينات. يشار إلى هذه الطريقة باسم qPCR.
يمكن أيضا استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد وجود تسلسل معين من الحمض النووي في الكائن الحي. يشار إلى هذا الإجراء باسم التنميط الجيني. على سبيل المثال ، يمكن استخدام التنميط الجيني لتحديد أصالة عينات الأسماك من خلال معرفة ما إذا كان هناك تسلسل معين للأنواع موجودا في العينة. يستخدم التنميط الجيني أيضا في تحليل الطب الشرعي لتحديد ما إذا كان الحمض النووي الموجود في مسرح الجريمة يتطابق مع المشتبه به.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). في هذا الفيديو ، استعرضنا ماهية تفاعل البوليميراز المتسلسل وكيف يعمل ، والمكونات العديدة لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والآلية التي يمكن من خلالها لتفاعل البوليميراز المتسلسل تضخيم الحمض النووي والعديد من الاختلافات والتطبيقات لهذه التقنية المفيدة للغاية. شكرا للمشاهدة!
تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تفاعل البوليميراز المتسلسل هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتضخيم شظايا الحمض النووي. يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التدوير الحراري ، وهو التسخين والتبريد المتكرر للتفاعل عبر ثلاث درجات حرارة مميزة تسمى التمسخ والتلدين والتمدد أو الاستطالة.
يبدأ تفاعل التدوير الحراري بمجرد وضع كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز تدوير حراري ، وهو جهاز مبرمج لتسخين وتبريد التفاعل بدقة.
تبدأ دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتمسخ ، والذي يحدث لمدة 20 إلى 30 ثانية عند 95؟ C ، أعلى بكثير من درجة حرارة انصهار الحمض النووي. درجة حرارة الانصهار هي حالة يكون فيها نصف الحمض النووي عبارة عن حلزون مزدوج تقطعت بهم السبل والآخر عبارة عن ملف عشوائي واحد مجدول. درجة حرارة التمسخ أعلى بكثير من درجة حرارة الانصهار ، من أجل ضمان كسر جميع الروابط الهيدروجينية بين أزواج القواعد التكميلية مما ينتج عنه الحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل. تسمى الخيوط المفردة المزدوجة خيوط الإحساس والمضادة. تسلسل الإحساس ، أو خيط الترميز ، مطابق لتسلسل mRNA ، والذي سيرمز في النهاية للبروتين. لذلك ، من المنطقي. عند القراءة من اليسار إلى اليمين ، تبدأ ب 5؟ الفوسفات وينتهي ب 3؟ هيدروكسيل. يطلق على الخيط المضاد أيضا اسم الخيط التكميلي ويبدأ ب 3؟ الهيدروكسيل وينتهي ب 5؟ الفوسفات عند قراءته من اليسار إلى اليمين.
في الخطوة الثانية ، تلدين ، قطع قصيرة من الحمض النووي تسمى الاشعال ، والتي تكون خاصة بخيوط الإحساس أو المضادة للمعنى ترتبط عبر روابط هيدروجينية. التمهيدي الذي يرتبط بخيط مضاد للمعنى وله نفس تسلسل خيط الإحساس هو التمهيدي الأمامي أو الإحساسي. التمهيدي الذي يرتبط بخيط الإحساس وله تسلسل عكسي ومكمل لخيط الإحساس هو التمهيدي العكسي أو المضاد للحساس. اعتمادا على طول الاشعال المستخدمة ، تكون درجة حرارة التلدين لهذه الخطوة عادة من 3 إلى 5؟ درجة مئوية أقل من درجة حرارة الانصهار المنخفضة للبادئات. يميل التلدين إلى الحدوث بين 50 و 65؟ C ويستمر لمدة 20 إلى 40 ثانية.
بمجرد أن ترتبط البادئات بالحمض النووي ، فإنها تهيئ التفاعل عن طريق إنشاء 3؟ نهاية مجموعة الهيدروكسيل التي يرتبط بها البوليميراز ، وهو إنزيم يكرر الحمض النووي.
الخطوة التالية تسمى الاستطالة أو التمدد تحدث عند 72؟ C ، وهو الأمثل لنشاط البوليميراز. بمجرد ربطه ، يبدأ البوليميراز في إضافة ثلاثي فوسفات النيوكليوتيدات الحرة ، أو dNTPs ، إلى نهايات التمهيدي واحدا تلو الآخر في 5؟ إلى 3؟ اتجاه لعمل الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل.
بمجرد اكتمال الاستطالة ، تبدأ الدورة التالية. في الدورة التالية ، سترتبط البادئات بالحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل والذي تم تشكيله عبر الامتداد السابق. الجزء القصير الذي تحاول تضخيمه ، الضخم ، سيتشكل في النهاية عندما يمتد البوليميراز من التمهيدي الأمامي على خيط تم إنشاؤه عن طريق التضخيم من التمهيدي العكسي أو العكس. بمجرد توليدها ، ستزداد كمية الamplicon بشكل كبير في الدورات اللاحقة. اعتمادا على الهدف من رد فعلك ، ستكون هناك حاجة إلى 20 إلى 40 دورة.
بالنسبة لمكبرات الصوت الطويلة ، عادة ما يتم تشغيل خطوة الاستطالة النهائية عند 72؟ C لمدة 5 إلى 15 دقيقة للتأكد من أن كل الحمض النووي مزدوج تقطعت به السبل. عادة ، خطوة الانتظار النهائية عند 4؟ تتم برمجة C في جهاز التدوير الحراري كخطوة احترازية لضمان بقاء الحمض النووي مستقرا حتى يتم إخراجه من الدراجة الحرارية.
يتطلب تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل عدة كواشف رئيسية. الأول هو قالب الحمض النووي ، وهو عينة الحمض النووي التي سيتم تضخيم الجزء الخاص بك منها. ثم هناك البادئات الخاصة بك ، وهي القطع القصيرة من الحمض النووي أو قليل النوكليوتيدات التي تهيئ تفاعل البوليميراز.
هناك العديد من الاعتبارات المهمة التي يجب مراعاتها عند اختيار البرايمر الخاص بك. أولا ، يجب أن تكون مكملة ل 5؟ و 3؟ مناطق قالب الحمض النووي الخاص بك التي تحيط بالتسلسل الذي تريد تضخيمه. ثانيا ، يجب أن يتراوح طولها بين 15 و 30 زوجا أساسيا وأن تتكون من حوالي 50٪ من الجوانين والسيتوزينات. ثالثا ، يجب أن تكون درجات حرارة انصهار كلا البادئات أعلى من 50؟ C وفي حدود درجة إلى درجتين من بعضهما البعض حتى يتمكنوا من الارتباط بكفاءة في نفس درجة حرارة التلدين. رابعا ، لا يمكن أن تكون مكملة لبعضها البعض وتشكل ثنائيات أولية. وخامسا ، لا ينبغي أن تحتوي على بنية ثانوية ، والتي تتشكل عن طريق التلدين الذاتي داخل أحد البادئات.
بالإضافة إلى البادئات وقالب الحمض النووي ، يعد بوليميراز الحمض النووي ضروريا لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الإنزيم الأكثر استخداما في تفاعل البوليميراز المتسلسل هو Taq polymerase ، وهو إنزيم مقاوم للحرارة معزول من بكتيريا Thermus aquaticus التي تجعل موطنها في الينابيع الساخنة. يمكن أن يتحمل بوليميراز Taq درجات حرارة أكبر من 90 درجة مئوية
dNTPs ، والتي ستتألف من أزواج القواعد في الخيوط النامية ، يجب أيضا إضافتها إلى التفاعل. يعد المخزن المؤقت للتفاعل ، الذي يحافظ على درجة الحموضة ويحتوي على أيونات مهمة مثل المنغنيز والمغنيسيوم والبوتاسيوم ، أيضا مكونا ضروريا للتفاعل يعمل على استقرار التفاعل ويوفر عوامل مساعدة مهمة لإنزيم البوليميراز. مثل جميع التفاعلات ، يحتاج تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى مذيب ، وبالتالي يتم استخدام الماء من الدرجة PCR ، وهو خال من الأيونات التي يمكن أن تمنع التفاعل.
قبل البدء في PCR ، تأكد من نظافة بيئة العمل لتجنب التلوث. يجب دائما ارتداء القفازات.
للمساعدة في تتبع مكونات التفاعل المختلفة التي ستحتاجها. قم بعمل جدول بأحجام الكاشف وتركيزاته لكل عينة من عيناتك بما في ذلك عناصر التحكم. من حيث الأحجام ، يجب أن يحتوي التفاعل النموذجي على 5؟ L من المخزن المؤقت للتفاعل 10X ، 4؟ L من 25 ملي MgCl2 ، 1؟ L من dNTPs عند 10 ملي متر ، 2؟ L من الاشعال الأمامية والعكسية عند 50 نانوغرام / ؟ L ، و 0.3؟ L من بوليميراز Taq عند 5 U / * L. تريد إضافة قالب كاف بحيث يكون 100 نانوغرام موجودا في التفاعل. أخيرا ، يتم إجراء معظم تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل بحجم إجمالي يبلغ 50 درجة لتر. لذلك يجب استخدام حجم من الماء من فئة PCR للتأكد من أن الحجم الإجمالي هو بالفعل 50?L.
بمجرد التخطيط لرد فعلك على الورق ، قم بتجميع الكواشف الخاصة بك على الجليد.
بعد ذلك ، أضف الكواشف الخاصة بك إلى أنبوب PCR. أضف الماء أولا ، ثم القالب الخاص بك ، والبادئات ، والمخزن المؤقت ، وكلوريد المغنيسيوم ، و dNTPs ، أضف بوليميراز Taq أخيرا واخلطه جيدا.
بعد إعداد رد الفعل الخاص بك ، ضع عينتك في جهاز تدوير حراري وابدأ برنامج PCR الخاص بك. باختصار ، تتكون أجزاء الماكينة من كتلة حرارية ، حيث يتم إدخال أنبوب أو لوحة PCR وتخضع لتغيرات دقيقة في درجة الحرارة. غطاء ساخن يمنع التكثيف حتى لا تفقد أي عينة وواجهة مع شاشة لبرمجة درجات حرارة تفاعل البوليميراز المتسلسل ومدد الدورة. قم دائما بإعداد البرنامج الخاص بك قبل تجميع التفاعل.
بمجرد أن يقوم الناقل الحراري بعمله. أخرج رد فعلك وتحقق من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. إذا نجح تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فيجب أن ترى الهامبليكون بحجم الزوج الأساسي الصحيح.
والآن للحصول على بعض التلميحات المفيدة عند العمل مع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). عندما تحاول تضخيم نفس منتج PCR من عدد من القوالب المختلفة وبالتالي لديك الكثير من ردود الفعل المختلفة على الإعداد. من المفيد توسيع نطاق التفاعل لإنشاء مزيج رئيسي. المزيج الرئيسي PCR عبارة عن خليط كبير الحجم من جميع الكواشف المشتركة بين عيناتك ، والتي يتم توزيعها لاحقا في أنابيب تفاعل متعددة.
تبدأ معظم تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل بخطوة التمسخ الأولية ، والتي تحدث عند 95؟ ج لمدة 1 إلى 9 دقائق. تضمن هذه الخطوة أن كل القالب مفرد تقطعت به السبل لدورة التضخيم الأولى.
غالبا ما يكون من المستحسن استخدام خزانة PCR عندما يكون خطر تلويث عينتك مرتفعا. للتحقق من وجود أي تلوث في رد فعلك ، من المفيد إعداد عنصر تحكم سلبي ، لا يحتوي على قالب DNA ولا ينبغي أن ينتج منتجا في هلام الحمض النووي الخاص بك.
في كثير من الأحيان يجب تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق ضبط درجات الحرارة أو تركيز كلوريد المغنيسيوم أو تجربة بادئات جديدة. بمجرد أن تعمل PCR الخاص بك. من الجيد دائما تشغيل قالب تحكم إيجابي ، والذي تعرف أنه سينتج منتجا.
توجد العديد من الاختلافات والتطبيقات في تفاعل البوليميراز المتسلسل لمجموعة متنوعة من الأغراض.
يتضمن أحد أشكال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وهو بدء التشغيل الساخن PCR ، حجب البوليميراز عن التفاعل حتى بعد خطوة التمسخ الأولى ، مما يمنع التضخيم غير المحدد الذي قد يحدث قبل ركوب الدراجات.
يمكن أيضا تعديل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم تسلسلات الحمض النووي المتعددة في وقت واحد عن طريق استخدام بادئات متعددة في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل واحد يسمى تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال.
بالاقتران مع مجسات قليل النوكليوتيدات الفلورية ، يمكن أن يصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الواقع تقنية يمكنها قياس المستويات النسبية أو المطلقة للتعبير الجيني أو مقدار الرنا المرسال الذي يتم إنتاجه لجين معين أو مجموعة من الجينات. يشار إلى هذه الطريقة باسم qPCR.
يمكن أيضا استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد وجود تسلسل معين من الحمض النووي في الكائن الحي. يشار إلى هذا الإجراء باسم التنميط الجيني. على سبيل المثال ، يمكن استخدام التنميط الجيني لتحديد أصالة عينات الأسماك من خلال معرفة ما إذا كان هناك تسلسل معين للأنواع موجودا في العينة. يستخدم التنميط الجيني أيضا في تحليل الطب الشرعي لتحديد ما إذا كان الحمض النووي الموجود في مسرح الجريمة يتطابق مع المشتبه به.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). في هذا الفيديو ، استعرضنا ماهية تفاعل البوليميراز المتسلسل وكيف يعمل ، والمكونات العديدة لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والآلية التي يمكن من خلالها لتفاعل البوليميراز المتسلسل تضخيم الحمض النووي والعديد من الاختلافات والتطبيقات لهذه التقنية المفيدة للغاية. شكرا للمشاهدة!
Chapters in this video
0:00
Overview
0:35
The Reaction
4:46
Reaction Components
7:10
Setting up the Reaction
9:54
Helpful Hints
11:23
Applications
12:56
Summary
Videos from this collection: