تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)

تعد تفاعلات البوليميراز المتسلسلة (PCR) طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتضخيم قطع DNA. تعتمد تقنية PCR على التدوير الحراري، وهو عملية تسخين وتبريد متكررة للتفاعل عبر ثلاث درجات حرارة متميزة تسمى المسخ، والارتباط، والاستطالة.

تبدأ تفاعل الدورة الحرارية بمجرد وضع كواشف PCR في جهاز الدوري الحراري، وهو جهاز مبرمج لتسخين وتبريد التفاعل بدقة.

تبدأ دورة PCR بعملية المسخ (denaturation)، والتي تحدث لمدة 20 إلى 30 ثانية عند 95 °C، وهي درجة حرارة أعلى بكثير من درجة حرارة انصهار DNA. درجة حرارة الانصهار هي الحالة التي يكون فيها نصف الـ DNA عبارة عن لولب مزدوج الخيوط والنصف الآخر عبارة عن ملف عشوائي أحادي الخيوط. وتكون درجة حرارة المسخ أعلى بكثير من درجة حرارة الانصهار، وذلك لضمان تكسر جميع الروابط الهيدروجينية بين أزواج القواعد المتكاملة، مما ينتج عنه DNA أحادي الخيوط فقط. وتسمى الخيوط المفردة المزدوجة بالخيط الحسي (sense strand) والخيط المضاد للحس (antisense strand). إن تسلسل الخيط الحسي، أو الخيط المشفّر، مطابق لتسلسل mRNA الذي سيقوم في النهاية بتشفير البروتين؛ ولذلك يُسمى بالخيط الحسي. وعند قراءته من اليسار إلى اليمين، يبدأ بمجموعة 5’ phosphate وينتهي بمجموعة 3’ hydroxyl. أما الخيط المضاد للحس فيسمى أيضاً الخيط المتمم، ويبدأ بمجموعة 3’ hydroxyl وينتهي بمجموعة 5’ phosphate عند قراءته من اليسار إلى اليمين.

في الخطوة الثانية، وهي خطوة الارتباط (annealing)، ترتبط قطع قصيرة من DNA تسمى البادئات (primers)، والتي تكون متخصصة بالخيوط الحسية أو المضادة للحس، عبر روابط هيدروجينية. البادئة التي ترتبط بالخيط المضاد للحس ولها نفس تسلسل الخيط الحسي هي البادئة الأمامية أو الحسية (forward or sense primer). أما البادئة التي ترتبط بالخيط الحسي ولها تسلسل عكسي ومتمم للخيط الحسي فهي البادئة العكسية أو المضادة للحس (reverse or antisense primer). وبناءً على طول البادئات المستخدمة، تكون درجة حرارة الارتباط لهذه الخطوة عادةً أقل بـ 3 إلى 5 °C من درجة حرارة الانصهار الأدنى للبادئتين. وعادة ما يحدث الارتباط بين 50 و 65 °C ويستمر لمدة 20 إلى 40 ثانية.

بمجرد ارتباط البادئات بالـ DNA، فإنها تشرع في التفاعل عن طريق إنشاء طرف مجموعة 3’ hydroxyl التي سيرتبط بها إنزيم البوليميراز (polymerase)، وهو الإنزيم الذي يقوم بمضاعفة DNA.

الخطوة التالية التي تسمى الاستطالة (elongation) أو التمديد (extension) تحدث عند 72 °C، وهي الدرجة المثلى لنشاط البوليميراز. وبمجرد ارتباطه، يبدأ البوليميراز في إضافة ثلاثي فوسفات النوكليوتيدات الحر، أو dNTPs، إلى نهايات البادئة واحدة تلو الأخرى في الاتجاه من 5’ إلى 3’ لتكوين DNA مزدوج الخيوط.

بمجرد اكتمال الاستطالة، تبدأ الدورة التالية. وفي الدورة التالية، سترتبط البادئات بـ DNA أحادي الخيوط الذي تشكل عبر عملية التمديد السابقة. وسيتشكل في النهاية الجزء القصير الذي تحاول تضخيمه، وهو قطعة التضخيم (amplicon)، عندما يقوم البوليميراز بالتمدد من البادئة الأمامية على خيط تم إنتاجه عن طريق التضخيم من البادئة العكسية أو العكس. وبمجرد إنتاجه، ستزداد كمية قطعة التضخيم بشكل أسي في الدورات اللاحقة. وبناءً على هدف التفاعل، ستكون هناك حاجة من 20 إلى 40 دورة.

بالنسبة لقطع التضخيم الطويلة، يتم عادةً إجراء خطوة استطالة نهائية عند 72 °C لمدة 5 إلى 15 دقيقة لضمان أن يكون كل الـ DNA مزدوج الخيوط. وعادة ما يتم برمجة خطوة حفظ نهائية عند 4 °C في جهاز الدوري الحراري كإجراء احترازي لضمان بقاء الـ DNA مستقراً حتى يتم إخراجه من الجهاز.

يتطلب تفاعل PCR عدة كواشف رئيسية. أولاً، قالب DNA، وهو عينة DNA التي سيتم تضخيم الجزء المطلوب منها. ثم تأتي البادئات (primers)، وهي قطع قصيرة من DNA أو قليلة النوكليوتيد (oligonucleotides) التي تحفز تفاعل البوليميراز.

هناك عدة اعتبارات هامة يجب مراعاتها عند اختيار البادئات. أولاً، يجب أن تكون مكملة للمنطقتين 5' و 3' في قالب DNA التي تحيط بالتسلسل المراد تضخيمه. ثانياً، يجب أن يتراوح طولها بين 15 و 30 زوجاً قاعدياً، وأن تتكون من حوالي 50% من الغوانين والسيتوزين. ثالثاً، يجب أن تكون درجات حرارة الانصهار لكلا البادئتين فوق 50 °C وبفارق درجة واحدة إلى درجتين بينهما، حتى يتمكنا من الارتباط بكفاءة عند درجة حرارة التلدين نفسها. رابعاً، يجب ألا تكون البادئتان مكملتين لبعضهما البعض لتجنب تكوين ثنائيات البادئات (primer dimers). وخامساً، يجب ألا تحتوي البادئة على بنية ثانوية، والتي تتشكل نتيجة التلدين الذاتي داخل إحدى البادئات.

بالإضافة إلى البادئات وقالب DNA، يعد إنزيم DNA polymerase ضرورياً لتفاعل PCR. والإنزيم الأكثر استخداماً في PCR هو Taq polymerase، وهو إنزيم مستقر حرارياً تم عزله من بكتيريا Thermus aquaticus التي تعيش في الينابيع الساخنة. ويمكن لإنزيم Taq polymerase تحمل درجات حرارة تزيد عن 90 °C.

كما يجب إضافة dNTPs إلى التفاعل، وهي التي ستشكل الأزواج القاعدية في السلاسل النامية. ويعد محلول التخزين المنظم (reaction buffer)، الذي يحافظ على pH ويحتوي على أيونات هامة مثل المنجنيز والمغنيسيوم والبوتاسيوم، مكوناً ضرورياً للتفاعل يعمل على استقراره ويوفر العوامل المساعدة الهامة لإنزيم البوليميراز. وكما هو الحال في جميع التفاعلات، يحتاج PCR إلى مذيب، لذا يتم استخدام ماء بدرجة نقاء PCR، وهو ماء خالٍ من الأيونات التي قد تثبط التفاعل.

قبل البدء في تفاعل PCR، تأكد من نظافة بيئة العمل لتجنب التلوث. يجب ارتداء القفازات دائماً.

للمساعدة في تتبع مكونات التفاعل المختلفة التي ستحتاجها، قم بإعداد جدول لأحجام وتركيزات الكواشف لكل عينة من عيناتك بما في ذلك الضوابط. فيما يتعلق بالأحجام، يجب أن يحتوي التفاعل النموذجي على 5μL من محلول منظم للتفاعل بتركيز 10X، و4μL من MgCl2 بتركيز 25 mM، و1μL من dNTPs بتركيز 10 mM، و2μL من البادئات الأمامية والعكسية بتركيز 50 ng/μL، و0.3μL من Taq polymerase بتركيز 5 U/μL. يجب إضافة كمية كافية من القالب بحيث يتواجد 100 ng في التفاعل. وأخيراً، يتم إجراء معظم تفاعلات PCR في حجم إجمالي قدره 50μL؛ لذا يجب استخدام حجم من الماء المخصص لتفاعلات PCR لضمان أن الحجم الإجمالي هو بالفعل 50μL.

بمجرد تخطيط التفاعل على الورق، قم بتجميع الكواشف فوق الثلج.

بعد ذلك، أضف الكواشف إلى أنبوب PCR. ابدأ بإضافة الماء، ثم القالب، ثم البادئات، ثم المحلول المنظم، ثم كلوريد المغنيسيوم، وdNTPs، وأضف Taq polymerase في النهاية ثم اخلط المكونات جيداً.

بعد إعداد التفاعل، ضع عينتك في جهاز الدورات الحرارية (thermocycler) وابدأ برنامج PCR. باختصار، تتكون أجزاء الجهاز من كتلة حرارية (thermoblock)، حيث يتم إدخال أنبوب أو لوح PCR وتعريضه لتغيرات دقيقة في درجة الحرارة، وغطاء مسخن يمنع التكثيف لضمان عدم فقدان أي جزء من العينة، وواجهة مزودة بشاشة لبرمجة درجات حرارة PCR ومدد الدورات. قم دائماً بإعداد برنامجك قبل تجميع التفاعل.

بمجرد انتهاء جهاز الدورات الحرارية من عمله، أخرج التفاعل وتحقق من ناتج PCR عن طريق الفصل الكهربائي للهلام (gel electrophoresis). إذا نجح تفاعل PCR، يجب أن تظهر قطعة DNA المضخمة (amplicon) عند حجم الأزواج القاعدية الصحيح.

وفيما يلي بعض النصائح المفيدة عند العمل بتقنية PCR. عندما تحاول تضخيم نفس ناتج PCR من عدد من القوالب المختلفة، وبالتالي يكون لديك الكثير من التفاعلات المختلفة التي يجب إعدادها، فمن المفيد زيادة حجم التفاعل لإنشاء مزيج رئيسي (master mix). والمزيج الرئيسي لـ PCR هو خليط بحجم كبير من جميع الكواشف المشتركة بين عيناتك، والذي يتم توزيعه لاحقاً على أنابيب تفاعل متعددة.

تبدأ معظم تفاعلات PCR بخطوة مسخ أولية، وتتم عند 95°C لمدة تتراوح من 1 إلى 9 دقائق. تضمن هذه الخطوة أن يكون قالب الـ DNA بالكامل أحادي السلسلة في دورة التضخيم الأولى.

غالباً ما يكون من المستحسن استخدام كابينة PCR عندما يكون خطر تلوث العينة مرتفعاً. وللتحقق من وجود أي تلوث في تفاعلك، من المفيد إعداد ضابط سلبي (negative control)، وهو تفاعل لا يحتوي على قالب DNA ولا ينبغي أن ينتج عنه أي ناتج في هلام الـ DNA.

غالباً ما يتطلب PCR تحسيناً عن طريق ضبط درجات الحرارة، أو تركيز magnesium chloride، أو تجربة بادئات جديدة. وبمجرد أن يعمل تفاعل PCR بنجاح، من الجيد دائماً تشغيل قالب ضابط إيجابي (positive control)، والذي تعلم مسبقاً أنه سينتج ناتجاً.

توجد العديد من المتغيرات والتطبيقات لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لأغراض متنوعة.

يتضمن أحد متغيرات PCR، وهو تفاعل البوليميراز المتسلسل ببدء ساخن (hot start PCR)، حجب إنزيم البوليميراز عن التفاعل حتى تنتهي خطوة المسخ الأولى، مما يمنع التضخيم غير النوعي الذي قد يحدث قبل بدء الدورات.

يمكن أيضاً تعديل PCR لتضخيم تسلسلات متعددة من DNA في وقت واحد من خلال استخدام بادئات متعددة في تفاعل PCR واحد يسمى تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد (multiplex PCR).

وبالاقتران مع مجسات قليلة النيوكليوتيد الفلورية، يمكن أن يصبح PCR تقنية قادرة على قياس المستويات النسبية أو المطلقة للتعبير الجيني، أو كمية mRNA التي يتم إنتاجها لجين معين أو مجموعة من الجينات. ويشار إلى هذه الطريقة باسم qPCR.

كما يمكن استخدام PCR لتحديد وجود تسلسل DNA معين في كائن حي، وتسمى هذه العملية بالتنميط الجيني (genotyping). على سبيل المثال، يمكن استخدام التنميط الجيني للتحقق من أصالة عينات الأسماك من خلال معرفة ما إذا كان التسلسل النوعي للنوع موجوداً في العينة. ويستخدم التنميط الجيني أيضاً في التحليل الجنائي لتحديد ما إذا كان DNA الذي عُثر عليه في مسرح الجريمة يتطابق مع المشتبه به.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE حول تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). استعرضنا في هذا الفيديو ماهية PCR وكيفية عمله، والمكونات العديدة لتفاعل PCR، والآلية التي يمكن من خلالها لـ PCR تضخيم DNA، والعديد من التنويعات والتطبيقات لهذه التقنية المفيدة للغاية. شكراً للمشاهدة!