What does SDS do to proteins in SDS-PAGE?

SDS is an anionic detergent that coats proteins uniformly at a rate of 1.4 grams per gram of protein. This coating provides a consistent negative charge across the protein's length, enabling size-driven separation in an electric field. The detergent essentially linearizes complex protein structures, allowing them to migrate based solely on their molecular weight.

Why is the loading buffer important in SDS-PAGE preparation?

The loading buffer serves three critical functions: it denatures proteins into linear amino acid chains using SDS and reducing agents, it contains glycerin to prevent samples from floating out of gel wells, and it includes a dye like bromophenol blue to track electrophoresis progress. Boiling samples for 5 minutes with the buffer breaks disulfide bonds, allowing SDS to coat proteins evenly.

How does polyacrylamide gel concentration affect protein separation?

The polyacrylamide gel forms a regular matrix through which proteins migrate when exposed to an electric field. Higher gel concentrations create denser matrices that slow protein movement, while lower concentrations allow faster migration. This property enables researchers to optimize separation conditions based on the size of proteins being analyzed.

What is the purpose of molecular weight ladders in SDS-PAGE?

Molecular weight ladders are protein standards of known sizes loaded alongside samples. As the gel runs, ladder proteins spread and create visible bands at predictable positions. These reference bands allow researchers to calculate the exact size of unknown proteins in their samples by comparing their migration distances.

How do Coomassie and silver stains differ in protein detection?

Both stains visualize protein bands after electrophoresis, but they differ in sensitivity. Coomassie blue can detect protein bands containing as little as 50 nanograms, while silver stain is more sensitive, detecting bands with as little as 1 nanogram. Silver stain provides greater detection capability for low-abundance proteins.

What is two-dimensional gel electrophoresis and how does it work?

Two-dimensional gel electrophoresis separates proteins by two distinct properties sequentially. First, samples are arranged by isoelectric point on pH gradient strips, then proteins are transferred to a polyacrylamide gel where SDS-PAGE separation occurs. This dual approach provides insights into protein complexes and sub-organelle organization that single-dimension methods cannot reveal.

What happens after SDS-PAGE gel electrophoresis is complete?

After electrophoresis, the gel cassette is opened and the gel is stained with protein stains like Coomassie blue or silver stain to visualize protein bands. A common next step is transferring proteins from the gel onto a PVDF or nylon membrane for western blotting western transfer antibody detection analysis using specific antibodies to identify proteins of interest.

فصل البروتين باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام بوجود دوديسلفات الصوديوم (SDS-PAGE)

0 مشاهدة07:29 دقيقة

يُعد الفصل الكهربائي للهلام باستخدام دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE) تقنية يستخدمها العديد من الباحثين لفصل مخاليط البروتينات بناءً على حجمها. ويشكل الإتمام الناجح لهذه التقنية خطوة أولى أساسية للعديد من طرق تحليل البروتين، مثل اللطخة المناعية (immunoblotting). كما تُعتبر هذه التقنية بحد ذاتها أداة مفيدة في تقدير حجم البروتين ودرجة نقاوته.

من أجل فهم تقنية SDS-PAGE، يجب أولاً فهم مكوناتها الأساسية. يشير مصطلح SDS-PAGE إلى الفصل الكهربائي للهلام متعدد الأكريلاميد باستخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم. كبريتات دوديسيل الصوديوم، وهي الجزء الأول من هذه التقنية، أو "SDS"، عبارة عن منظف أنيوني، وهذا يعني أنها تتكون من مجموعة محبة للماء ذات شحنة سالبة كلية وسلسلة طويلة كارهة للماء ذات شحنة متعادلة.

تغلف السلسلة الكارهة للماء البروتينات بما يتناسب مع كتلتها وبمعدل 1.4 جرام من SDS لكل جرام من البروتين. ويوفر هذا للبروتينات القوة الدافعة اللازمة للفصل المعتمد على الحجم في مجال كهربائي.

يعتمد الفصل الكهربائي للهلام متعدد الأكريلاميد على هيدروجيل مصنوع من البولي أكريلاميد. البولي أكريلاميد هو بوليمر يشكل مصفوفة منتظمة للغاية يمكن للبروتينات التحرك من خلالها. وكلما زاد تركيز الهلام، تباطأت حركة البروتينات عبره عند تعرضها لمجال كهربائي. وتعرف عملية استخدام مجال كهربائي موحد مكانياً للتأثير على حركة الأجسام باسم الفصل الكهربائي.

يتم إجراء الفصل الكهربائي للهلام باستخدام SDS-PAGE على البروتينات المعزولة من مصادر متنوعة، بما في ذلك الخلايا المستزرعة، والأنسجة، والدم، والبول، والخميرة.

يجب أولاً فصل البروتينات من هذه المصادر المختلفة عن المكونات الخلوية الأخرى باستخدام تقنيات تشمل التجانس والطرد المركزي، وغالبًا ما يتبع ذلك استخدام محاليل التحلل (lysis buffers).

بمجرد عزل البروتين، غالبًا ما يتم قياس تركيزه لضمان تحميل كميات متساوية من العينات، وذلك بمقارنة كمية البروتين في العينة بمعايير الألبومين باستخدام مقايسة حمض البيسينكونينيك (BCA) اللونية.

من الخطوات الهامة التي يجب تذكرها هي إضافة محلول التحميل (loading buffer)، والذي يؤدي ثلاث وظائف رئيسية؛ أولاً، يعمل على تغيير الطبيعة البروتينية (denatures) بفضل SDS وعوامل مختزلة إضافية، وهو ما يعني تحويل البنى البروتينية المعقدة إلى سلسلة خطية من الأحماض الأمينية. ثانياً، يحتوي على الجلسرين الذي يضمن عدم طفو العينة عند تحميلها في آبار الهلام. وأخيراً، تتضمن معظم محاليل التحميل التجارية صبغة، مثل بروموفينول الأزرق، والتي يمكن تتبعها لقياس تقدم خطوة الفصل الكهربائي.

بعد إضافة محلول التحميل، يجب خلط العينات ثم غليها لمدة 5 دقائق؛ وهذا يسمح بكسر روابط ثنائي الكبريتيد القوية في البروتينات بمساعدة عامل مختزل مثل beta-mercaptoethanol. وبمجرد كسر جميع روابط ثنائي الكبريتيد، يستطيع SDS تغليف البروتينات بشكل أكثر تجانساً.

بعد ذلك، يتم تدوير العينات سريعاً باستخدام جهاز الطرد المركزي لتجميع السائل في الأسفل، وتصبح جاهزة للتحميل في نظام الهلام لإجراء الفصل الكهربائي.

قبل تحميل العينات، يجب أولاً تجميع نظام الهلام (gel). يبدأ ذلك بشراء أو تصنيع هلام بولي أكريلاميد. تزداد شعبية الهلامات الجاهزة بشكل متزايد لأن الأكريلاميد مادة سامة للأعصاب ويمكن أن تسبب تلفاً في الدماغ. تحتوي كاسيت الهلام على آبار تُستخدم لتحميل العينات.

بمجرد تثبيت الهلامات في مكانها، يتم ملء الغرفتين الداخلية والخارجية بمحلول منظم (buffer) يحتوي على نفس تركيز الأيونات المستخدم في صنع الهلامات. يؤدي ذلك إلى إنشاء دائرة كهربائية تمر بسلاسة من الكاثود، عبر الهلام، وصولاً إلى الأنود.

بعد ذلك، يتم عادةً تحميل سلالم الوزن الجزيئي (molecular weight ladders) في الهلام، تليها العينات. ومع تشغيل الهلام، سيتمدد السلم ويُشكل حزم بروتينية مرئية ذات أحجام معروفة. وفي الخطوات النهائية، يمكن استخدام هذه الحزم لحساب حجم كل بروتين.

بمجرد تحميل جميع العينات، يتم توصيل الأقطاب الموجبة والسالبة في صندوق الهلام بمصدر طاقة قادر على الحفاظ على جهد ثابت لفترة زمنية طويلة. عادةً ما يتم تشغيل الهلامات عند حوالي 60V حتى تدخل العينة بأكملها في منطقة الهلام التي تسمى "هلام التجميع" (stacking gel). بعد ذلك، يتم رفع الجهد إلى حوالي 200V لمدة تتراوح من 30 دقيقة إلى ساعة واحدة، وذلك اعتماداً على حجم وتركيز الهلام وحجم البروتين المستهدف.

عند اكتمال عملية الفصل الكهربائي، يتم إخراج الكاسيت وفتحه للكشف عن الهلام (الجل). يمكن بعد ذلك صبغ الهلام بصبغة بروتينية نموذجية، مثل Coomassie blue أو صبغة الفضة، لتصور حزم البروتين داخل الهلام. يمكن لصبغة Coomassie اكتشاف الحزم التي تحتوي على كمية ضئيلة تصل إلى 50 nanograms من البروتين، بينما يمكن لصبغة الفضة اكتشاف الحزم التي تحتوي على كمية ضئيلة تصل إلى 1 nanogram من البروتين.

في الفصل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد، تُفصل العينات بناءً على خاصيتين منفصلتين على الهلام، بُعد واحد في كل مرة. أولاً، يتم تحميل العينات وترتيبها وفقاً لنقاط تساوي الكهربائية الخاصة بها على شرائط تدرج pH موضعية. ثم يتم مسخ البروتينات الموجودة في الشريط ووضعها فوق هلام بولياكريلاميد نموذجي حيث يتم تثبيتها في مكانها باستخدام محلول هلام طازج. بعد ذلك، يتم إجراء فصل البعد الثاني بواسطة SDS-PAGE.

على الرغم من أن التركيز المتساوي الكهربائية ليس الخيار الوحيد للفصل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد، إلا أنه الأكثر شيوعاً. ويعد الفصل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد أداة لا تقدر بثمن توفر رؤى حول مجمعات البروتين وتنظيم العضيات الفرعية.

بعد تشغيل الهلام، تتمثل الخطوة التالية الشائعة جداً في نقل البروتينات من الهلام إلى غشاء مصنوع من PVDF أو النايلون للتحليل. يمكنك بعد ذلك استخدام أجسام مضادة محددة لفحص الغشاء والبحث عن البروتينات المستهدفة. تظهر هنا نتائج نموذجية لطبعة مناعية (immunoblot) حيث استخدم الباحث 3 تقنيات مختلفة لتضخيم الإشارة لتحديد أي منها يظهر بشكل أفضل وجود بروتين Pit-1 عبر عدد من التخفيفات المتسلسلة.

لقد شاهدتم للتو فيديو JoVE حول فصل البروتينات باستخدام تقنية SDS-PAGE. ينبغي أن تكونوا الآن على دراية بالخطوات المتبعة لفصل البروتين حسب الحجم باستخدام هذه التقنية القوية. وكما هو الحال دائماً، شكراً لكم على المشاهدة!

يُعد الفصل الكهربائي للهلام باستخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم وبولي أكريلاميد، أو SDS-PAGE، تقنية واسعة الاستخدام لفصل مخاليط البروتينات بناءً على حجم…