Name: قوية FISH DNA 3D استخدام مجسات إعتبر مباشرة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: تعلم تقنية FISH للحمض النووي ثلاثي الأبعاد باستخدام مجسات مُصنّفة مباشرة لتحليل البنية النووية في الخلايا الفردية. توفر هذه الطريقة رؤى قيمة حول التنظيم المكاني للجينوم وتفاعلات الجينات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل BBSRC ويلكوم ترست. ونود أن نشكر سايمون ووكر للحصول على المساعدة مع التصوير وفيليكس كروجر للمساعدة في تحليل المعلوماتية الحيوية.

<ol><li>Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+transcription%3A+shaping+the+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Replication and transcription: shaping the landscape of the genome.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 669-677 (2005).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li>
<li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+3C+technologies%3A+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26, 11-24 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, USA. (2000).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome Res. 19, 901-909 (2011).</li>
<li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26, 10-18 (2002).</li>
<li>Hewitt, S. L., Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nat. Immunol. 10, 655-664 (2009).</li>
<li>Solovei, I., Cavallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+preservation+of+nuclear+chromatin+architecture+during+three-dimensional+fluorescence+in+situ+hybridization+%283D-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Spatial preservation of nuclear chromatin architecture during three-dimensional fluorescence in situ hybridization (3D-FISH.</a> Experimental Cell Research. 276, 10-23 (2002).</li>
<li>Solovei, I. FISH on three-dimensionally preserved nuclei. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolovei%2C+I+%22FISH%3A+A+Practical+Approach%22">FISH: A Practical Approach</a>. Beatty, B., Mai, S., Squire, J. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).</li>
<li>Krueger, C., King, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairing+of+homologous+regions+in+the+mouse+genome+is+associated+with+transcription+but+not+imprinting+status%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pairing of homologous regions in the mouse genome is associated with transcription but not imprinting status.</a> PLoS One. 7, e38983(2012).</li>
<li>Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on Cultured Cells Combined with Immunostaining. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolovei%2C+I+%22Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+Protocols+and+Applications%22">Fluorescence in situ hybridization (FISH): Protocols and Applications</a>. Bridger, J. M., Volpi, E. V. , Humana Press. New York, New York, USA. (2010).</li>
</ol>

وقد رعت إنتاج هذه المادة جزئيا بواسطة كارل زايس وMetaSystems.

أصبح FISH DNA 3D أداة المعترف بها على نطاق واسع لتحليل الترتيبات المكانية في النواة. بينما FISH يوفر نتائج البصرية ومباشرة، كما هو الحال مع كل تقنية، ويحتاج المرء أن يكون مدركا لحدوده. يواجه FISH DNA المشكلة الكامنة أن هناك حاجة إلى علاجات قاسية نسبيا لجعل لونين للوصول للتحقيقات السمك الذي يعطل في النهاية النووية هيكل الشيء الذي هو ليتم تحليلها. اتبعت عدة استراتيجيات لتزييف الوصول والحفاظ على هيكل. في بروتوكول الموصوفة هنا، يتم الوصول إليها عن طريق الحمض النووي الكروموسومات permeabilization تجميد ذوبان الجليد من الخلايا وتمسخ الحرارة قبل التهجين التحقيق. Solovei، وآخرون، (2002) بتحليل التغيرات الهيكلية بعد معاملة مماثلة، ووجدت أن متوسط ​​النزوح من المجالات لونين كان 300 نانومتر مما يحد القرار من التحليل البنيوي إلى ما يقرب من 1 ميغابايت في مناطق الجينوم 8. في حين أن هذا ليس ارتفاع القرار، وذلكهو مقياس معقول لتحليل الموقف النووي. وهناك اعتبار أكثر عملية للتحليل FISH هو أن الحصول على الصور وقياسات للمسافات النووية هي العمليات تستغرق وقتا طويلا مما يحد من عدد النوى التي يمكن تحليلها. من أجل دراسة الأحداث نادرة كنا نهدف إلى القيام عالية الإنتاجية التصوير الآلي. ثم، مع وجود ضوابط مناسبة في مكان، بأعداد كافية ويمكن مقارنة للسماح للتحليل الإحصائي قوية من العلاقات المكانية. نحن نحلل بشكل روتيني 600 نواة لكل نقطة البيانات التي لدينا تحديد إحداثيات 3D من جميع الاشارات FISH ضمن وحدة التخزين النووي. تتطلب هذه البيانات مساحة التخزين القليل جدا، والسماح لتحليل المسافات بين وداخل أليلية، أو مواقف شعاعي في أي نقطة في وقت لاحق. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يتم التجهيز الآلي بطريقة الباحث الأعمى الذي يقلل بدرجة كبيرة من احتمال التحيز اللاوعي. لتمكين هذا النوع من analys إنتاجية عاليةهو، كان هدفنا لإقامة وسيلة سريعة وفعالة لأداء FISH الحمض النووي. وجدنا بروتوكول الموصوفة هنا أن تكون قوية للغاية، وتنتج باستمرار إشارات مشرق مع خلفية منخفضة. لأنها عملت كل أنواع الخلايا حاولنا شريطة أن تتكيف الخطوة من ربط الخلايا على الشريحة. وعلاوة على ذلك، مع استثناء واحد، كل تسلسل كروموسوم البكتيريا الصناعي كنا يمكن أن تتحول إلى تحقيقات مشرق. ونحن أيضا الكشف بنجاح عددا من البروتينات النووية من قبل تلوين الأجسام المضادة بعد FISH الحمض النووي. بينما لبعض البروتينات هذا يعمل بشكل جيد، ونحن نوصي مقارنة مع التقليدية المناعي (IF) لضمان الاتساق في نمط تلوين الأجسام المضادة بين IF والحمض النووي المناعية FISH (قارن 11). عموما، وجدنا أن تحقيقات المسمى في الألوان المختلفة التي تنتج نفس النتائج. ومع ذلك، ينبغي النظر في الجوانب التالية عند اختيار الصبغة وضع العلامات. أولا، ولون من fluorophore يجب أن يكون كشفها بشكل جيد من قبل يو المجهرااا. ثانيا، يتعين على الطول الموجي للضوء المنبعث من fluorophores تكون مختلفة بما فيه الكفاية لتجنب تنزف من خلال في القناة الأخرى. وهذا يعتمد على عوامل التصفية في المجهر. والثالث، على الأقل في أيدينا، وبعض الألوان تنتج إشارات مشرق أكثر اتساقا من غيرهم. وقد استخدمنا دائما دابي (الأزرق) على أنه مباين مما يجعل اليكسا فلور 555 (الحمراء)، 488 (أخضر)، و647 (الحمراء بعيدة) خيارات جيدة لوصفها تحقيقات. مع نظام التصوير لدينا، وجدنا اليكسا فلور 555 (الحمراء) لإنتاج ألمع الإشارات، تليها اليكسا فلور 488 (أخضر). فلور اليكسا 647 (بعيدا الحمراء) لديه عيب وأنه لا يمكن الكشف عنها بواسطة العين البشرية وبالتالي عدم وجود إشارات يمكن أن ينظر إليه عند النظر إلى أسفل المجهر. وبالتالي، إذا فعل FISH اللونين، نوصي مزيج من الأصباغ الحمراء والخضراء. قد تنشأ اثنين من المشاكل الرئيسية: الخلايا غسل قبالة الشرائح والإشارات الضعيفة. كيف الخلايا جيدا التمسك الشريحة هو betw متغير بشكل كبيرأنواع الخلايا التابعين، وأفضل بروتوكول لتسوية / بذور الخلايا يحتاج يحدد لاحقا. لقد استخدمت بنجاح إما موجبة أو الشرائح المغلفة بولي-L-يسين (اشترى جاهزة للاستخدام)، ولكن العثور على خلايا الالتزام عموما أفضل على الشرائح المغلفة بولي-L-يسين. وجدنا أيضا أنه عندما كانت خلايا من شأنه مناطق بأكملها كثيفة جدا تقشر ورقة، في حين كان يعوق التصوير الآلي إذا كانت الخلايا متفرق جدا. وبالتالي، إذا كانت العينة ليست ثمينة جدا، وينبغي أن يكون المصنف أعداد مختلفة من الخلايا لتحديد كثافة مثالية. إذا الخلايا عرضة ليغسل بشكل خاص، قلم حاجز مسعور يمكن استخدامها، ويمكن تنفيذ الخطوات FISH من قبل pipetting بعناية حلول مباشرة على الشريحة. pipetting لأيضا يقلل بشكل كبير من حجم الكواشف اللازمة، ولكنه يأخذ فترة أطول بكثير عند القيام عدة شرائح. الإشارات الضعيفة وعادة ما تكون بسبب تحقيقات الفقراء، وأنها تستحق استثمار الوقت في صنع الجيد منها. نظيفة BAC الحمض النووي ينبغي استخدامد في بدء المواد التي يمكن الحصول عليها عن طريق الترسيب المتكررة أو مجموعات المتاحة تجاريا. التلوث مع الحمض النووي الجيني البكتيري يؤثر سلبا على نوعية التحقيق ومعالجة متأنية خلال تحلل الخلايا وتصفية من المحللة الخلية هو مطلوب للحفاظ على الحد الأدنى. هو عليه، ومع ذلك، ليس من الضروري استخدام خطوة نوكلياز خارجية لهضم الحمض النووي الخطية، لأن هذا يقلل بدرجة كبيرة من المحصول. وضع العلامات كفاءة لجنة التحقيق أمر بالغ الأهمية. مراقبة الجودة الأكثر أهمية لهذه الخطوة هو التحقق من حجم شظية بعد نيك ترجمة (انظر ممثل النتائج). سوف مسحة &#39;جيدة&#39; يؤدي دائما تقريبا في التحقيق الملونة الزاهية. ومع ذلك، فقد وجدنا أن في بعض الأحيان على بعض BAC لا يمكن معالجتها في تحقيق جيد، وBAC مختلفة تحتاج إلى أن يتم اختيار. خطوة هامة أخرى هي تمسخ الحرارة. إذا كانت درجة الحرارة منخفضة جدا، فإن الحمض النووي أن يكون إلا جزئيا والتشويه والتحريف، سوف تضعف والتهجين التحقيق. إذا كانت درجة الحرارة مرتفعة جدا وبناء واي النوويةسوف يكون قلق أكثر من اللازم. في أيدينا، 78 ° C على كتلة الساخنة المقلوب هو الحل الوسط المثالي، ولكن هذا قد تختلف اعتمادا على كتلة الساخنة منها استخدامها. لقد حققنا نتائج جيدة باستخدام Vectashield المتوسطة المتزايدة، ولكن وجدت أن SlowFade الذهب لديه أقل الخلفية ويحافظ على إشارة الفلورسنت لمدة أطول. نحن لا نوصي باستخدام الصلب مجموعة المتوسطة المتزايدة كما وجدنا أن يؤثر ذلك على هيكل 3D وتشكيل فقاعات الهواء مع مرور الوقت. في الختام، الزاهية الفلورسنت تحقيقات صفت مباشرة مع بروتوكول FISH الحمض النووي الموصوفة هنا نقدم حلا فعالة لتحليل قوي وسريع للهندسة النووية والتي تنطبق على طائفة واسعة من المسائل البيولوجية.

الحمض النووي مضان التهجين في الموضع (FISH DNA) يسمح التصور ثلاثي الأبعاد من مواضع الجينات الفردية، المجالات subchromosomal والكروموسومات حتى بأكمله خلال جميع مراحل دورة الخلية. يستخدم FISH 2D للدراسات الطورية بينما السمك 3D وقد استخدم على نطاق واسع للتحقيق في العلاقة بين التنظيم المكاني للجينوم وظيفتها أثناء الطور البيني (1،2 والمراجع فيه). تاريخيا، تم إجراء دراسات المشارك جمعية عن طريق التحقيق في عشرات ومئات من مواضع الفردية من قبل الأسماك. وقد وضعت أكثر قوة في الآونة الأخيرة تقنيات عالية الإنتاجية المستندة إلى 3C مثل 4C ومرحبا-C 3، مما يسمح التحقيق في الجزيئية عبر الحديث بين عدة آلاف من مواضع مختلفة. في حين التقنيات المعتمدة على 3C والأسماك الحمض النووي يمكن أن تكون أساليب تكميلية، فإنها لا تجيب بالضرورة نفس الأسئلة. على أساس أساليب 3C توفير قراءات الفرقة من السكان الخلية المختلطة، مما أدى إلى probabilإيتي لمشاركتها في الجمعيات. في المقابل، في حين انخفاض في الإنتاجية، التقنيات المعتمدة FISH توفر إمكانية لتحليل الترتيبات المكانية من مواضع أو الكروموسومات في الخلايا الفردية وفقا لنمو أو خلية مراحل دورتهن. وبالتالي، سوف FISH الاستمرار في أن تكون أداة هامة لبحث العلاقات هيكل الوظائف النووية. هناك نوعان من الاعتبارات الرئيسية في أداء ناجح التجارب السمك 3D. هذه هي: 1. الحصول على تحقيقات المسمى على النحو الأمثل و2. اختيار العلاجات الخلوية، بما في ذلك التثبيت، وقبل خطوات ما بعد التهجين، للحفاظ على مورفولوجيا النووية قدر الإمكان في حين جعل الحمض النووي يمكن الوصول إليها بما فيه الكفاية لتهجين التحقيق. وضع العلامات التحقيق كفاءة من المهم للغاية بالنسبة للأسماك. تقليديا، وقد استخدمت نيك الترجمة لعرض إما ناشبة أو النيوكليوتيدات fluorophore مترافق 4. وبالمثل، هي مجموعات نيك الترجمة التجارية المتاحة للناشبة مباشرة أو دمج fluorophore، بور أيضا لوضع العلامات على مرحلتين باستخدام النيوكليوتيدات aminoallyl والأصباغ أمين التفاعلي. وهذا الأخير يجعل التأسيس صبغ أكثر كفاءة من خلال إعطاء البلمرة DNA جزيء أقل حجما للعمل مع. وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير مجموعات لوضع العلامات غير الأنزيمية من الحمض النووي التي تستغل ملزم التنسيقية للالبلاتين إلى الأحماض النووية. يمكن حتى تحقيقات FISH شراؤها صفت بالفعل 5. بينما مجموعات وتحقيقات تصنيعها تجاريا لا شك يعطي سهولة الاستخدام، فهي أكثر تكلفة بكثير من شراء المكونات الفردية وإنتاج تحقيقات في المنزل. نحن الأمثل بروتوكول ترجمة نيك منخفضة التكلفة من أجل تسمية مباشرة العديد من تحقيقات BAC مختلفة في ألوان متعددة. اكتشفنا أن الحصول نقية للغاية DNA BAC أمر بالغ الأهمية والنتائج في اشتراط فقط 10-20 نانوغرام من مسبار لكل شريحة FISH، مقارنة ب 10 - 20 أضعاف أكثر عند استخدام نجس الحمض النووي القالب، مما أدى إلى كبرى من حيث التكلفة والوقت الادخار. استخدام الأميني allyldUTP يسمح وضع العلامات مرنة منتحقيقات مع الأصباغ المتاحة أمين التفاعلي (مثل اليكسا فلور أو قبرصي، صبغ) أو الأنواع ل(مثل البيوتين، digoxigenin). تم الكشف عن تحقيقات ناشبة المسمى من قبل الأجسام المضادة، مترافق fluorophore أو streptavidin لتضخيم وتصور إشارة. مشرق تحقيقات صفت مباشرة تظهر عادة أقل تلوين الخلفية وتجنب الإفراط في تضخيم الإشارات، وبالتالي يؤدي إلى تمثيل أكثر دقة للتوطين النووية والتشكل مكان. هناك العديد من التقنيات الأسماك المختلفة التي تستخدم مثبتات مختلفة، ما قبل العلاج، ويغسل بعد التهجين ولكن هذه تندرج عموما في الفئات التالية: تثبيت غلوتارالدهيد مع هيدروكسيد الصوديوم تمسخ، تثبيت الفورمالديهايد مع حمض الهيدروكلوريك تمسخ، وتثبيت الفورمالديهايد مع تمسخ حرارة 6-9 . كل من هذه مزاياه وعيوبه. النتائج تثبيت غلوتارالدهيد في المحافظة جيدة الهيكلية النووية، ولكنها تتطلب العلاج مع عوامل الاختزال إلى تقليلتألق ذاتي الناتجة عن ذلك، والعلاج هيدروكسيد الصوديوم يحتاج إلى أن تسيطر عليها بعناية لتحقيق التوازن تمسخ الحمض النووي كافية والأضرار المحتملة لهيكل النووية 6. تثبيت الفورمالديهايد هو أقل قوة، وهو ما يعطي احتمال زيادة الاضطرابات العمارة النووية، ولكن أيضا عادة إشارات أقوى وأكثر موثوقية وأقل تألق ذاتي 9. حمض الهيدروكلوريك العلاج depurinates الحمض النووي والبروتينات من الشرائط، وتوفير سهولة الوصول إلى الحمض النووي للتحقيقات، ولكن قد يعرض أيضا فواصل الحمض النووي. التدفئة يفصل جسديا حمض النووي، الذي أسفر عن هدف جيد التهجين وإشارات قوية ولكن يمكن أن يسبب بعض الاضطراب من هيكل النووية 8. الدرجة التي كل من هذه التقنيات تؤثر الحواتم بروتين تختلف على نطاق واسع 6،9، مما أدى إلى الشرط لتحديد تجريبيا لكل بروتين بروتوكول الأمثل لاستخدامها في التجارب المناعية FISH. في حين ليس هناك &#39;الكمال&#39; الحمض النووي FISH الشركة المصرية للاتصالاتchnique، أنها يمكن أن تكون مفيدة إذا كل تسيطر عليها بشكل جيد. كان هدفنا لتحسين بروتوكول للقوة واستنساخه FISH الحمض النووي للتحقيق لتحديد المواقع المكانية للمواضع متعددة في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا 10، مع التركيز على طريقة التدفئة بالنسبة لمعظم إشارات موثوقة. مع هذا، واستخدام نظام التصوير الآلي نحن تهدف إلى زيادة الإنتاجية للتحليل خلية واحدة من الترتيبات النووية.

<table><tr><tbody><td colspan = "4" >Reagent / Material</td></tr><tr><td>NTB</td><td></td><td></td><td>buffer الخطوة 1.1.1 (انظر قائمة "مخازن FISH ومزيج التفاعل" أدناه)</td></tr> <tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>D-1532</td><td>الخطوة 1.1.1</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td>الخطوة 1.1.1 (انظر قائمة "مخازن FISH ومزيج التفاعل" أدناه)</td></tr> <tr><td>Aminoallyl-dUTP</td><td>Ambion</td><td>AM8439</td><td>الخطوة 1.1.1</td></tr><tr><td>بوليميراز الحمض النووي I</td><td>نيو إنجلاند بيولابز</td><td>M02095</td><td>الخطوة 1.1.1</td></tr><tr><td>DNase I المؤتلف الخالي من RNase</td><td></td><td>Roche 4716728001</td><td>الخطوة 1.1.1</td></tr><tr><td>طقم تنقية QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>الخطوة 1.1.4 ، 1.2.3</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>VWR</td><td>27653</td><td>الخطوة 1.1.5 ، الخطوة 2.1.1.2</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>الخطوة 1.2.1</td></tr><tr><td>عبوات الصبغة التفاعلية من Alexa Fluor لتطبيقات المصفوفات الدقيقة</td><td>Invitrogen (المجسات الجزيئية)</td> <td>A32750 ، A32756 ، A32757</td><td>الخطوة 1.2.2</td></tr><tr><td>DMSO (اللامائية) </td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>الخطوة 1.2.2</td></tr><tr><td>SYBR صبغة هلام الحمض النووي الآمنة</td><td>Life Technologies</td><td>S33102</td><td>الخطوة 1.2.4 (بديل لبروميد الإيثيديوم)</td></tr> <tr><td>Cot-1 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td>الخطوة 2.1.1.1 (يمكن أن يكون الحمض النووي Cot-1 مصنوعا محليا بكميات كبيرة ويعمل أيضا)</td></tr> <tr><td>الحمض النووي أحادي السبل من خصيتي السلمون </td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td>الخطوة 2.1.1.1</td></tr><tr><td>فورماميد منزوع الأيونات</td><td>Sigma</td><td>F-9037</td><td>الخطوة 2.1.1.3 (مخاطر صحية)</td></tr> <tr><td>كبريتات ديكستران</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8906</td><td>الخطوة 2.1.1.4 (انظر قائمة "مخازن FISH ومزيج التفاعل" أدناه)</td></tr> <tr><td>مجسات الطلاء XMP</td><td>MetaSystems</td><td>000000-0528-837</td><td>الخطوة 2.1.1.4 </td></tr><tr><td>الشرائح المطلية ب Poly-L-lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0425</td><td>الخطوة 2.1.2</td></tr><tr><td>القلم الكارهة للماء (ImmEdge)</td> <td>مختبرات المتجهات</td><td>H-4000</td><td>الخطوة 2.1.2</td></tr><tr><td>70 & م غربال (الماوس f & # 8211 ؛ خلايا الكبد التالية فقط)</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td>الخطوة 2.1.2.1</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>الخطوة 2.1.3 (قابلة للاشتعال ، قابلة للتآكل ، سمية حادة ، مخاطر صحية) (انظر قائمة "مخازن FISH ومزيج التفاعل" أدناه)</td></tr> <tr><td>Tris-Cl</td><td></td><td></td><td>الخطوة 2.1.3 (انظر قائمة "مخازن FISH ومزيج التفاعل" أدناه)</td></tr> <tr><td>Saponin من لحاء Quillaja</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td>الخطوة 2.1.4 ، 2.1.11 (السمية الحادة) ، (انظر قائمة "مخازن FISH ومزيج التفاعل" أدناه)</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>الخطوة 2.1.4 ، 2.1.11 (السمية الحادة ، الخطورة على البيئة)</td></tr> <tr><td>10 × PBS</td><td>Life Technologies (GIBCO)</td> <td>70011-036</td><td>الخطوة 2.1.4 ، 2.1.5 ، 2.1.6 ، 2.1.8 ، 2.1.10 ، 2.1.11 ، 2.1.12 ، 2.2.7 ، 2.2.9 ، </td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G / 0650</td><td>الخطوة 2.1.6</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20252</td><td>الخطوة 2.1.9 (السمية الحادة ، المسببة للتآكل)</td></tr> <tr><td>فورماميد</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>47670</td><td>الخطوة 2.1.14 ، 2.2.3 (المخاطر الصحية)</td></tr> <tr><td>SSC</td><td></td><td></td><td>الخطوة 2.1.14 ، 2.2.2-2.2.6 ، 2.2.8 (انظر قائمة "مخازن FISH ومزيج التفاعل" أدناه)</td></tr> <tr><td>أغطية 22 × 22</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022022A1</td><td>الخطوة 2.1.15</td></tr><tr><td>أغطية 22 × 50</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td>الخطوة 2.1.15</td></tr><tr><td>الأسمنت المطاطي</td><td>Marabu</td><td>2901 (10 000)</td><td>الخطوة 2.1.15 (قابلة للاشتعال ، مخاطر صحية ، خطر على البيئة)</td></tr> <tr><td>مجسات جزيئية DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>الخطوة 2.2.8 (مخاطر صحية)</td></tr> <tr><td>SlowFade Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td>الخطوة 2.2.10 (وسط تصاعد) طلاء</td></tr> <tr><td>الأظافر الشفاف</td><td>أي مورد</td><td></td><td>الخطوة 2.2.10</td></tr><tr><td colspan = "4" ><قوي>المعدات< / قوي></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>الخطوة العلمية</td><td></td><td>الحرارية 1.1.6 ، 1.2.4 (التحليل الطيفي للحجم الصغير)</td></tr> <tr><td>إعصار FLA 7000 فوسفوصورر</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td>الخطوة 1.2.4</td></tr><tr><td>برطمانات كوبلين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6016 (6EA) / S5516 (6EA)</td> <td>الخطوة 2.1.3 فصاعدا</td></tr><tr><td>النيتروجين السائل dewar </td><td>أي خطوة مورد</td><td></td><td> 2.1.7</td></tr><tr><td>قاعدة بغطاء أسود (غرفة محكمة الضوء)</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>الخطوة 2.1.17</td></tr><tr><td>Thermomixer Comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>الخطوة 2.2.3 (أو استخدم شاكر في 37 درجة ؛ C room)</td></tr><tr> < td colspan = "4" ><قوي>التصوير ومعالجة الصور </td></tr><tr><td>Metafer - منصة أتمتة التصوير</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>برنامج التصوير الآلي</td></tr><tr><td>MetaCyte - التحليل البيني الآلي FISH</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>برنامج التصوير الآلي</td></tr><tr><td>Axio Imager Z2 مجهر</td><td>Zeiss</td><td></td><td>المستقيم يستخدم مع التصوير الآلي</td></tr><tr><td>المجهر متحد البؤر IX81 (FV1000)</td>مجهر <td>أوليمبوس</td><td></td><td>متحد البؤر</td></tr><tr><td>Bitplane ، الإصدار 7.3</td> تحليل صور <td>Imaris</td><td></td><td>وبرنامج النمذجة ثلاثية الأبعاد</td></tr><tr><td>الحجم العلمي ، الإصدار 4.1</td> برنامج <td>تحليل الصور وإزالة الالتفاف</td> <td>Huygens</td><td></td></tr> <tr>< td colspan = "4" > FISH المخازن المؤقتة ومزيج التفاعل <table border = "1" > <tbody > <tr > <td > name < td > <td > Composition < / td > < td > Comments < td > < tr > <tr > <td > 10 × NTB buffer < / td > < td > 0.5 M Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 < / td > < td >< / td > < tr > <> <tr td >< / td > <td > 0.05 M MgCl2 < / td > < td >< / td > < tr > <tr > < td >< / td > < td > 0.5 مجم / مل BSA < / td > < td>< / TD > < / tr > <tr > < td > dNTP Mix < / td > < td > 0.5 mM dGTP < / td > < td > Store 50 & mu ؛ ل aliquots عند -20 درجة ؛ C< / td > < / tr > <tr > < td >< / td > < td > 0.5 mM dATP < / td > < td >< / td > < tr > <tr > < td >< td > < td > 0.5 mM dCTP < / td > < td >< / td > < > <tr > < td >< td > < td > 0.125 mM dTTP< / td > < td >< / td > < / tr > <tr > <td >4٪ PFA < / td > <td > وزن 4 جم / 100 مل PFA في PBS وقم بتسخينه إلى 62 درجة مئوية. اضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم إلى 7.0 لإذابة PFA المتبقي < / td > <td > قم بتخزين 50 مل من الحصص عند -20 درجة ؛ ج ، لا تقم بإعادة التجميد < / td > < / tr > <tr > < td >2٪ محلول الصابونين < / td > < td > قم بإذابة 2 جم من الصابونين لكل 100 مل من PBS عن طريق التحريك الممتد. قم بإذابة وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. أحضر إلى 1 لتر مع ddH20 والأوتوكلاف. < / td > < td > قم بتخزين 5 مل من الكميات عند -20 درجة ؛ C< / td > < / tr > <tr > < td > 20 × SSC < / td > < td > تزن 175.3 جم كلوريد الصوديوم و 88.2 جم سترات الصوديوم وأضفها إلى 80 مل ddH20 . قم بإذابة وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. إحضار إلى 1 لتر مع ddH20 والأوتوكلاف < / td > < td >< / td > < / tr > <tr > <td > مزيج كبريتات ديكستران < / td > < td > 20٪ كبريتات ديكستران في 2 × عازلة SSC ؛ محلول دوامة واخلطه على الروك بين عشية وضحاها.< / td > < td > Store 500 & mu ؛ ل aliquots عند -20 درجة ؛ C< / td > < / tr > < / tbody > < / table> </td></tr></tbody></table>

قوية fish dna 3d استخدام مجسات إعتبر مباشرة

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

أصبح FISH DNA 3D أداة رئيسية لتحليل منظمة ثلاثي الأبعاد للنواة، ونشرت العديد من الاختلافات من هذه التقنية. في هذه المادة ونحن تصف البروتوكول الذي تم الأمثل لمتانة، استنساخ، وسهولة الاستخدام. يتم إنشاؤها الزاهية الفلورسنت تحقيقات صفت مباشرة من قبل نيك الترجمة مع الأميني allyldUTP تليها اقتران الكيميائية للصبغ. يتم تنفيذ 3D FISH الحمض النووي باستخدام خطوة تجميد أذاب لpermeabilization الخلية وخطوة التسخين لتمسخ في وقت واحد من التحقيق والدنا النووي. البروتوكول ينطبق على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ومجموعة متنوعة من المسابير (تسلسل كروموسوم البكتيريا الصناعي، البلازميدات، fosmids، أو دهانات كروموسوم الجامعة) ويسمح للتصوير الآلي عالية الإنتاجية. مع هذا الأسلوب بشكل روتيني ونحن التحقيق في توطين النووية لمدة تصل إلى ثلاث مناطق الكروموسومات.

بروتوكول الموصوفة هنا (الشكل 1 لمحة عامة) وقد استخدمت لتأثير كبير على الجمع بين الحمض النووي FISH مع الإنتاجية العالية التقاط الصور للتحليل من منظمة الجينوم. الجيل تحقيقات نوعية جيدة أمر بالغ الأهمية لنجاح (انظر المناقشة). الشكل 2 يوضح اثنين من ضوابط الجودة مهمة لتحقيقات FISH. بعد نيك الترجمة، يجب أن مسحة من الحمض النووي تكون واضحة مع الجزء الأكبر من شظايا تشغيل ما بين 150 و 700 سنة مضت (الشكل 2A). بعد اقتران الكيميائية، إدماج صبغة الفلورسنت يمكن قياسه من خلال التحليل الطيفي لجنة التحقيق (الشكل 2B). عند استخدام تحقيقات جيدة، بعد بروتوكول FISH DNA عادة ما ينتج في إشارات FISH DNA مشرق على خلفية منخفضة. وقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول على مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا، وإما مع المجاهر برنامج التحصين الموسع ومضان أو متحد البؤر. التصوير الآلي باستخدام برنامج التحصين الموسع-fluorescenc<html> ه المجهر يتطلب، إشارات FISH يسهل التعرف عليها حاد مع الخلفية قليلا (الشكل 3)، في حين أن الفحص المجهري متحد البؤر يتطلب إشارات أكثر كثافة. الشكل 4A يظهر ممثل الصور ومعالجتها. ويمكن الحصول على إحداثيات النووية من إشارات FISH، والعلاقات المكانية من مناطق الجينوم يمكن حسابها (للحصول على مثال انظر الشكل 4B). وقد استخدمنا أيضا مداخن صورة تم الحصول عليها عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ل 3D النمذجة من إشارات FISH داخل الأراضي كروموسوم الخاصة بهم (فيلم 1). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> الشكل 1. ويبين سير العمل لوضع العلامات التحقيق والأسماك الحمض النووي. إعداد دقق في الزرقاء. ويرد الإجراء FISH DNA باللون الأسود مع التفاصيل الواردة في اللون الأخضر. = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> الشكل 2. وضع العلامات تحقيقات من قبل نيك الترجمة ومراقبة الجودة من تحقيقات المسمى. A) جل تظهر مسحة مثالية قبل التسخين لتعطيل الدناز الأول (حارة 1: سلم الحمض النووي، لين 2 و 3: تسلسل كروموسوم البكتيريا الصناعي بعد نيك الترجمة). يجب أن تكون شظايا في BP مجموعة 150-700. كثيرا ما لوحظ حدوث تشويه إضافية في ~ 1 كيلو بايت مع ردود الفعل نيك الترجمة الناجحة. B) Microvolume تحليل الطيف الكامل للتحقيقات المسمى. ويلاحظ وجود ذروة الحمض النووي في 260 نانومتر مع ذروة الثانية المقابلة لطول الموجة الامتصاصية من fluorophore هو المسمى التحقيق مع: اليكسا فلور 488: 495 نانومتر، اليكسا فلور 555: 555 نانومتر، اليكسا فلور 647: 650 نانومتر. المعروضة هي ثلاثة تحقيقات مع إدماج جيدة: قمم الامتصاصية fluorophore هي ارتفاع مماثل أو أعلى من القمم الحمض النووي. اليكسا فلور 647 لديه عادة أعلى الامتصاصيةمن اليكسا فلور 555، والتي بدورها لديها الامتصاصية أعلى من فلور اليكسا 488. اليكسا فلور 488 أيضا يمتص بعض الضوء في 260 نانومتر، ومن هنا جاءت الذروة الأولى لهذا التحقيق هو أعلى من الآخرين. تحقيقات مع الفقراء إدراج عرض fluorophore الامتصاصية 2-3 أضعاف أقل من امتصاص الحمض النووي. تحقيقات مع أكثر من ذروة fluorophore أعلى 2 أضعاف من ذروة DNA تحتوي عادة صبغ اللامقترن التي قد تسبب الخلفية في الأسماك. <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> الشكل (3). لقطة شاشة من برنامج التصوير السمك 3D MetaCyte تظهر تجربة FISH ثلاثة ألوان نموذجية. وتنقسم الشاشة إلى عدة أجزاء. A) حقل من رأي (فوف) الصورة الخام التي تلتقطها Metafer / MetaCyte نظام مسح الشريحة. B) معرض من الصور التي تم تحديدها من نوى أن يكون للأمم المتحدة<html> dergone معالجة الصور وتجزئة للإشارات FISH. يمكن عرض أنواع مختلفة من البيانات على كل صورة معرض. في هذا المثال عدد الخلايا يظهر أعلى يسار مع مختلف والمسافات بين الألائل interlocus اليمنى العليا وعلى جانبي أسفل كل صورة. C) اسم الشرائح مع عدد من النوى التي تم تحديدها في التحليل. D) تصوير من الشريحة مع المنطقة الممسوحة ضوئيا من قبل نظام. E) توسيع المنطقة الممسوحة ضوئيا. بقع بيضاء تمثل نواة المحددة في مجال الرؤية. F) البيانات التي تتم معالجتها. في هذا المثال يتم عرض المسافات بين الألائل القصوى بين الإشارات الخضراء (أعلى) والإشارات الحمراء (القاع). البيانات المعروضة من P20 الخلايا الجرثومية الماوس. وتقع على الكروموسومات تحقيقات مختلفة، وتغطي سداسي البروم ثنائي الفينيل والجينات HBA وكتلة هيستون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . . ضمن الصفحات = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> الشكل 4. أمثلة من الصور المجهزة والبيانات الموضعية مشتقة. A صور) المجهزة للE13.5 الماوس خلايا الكبد الجنين ملطخة تحقيقات BAC تقع على الكروموسومات المختلفة التي تغطي MYC وKcnq1 الجينات (وهو ما يسمى MYC وKvDMR، الملونة الخضراء والحمراء، على التوالي). B) توكي المؤامرات مربع ضئيلة للغاية تمثل المسافة بين الألائل توزيع لنفس مواضع في 600 نواة. يتم رسم مسافة بين الألائل ككسر من نصف قطر نواة &#39;(المسافة / دائرة نصف قطرها) لحساب التغيرات في حجم النووية. ES نوى الخلايا لديها دائرة نصف قطرها حوالي 5 ميكرون. تحقيقات الأحمر بشكل ملحوظ أقرب معا من تحقيقات الخضراء (***: P &lt;0.01، المفردة اختبار t). البيانات من 10. الفيلم 1. 3D النمذجة اثنين من مواضع داخل كروموسوم ر بهمerritory. وصفت تحقيقين BAC تقع على مقربة من طرفي كروموسوم الماوس 7 (الأحمر وحتى الأحمر، (أبيض الزائفة ملونة)) وتهجين جنبا إلى جنب مع الطلاء كروموسوم كامل (الأخضر) إلى خلايا ES الماوس. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة الفيلم</a> .

نحن تصف بروتوكول قوية وتنوعا لتحليل العمارة النووي DNA من قبل الأسماك 3D باستخدام تحقيقات الفلورسنت صفت مباشرة.

قوية FISH DNA 3D استخدام مجسات إعتبر مباشرة

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

الهدف العام من التجربة التالية هو استقصاء التنظيم المكاني لمواقع جينومية محددة في الخلايا المفردة بطريقة قوية. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال توليد مجسات مُوسومة فلوريسنتياً للارتباط في النهاية بالمنطقة الجينومية المستهدفة وتحديدها. وتتمثل الخطوات التالية في تثبيت الخلايا المستهدفة ونفاذيتها على شريحة للسماح بوصول المجسات إليها.ثم يتبع ذلك تمسخ حراري متزامن للمسبار والحمض النووي الخلوي، تليها خطوات غسل لتهجين المسبار طوال الليل لإزالة المسبار المرتبط بشكل غير محدد، ثم الصبغ المضاد باستخدام dpi. ولتجسيد نتائج نواة الخلية، ستكشف المجهرية الفلورية في نهاية المطاف عن الموضع النووي الذي تشغله مناطق جينومية محددة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التنظيم النووي، مثل تحديد التفاعلات الوظيفية بين الجينات.تكمن الميزة الرئيسية لبروتوكول التهجين الموضعي المتألق (DNA FISH) هذا في كونه سريعاً وقوياً ومتعدد الاستخدامات. وعلى الرغم من أننا نستعرض هذه الطريقة باستخدام خلايا E Es، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على العديد من أنواع الخلايا الأخرى. وتنتج المجسات الموصومة مباشرة والمصنوعة من قطع تتراوح أطوالها بين 100 إلى 250 Kilobases إشارات ساطعة باستمرار، في حين يمكن استخدام مجسات أصغر إذا كانت هناك حاجة لذلك.استخدم 40 إلى 50 kilobase smid، أو حتى بلازميدات تحتوي على قطع مدرجة تتراوح بين 5 إلى 10 kilobase. حدد استنساخات back أو smid المقابلة لجينات معينة باستخدام متصفحات الجينوم ensemble أو UCSC. لتحضير DNA back عالي الجودة، استخدم إما الترسيب المتكرر أو طقمًا متاحًا تجاريًا، حيث تتناسب نظافة التحضير طردياً مع حجم المسبار المطلوب.يتم إجراء الوسم على خطوتين. أولاً، استخدم عملية الترجمة NIC لإدخال الأليل الأميني، DUTP. ثانياً، استخدم الاقتران الكيميائي لربط صبغة تفاعلية متوسطة AM.يستحق استثمار الوقت في تحضير مسابير ساطعة لأنها ضرورية للحصول على إشارات قوية للـ FISH. يمكن تنفيذ هذا الإجراء بالتوازي مع معالجة الخلايا، وليس بالضرورة القيام به في بداية اليوم. أولاً، اخلط من 10 إلى 20 نانوغرام من المسبار المسمى مباشرة مع 6 µL من CO 1D NA لكل 6 ميكروغرام.بعد ذلك، أضف 1 µL من DNA أحادي السلسلة المستخلص من خصى السلمون بتركيز 9.7 µg. اضبط حجم الخليط ليصل إلى 100 µL باستخدام الماء. ثم أضف 10 µL من خلات الصوديوم بتركيز 3 M و 275 µL من الإيثانول، واخلط المكونات باستخدام جهاز الـ vortex.اترك الخليط ليترسب لمدة ساعة واحدة على الأقل عند -20 °C. بعد ذلك، قم بطرد الراسب مركزياً في جهاز طرد مركزي دقيق (micro fuge) بأقصى سرعة لمدة 30 دقيقة عند 4 °C. ثم اغسل الراسب بـ 70% ethanol وقم بطرده مركزياً مرة أخرى لمدة خمس دقائق عند 4 °C.بعد ذلك، جفف الراسبة في الهواء. ثم أعد تعليقها. قم بتعليقها في 5 µL من الماء منزوع الأيونات.يتم التحضين في درجة حرارة 37 °C مع الرج بسرعة 1000 RPM، مع تغليف الأنابيب برقائق الألومنيوم لحمايتها من الضوء. وبعد مرور 30 دقيقة، يتم إضافة 5 µL من خليط دكسترين سلفات ومواصلة التحضين مع الرج لمدة 10 دقائق إضافية. تختلف قدرة الخلايا على الالتصاق بالشريحة بشكل كبير حسب نوع الخلية.لكل نوع من الخلايا، حدد وقت الترسيب الأمثل وكثافة الخلايا تجريبيًا. وللحصول على نتائج متسقة، يجب أن تكون الخلايا في معلق خلوي أحادي. لتثبيت خلايا ES الفأرية على شريحة، ابدأ برسم دائرة حول المنطقة التي سيتم وضع نقاط الخلايا فيها على الشريحة.باستخدام قلم كاره للماء، قم بتحضير معلق يحتوي على 20 إلى 50,000 خلية لكل 80 إلى 100 µL في وسط استزراع عادي، ثم أضف معلق الخلايا داخل الدائرة واترك الخلايا تلتصق لمدة ثلاث ساعات تقريبًا في حضانة رطبة. بعد التصاق الخلايا بالشريحة، قم بتثبيت الخلايا عن طريق غمر الشريحة بلطف في 4% PFA لمدة 10 دقائق. يجب أن تكون الشريحة مسطحة في صينية تشبه صندوق الرؤوس (tip box).استخدام كواشف بدرجة حرارة الغرفة في أوعية كوبلان. أولاً، يتم تثبيت الخلايا باستخدام كلوريد تريس لمدة 10 دقائق. ثانياً، يتم نفاذ الخلايا باستخدام مزيج من السابين وTriton X 100 لمدة 10 دقائق.الآن، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في كل غسلة. بعد عمليات الغسل، قم بتحضين الخلايا في 20% glycerol لمدة 20 دقيقة على الأقل. في هذه المرحلة، يمكن تخزين الشرائح في 50% glycerol عند درجة حرارة -20 °C لعدة أسابيع.يجب أن يؤدي التخزين لمدة يوم أو أكثر إلى زيادة قوة الإشارة. تأكد من موازنة درجة حرارة الخلايا لتصل إلى درجة حرارة الغرفة في 20%glycerol في PBS قبل المتابعة. الآن، قم بتجميد وإذابة الشريحة ثلاث مرات باستخدام النيتروجين السائل.يتم التعامل مع شريحة واحدة في كل مرة عند توقف صوت الفرقعة. بعد بضع ثوانٍ، تُنقل الشريحة إلى مناديل ورقية لإذابة الثلج، مع الانتظار حتى يختفي الجلسرول المجمد المعتم قبل تجميد الشريحة مرة أخرى؛ ويمكن معالجة ما يصل إلى 15 شريحة بسهولة بالتناوب لثلاث دورات من التجميد والإذابة. الآن، تُغسل الشرائح مرتين في PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة.ثم يتم تحضين الشرائح في حمض الهيدروكلوريك بتركيز 0.1 molar لمدة 30 دقيقة. تلي معالجة حمض الهيدروكلوريك عملية غسل أخرى في PBS لمدة خمس دقائق. والآن يتم نفاذ الخلايا مرة أخرى باستخدام خليط أقوى من sapin و Triton X 100 لمدة 30 دقيقة، ولغسل المواد الخافضة للتوتر السطحي من على الشرائح، استخدم غسلتين بـ PBS لمدة خمس دقائق لكل منهما.الشرائح الآن جاهزة للموازنة في محلول form amide بتركيز 50% في XSSC. يجب أن تستمر هذه العملية لمدة 10 دقائق على الأقل؛ وأثناء الموازنة، قم بسحب المسبار بالماصة للأعلى والأسفل عدة مرات، ثم انقل 10 µL لكل بقعة خلوية إلى شريحة غطاء ذات حجم مناسب. أخرج شريحة من محلول form amide وجفف أي سائل زائد حول الخلايا باستخدام مناديل ورقية، مع الحرص على عدم السماح للبقعة الخلوية بالجفاف.الآن اقلب غطاء الشريحة. مرره فوق الخلايا على الشريحة. ثم قم بإغلاق غطاء الشريحة وتثبيته بالشريحة باستخدام الأسمنت المطاطي.اترك الإسمنت ليجف تماماً واحفظ الشريحة بعيداً عن الضوء. بعد ذلك، قم بتسخين الشرائح عند 78 °C لمدة دقيقتين بالضبط باستخدام صفيحة تسخين. ومن الضروري تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح.يجب استخدام غطاء لحماية الخلايا من الضوء خلال هذه الخطوة للحفاظ على شكل النواة قدر الإمكان. ومن الضروري عدم ترك الخلايا تجف والتأكد من أن جهاز التسخين (heat bloc) مضبوط على درجة الحرارة الصحيحة. بعد ذلك، توضع الشرائح في صندوق معتم ومحكم الإغلاق مع مناشف ورقية مبللة لتوفير الرطوبة، وتُحضن طوال الليل عند 37 °C.ابدأ هذا الإجراء بإزالة الغراء المطاطي من حول شرائح التغطية. ثم ضع كل شريحة في كمية فائضة من SC حتى ترتخي شرائح التغطية وتنزلق. بعد ذلك، اغسل الشرائح في form amide بتركيز 50% في ضعف كمية SC لمدة 15 دقيقة عند 45 °C.حافظ على غطاء الحمام المائي لحمايتها من الضوء. بعد ذلك، اغسل الشرائح في 0.2 XSSC لمدة 15 دقيقة عند 63 °C. ثم في 2 XSSC لمدة خمس دقائق عند 45 °C، وأخيراً في محلول SE بكمية وافرة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.تُجرى الخطوات المتبقية جميعها في درجة حرارة الغرفة، بدءاً بعملية غسل لمدة خمس دقائق باستخدام PBS، ثم صبغ الشرائح بـ dappy لمدة دقيقتين، وبعد ذلك إزالة الصبغة الزائدة من الشرائح باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. ولتركيب غطاء الشريحة، ضع 10 µL من وسط التثبيت لكل بقعة خلوية على غطاء شريحة بالحجم المناسب. ثم جفف فائض PBS من حول البقعة الخلوية مع الحرص على عدم جفاف الخلايا.اقلب الغطاء، ثم وضعه على الشريحة وأحكم إغلاقه باستخدام طلاء الأظافر وفقاً لبروتوكول تحضير مسبار السمك. بعد عملية ترجمة NIC، يجب أن تكون لطخة DNA مرئية، حيث يتراوح حجم معظم الشظايا بين 150 و 700 base pairs. وبعد الاقتران الكيميائي، يمكن قياس دمج الصبغة الفلورية عن طريق التحليل الطيفي لمرور المسبار.تعد خطوات مراقبة الجودة هذه للحكم على جودة المسبار أمراً بالغ الأهمية عند استخدام مثل هذا المسبار. وقد كان التصوير الآلي باستخدام مجهر الفلورة فوق الرأس (epi fluorescence microscope) ممكناً، وهذا يتطلب إشارات FISH حادة وسهلة التمييز مع وجود حد أدنى من الخلفية.هذه صورة خام لمجال الرؤية. تمثل الصور التالية النوى التي تم تحديدها وتحليلها تلقائياً. تظهر مسافات مختلفة بين الأليلات وبين المواقع الجينية في أعلى اليمين وعلى جانبي كل نواة في الأسفل.في هذا التكبير، تمثل البقع البيضاء النوى المحددة لكل مجال رؤية. وتوضح هذه الرسوم البيانية أقصى مسافات بين الأليلات للإشارات الخضراء في الأعلى والإشارات الحمراء في الأسفل. جميع البيانات مأخوذة من خلايا جرثومية P 20 مع مسابر تقع على كروموسومات مختلفة وتغطي جينات HBB و HBA وتجمع الهيستون.هذه أمثلة لنوى كبد جنينية مصبوغة بمجسات خلفية تغطي جينات mic وKC وQ1. ومن خلال هذه الصور، يمكن الحصول على الإحداثيات النووية لإشارات الأسماك وحساب العلاقات المكانية للمناطق الجينومية. ويتم رسم المسافات بين الأليلات ككسر من نصف قطر النواة.كانت المسابير الحمراء متقاربة بشكل ملحوظ أكثر من المسابير الخضراء في هذه البيانات. كما كان استخدام المجهر البؤري، الذي يتطلب إشارات أكثر كثافة، أمراً ممكناً. واستُخدمت مجموعات الصور للنمذجة ثلاثية الأبعاد لإشارات الأسماك ضمن مناطق الكروموسومات الخاصة بها.يظهر هذان المسباران باللونين الأحمر والأبيض بالقرب من كلا الطرفين للكروموسوم السابع للفأر، بينما يظهر صبغ الكروموسوم بالكامل باللون الأخضر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تقنية DNA FISH بهدف استقصاء الموضعة المكانية لمواقع جينومية محددة في الخلايا المفردة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن جميع المعالجات قد تؤثر على البنية النووية، لذا من الضروري تضمين الضوابط المناسبة بعد اتباع هذا الإجراء.يمكن إجراء طرق أخرى مثل immuno fish للإجابة على أسئلة إضافية مثل العلاقات المكانية بين الجينات والبروتينات.

robust-3d-dna-fish-using-directly-labeled-probes

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا المنشور يصف كيفية استخدام الأنواع السمكية اجيلنت نظام تحديد الهوية لتحديد الأنواع من السمك عن طريق استخراج الحمض النووي وتنفيذ وتحليل PCR RFLP.

الحمض النووي القائم على تحديد الأنواع السمكية البروتوكول

تثبيت العينة كاملة في الموضع استُخدم التهجين الموضعي في الموقف الكامل (WISH) في مقرر أحياء الفقاريات المقارنة لطلاب المرحلة الجامعية المتقدمة، بالإضافة إلى عمليات تشريح الفقاريات. وقد أتاح ذلك للطلاب فرصة دراسة أنماط التعبير الجيني إلى جانب التشريح العياني، مما ربط بين دراسة البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الكائنات الحية ضمن مقرر دراسي واحد.

جبل به الجامعة في الموقع تهجين ارتباط البيولوجيا الجزيئية والعضوي

عزل وتوصيف الخلايا السرطانية المنتشرة (CTC) من دم مرضى السرطان هو نوع من الخزعة السائلة غير الغازية ويرتبط بالانتكاس وتطور المرض. يصف هذا الفيديو تقنية تهجين مضان الحمض النووي في الموقع (DNA FISH) على الخلايا السرطانية الملتقطة على سلك طبي ، لدراسة جين معين ذي أهمية.

أسماك الحمض النووي ثلاثية الأبعاد: تقنية لتحديد موقع جين معين على الكروموسوم

نحن هنا وصف كامل الفلورسنت...

كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

نحن هنا وصف بروتوكول للكشف في وقت واحد من التعديلات من قبل هيستون تسلسل الحمض النووي عن طريق المناعي وFISH DNA تليها المجهري 3D والتحليلات (3D المناعية DNA FISH).

الجمع بين المناعي وFISH DNA على الحفاظ على النواة 3D-الطور البيني لدراسة التغيرات في منظمة النووية 3D

هنا، فإننا نقدم مقاربة منهجية لتطوير ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وحساسة...

في النمذجة فيفو من المهووسين الجينوم البشري باستخدام دانيو rerio

ويتجلى PCR جنبا إلى جنب مع تحليل ذوبان عالية الدقة (HRMA) كوسيلة سريعة وفعالة إلى التركيب الوراثي الزرد.

سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب

الجنين الزرد هو نموذج ممتاز للبحوث البيولوجيا التطورية. خلال مرحلة التطور الجنيني، الزرد تطوير مع كتلة البيض، الذي يعرض التحديات ثلاثي الأبعاد للمراقبة العينة والتحليل. يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء ثنائي الأبعاد جبل الاستعدادات شقة من جبل بأكمله في الموقع (WISH) ملطخة العينات الجنين الزرد.

إعداد جبل مسطح لمراقبة وتحليل الأجنة الزرد عينات الملون بواسطة جبل الجامعة<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين

وقد استخدمت الزرد كالكائنات نموذج الوراثية الموثوقة في البحوث الطبية الحيوية، لا سيما مع ظهور تكنولوجيات تحرير الجينات. عندما تعمل اليرقات المتوقع، تحديد النمط الوراثي واستخراج الحمض النووي يمكن أن يكون تحديا. هنا، نحن تصف إجراء التنميط تتسم بكفاءة لليرقات الزرد، بقطع الذيل، أقرب وقت الإخصاب بعد 72-ح.

استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin

تمثل الـ DNA FISH ثلاثية الأبعاد أداة لتصور اللوية الجينومية المتعددة داخل النوى المحفوظة ثلاثية الأبعاد، مع تحديد تفاعلاتها المتبادلة وتوطينها بشكل لا لبس فيه داخل الفضاء النووي على مستوى خلية واحدة. هنا ، يتم وصف بروتوكول خطوة بخطوة لمجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية.

3D متعدد الألوان أداة الحمض النووي الأسماك لدراسة العمارة النووية في الخلايا الأساسية البشرية

تعلم تقنية FISH للحمض النووي ثلاثي الأبعاد باستخدام مجسات مُصنّفة مباشرة لتحليل البنية النووية في الخلايا الفردية. توفر هذه الطريقة رؤى قيمة حول التنظيم المكاني للجينوم وتفاعلات الجينات.

قوية FISH DNA 3D استخدام مجسات إعتبر مباشرة

استكشف المزيد من الفيديوهات