قوية FISH DNA 3D استخدام مجسات إعتبر مباشرة
أغسطس 15, 2013
نحن تصف بروتوكول قوية وتنوعا لتحليل العمارة النووي DNA من قبل الأسماك 3D باستخدام تحقيقات الفلورسنت صفت مباشرة.
الهدف العام من التجربة التالية هو التحقيق في التنظيم المكاني لمواقع جينومية معينة في الخلايا المفردة بطريقة قوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء مجسات مصنفة بالفلورسنت أولا لربط وتسليط الضوء على المنطقة الجينومية ذات الأهمية في النهاية. تتمثل الخطوات التالية في الالتزام بالخلايا ذات الأهمية وإصلاحها واختراعها على شريحة للسماح بالوصول إلى المسبار.
ثم يتبع التمسخ الحراري المتزامن للمسبار والحمض النووي الخلوي خطوات غسيل تهجين المسبار بين عشية وضحاها لإزالة المسبار غير المرتبط على وجه التحديد والوقوف المضاد مع نقطة في البوصة. لتصور نتائج نواة الخلية التي تم الحصول عليها باستخدام الفحص المجهري الفلوري ستكشف في النهاية عن الموضع النووي الذي تشغله مناطق جينومية معينة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التنظيم النووي ، مثل تحديد التفاعلات الوظيفية بين الجينات.
الميزة الرئيسية لبروتوكول DNA FISH هذا هي أنه سريع وقوي ومتعدد الاستخدامات. على الرغم من أننا نوضح هذه الطريقة باستخدام خلايا E Es ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على العديد من أنواع الخلايا الأخرى ، المجسات المصنفة مباشرة المصنوعة من ظهور 100 إلى 250. تنتج Kilobases باستمرار إشارات ساطعة إذا كانت هناك حاجة إلى مجسات أصغر.
استخدم 40 إلى 50 كيلو قاعدة ، أو حتى البلازميدات التي تحتوي على خمسة إلى 10 إدخالات كيلو قاعدة. حدد المستنسخة الخلفية أو smid المقابلة لجينات معينة باستخدام متصفحات الجينوم الجماعية أو UCSC. لتحضير الحمض النووي الخلفي عالي الجودة ، استخدم إما هطول الأمطار المتكرر أو مجموعة متوفرة تجاريا ، فإن نظافة المستحضر تتناسب مع حجم المسبار المطلوب.
قم بإجراء الملصقات في خطوتين. أولا ، استخدم ترجمة NIC لتقديم الأليل الأميني ، DUTP. ثانيا ، استخدم أداة التوصيل الكيميائية لإرفاق صبغة تفاعلية متوسطة AM.
يجدر استثمار الوقت في عمل مجسات ساطعة لأنها ضرورية لإشارات الأسماك القوية. يمكن إجراء هذا الإجراء بالتوازي مع علاج الخلايا ولا يجب القيام به في بداية اليوم. أولا ، قم بخلط 10 إلى 20 نانوغراما من المسبار المسمى مباشرة مع ستة ميكرولترات من ثاني أكسيد الكربون 1D NA لستة ميكروغرامات.
ثم أضف ميكرولتر واحد من الحمض النووي أحادي السبل من خصيتين السلمون مقابل 9.7 ميكروغرام. اضبط حجم المزيج إلى 100 ميكرولتر بالماء. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية و 275 ميكرولتر من الإيثانول واخلطها عن طريق الدوامة.
اترك الخليط يترسب لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، قم بتدوير هطول الأمطار في fuge صغير بأقصى سرعة لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الحبيبات ب 70٪ من الإيثانول وقم بتدويرها مرة أخرى لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
بعد ذلك تجفيف الحبيبات بالهواء. ثم resus. علقه في خمسة ميكرولترات من الشكل منزوع الأيونات.
أميد عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 1000 دورة في الدقيقة ، يمكنك رقائق معدنية لحمايته من الضوء. بعد 30 دقيقة ، أضف خمسة ميكرولترات من مزيج كبريتات الدكسترين واستمر في الحضانة مع التحريض. لمدة 10 دقائق أخرى ، يختلف ميل الخلايا للالتصاق بالشريحة اختلافا كبيرا باختلاف نوع الخلية.
لكل نوع من أنواع الخلايا ، حدد وقت الاستقرار الأمثل وكثافة الخلية تجريبيا. للحصول على نتائج متسقة ، يجب أن تكون الخلايا في معلق خلية واحدة للالتصاق بخلايا ES للفأر على شريحة. ابدأ بالدوران حول المنطقة الموجودة على الشريحة حيث سيتم رصد الخلايا.
باستخدام قلم مسعور ، أعدت تعليقا من 20 إلى 50 ، 000 خلية لكل 80 إلى 100 ميكرولتر في وسط الثقافة العادي ، وأضف تعليق الخلية في الدائرة واسمح للخلايا بالالتصاق لمدة ثلاث ساعات تقريبا في حاضنة مرطبة. بعد مرفق الشريحة، قم بإصلاح الخلايا عن طريق غمر الشريحة برفق في 4٪ PFA لمدة 10 دقائق. يجب أن تكون الشريحة مسطحة في صينية مثل صندوق الإكرامية.
استخدام كواشف درجة حرارة الغرفة في برطمانات coplan. قم أولا بإخماد الخلايا باستخدام كلوريد تريس لمدة 10 دقائق. ثانيا ، قم بتفريخ الخلايا باستخدام مزيج من السابين والتريتون X 100 لمدة 10 دقائق.
الآن اغسل الخلايا مرتين في PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة. بعد الغسيل ، احتضان الخلايا في 20٪ من الجلسرين لمدة 20 دقيقة على الأقل. في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الشرائح في 50٪ من الجلسرين عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لعدة أسابيع.
يجب أن يزيد التخزين لمدة يوم أو أكثر من قوة الإشارة. تأكد من موازنة الخلايا مع درجة حرارة الغرفة في 20٪ من الجلسرين في PBS قبل المتابعة. الآن ، قم بتجميد وإذابة الشريحة ثلاث مرات باستخدام النيتروجين السائل.
شريحة واحدة في كل مرة يتوقف فيها صوت الطقطقة. بعد بضع ثوان ، قم بإزالة الشريحة إلى منشفة ورقية لإذابة الجليد ، وانتظر حتى يختفي الجلسرين المجمد غير الشفاف قبل تجميد الشريحة مرة أخرى ، ويمكن عمل ما يصل إلى 15 شريحة بشكل مريح بالتناوب لمدة ثلاث دورات تجميد. الآن اغسل الشرائح مرتين في PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة.
ثم احتضان الشرائح في حمض الهيدروكلوريك 0.1 مولار لمدة 30 دقيقة. اتبع علاج حمض الهيدروكلوريك بغسل خمس دقائق أخرى في PBS. الآن قم بتزخر الخلايا مرة أخرى باستخدام مزيج أقوى من السابين و Triton X 100 لمدة 30 دقيقة لغسل المواد الخافضة للتوتر السطحي من الشرائح ، واستخدم غسلتين لمدة خمس دقائق PBS.
الشرائح جاهزة الآن للتوازن في 50٪ من أميد في XSSC. كان من المفترض أن يستمر هذا لمدة 10 دقائق على الأقل أثناء التوازن ، واسترجع المسبار الذي تم ماصته لأعلى ولأسفل عدة مرات ثم نقل 10 ميكرولتر لكل بقعة خلية إلى زلة غطاء بالحجم المناسب. قم بإزالة شريحة من نموذج أميد وجفف أي سائل زائد حول الخلايا بمنشفة ورقية ، لكن لا تدع بقعة الخلية تجف.
الآن اقلب الغطاء. انزلق على الشريحة فوق الخلايا. أغلق زلة الغطاء على الشريحة بالأسمنت المطاطي.
اترك الأسمنت يجف تماما وحافظ على الشريحة محمية من الضوء. بعد ذلك ، قم بتسخين الشرائح إلى 78 درجة مئوية لمدة دقيقتين بالضبط على طبق ساخن. هذا أمر بالغ الأهمية لأداء بشكل صحيح.
يجب أن يحمي الغطاء الخلايا من الضوء خلال هذه الخطوة للحفاظ على التشكل النووي قدر الإمكان. من الأهمية بمكان عدم ترك الخلايا تجف والتأكد من أن موضع الحرارة لديه درجة الحرارة المناسبة. بعد ذلك ، ضع الشرائح في صندوق ضيق خفيف مع مناشف ورقية مبللة لتوفير الرطوبة واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
ابدأ هذا الإجراء عن طريق تقشير الأسمنت المطاطي من حول زلات الغطاء. ثم ضع كل شريحة في X SC الزائد حتى ينزلق الغطاء وينزلق. بعد ذلك ، اغسل الشرائح بنسبة 50٪ من أميد في اثنين من SC الزائد لمدة 15 دقيقة عند 45 درجة مئوية.
احتفظ بغطاء على الحمام المائي لحمايتها من الضوء. ثم اغسل الشرائح في 0.2 XSSC لمدة 15 دقيقة عند 63 درجة مئوية. ثم اثنان من XSSC لمدة خمس دقائق عند 45 درجة مئوية ، وأخيرا إلى SE الزائد في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
الخطوات المتبقية كلها في درجة حرارة الغرفة ، بدءا من الغسيل لمدة خمس دقائق ، وتقوم PBS الآن بتلطيخ الشرائح باللون الداكن لمدة دقيقتين ثم احتجاز الشرائح باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. لتركيب زلة الغطاء ، ضع 10 ميكرولتر من وسط التركيب لكل بقعة خلية على زلة الغطاء بالحجم الصحيح. ثم جفف PBS الزائد من حول بقعة الخلية دون ترك الخلايا تجف.
اقلب الغطاء ، وانزلق على شريحة وأغلقه بورنيش الأظافر باستخدام بروتوكول تحضير مسبار الأسماك. بعد ترجمة NIC ، يجب أن تكون مسحة الحمض النووي مرئية مع الجزء الأكبر من الشظايا التي تتراوح بين 150 و 700 زوج قاعدي. بعد الاقتران الكيميائي ، يمكن قياس دمج صبغة الفلورسنت عن طريق التحليل الطيفي لمرور المسبار.
تعد خطوات مراقبة الجودة هذه للحكم على جودة المسبار أمرا بالغ الأهمية باستخدام مثل هذا المسبار. كان التصوير الآلي باستخدام مجهر مضان epi ممكنا. يتطلب ذلك إشارات سمكة حادة يمكن التعرف عليها بسهولة مع خلفية قليلة.
هذه صورة مجال رؤية أولي. تمثل الصور التالية النوى التي تم تحديدها وتحليلها تلقائيا. تظهر مسافات مختلفة بين الأليلات وبين الموضع أعلى اليمين وإلى كلا الجانبين أسفل كل نواة.
في هذا التضخم ، تمثل البقع البيضاء النوى المحددة لكل مجال رؤية. تظهر هذه الرسوم البيانية المسافات القصوى بين الأليلات بين الإشارات الخضراء أعلاه والإشارات الحمراء أدناه. جميع البيانات مأخوذة من الخلايا الجرثومية P 20 مع مجسات تقع على كروموسومات مختلفة تغطي جينات HBB و HBA ومجموعة هيستون.
هذه أمثلة على نوى كبد الجنين الملطخة بمجسات خلفية تغطي جينات الميكروفون و KC و Q1. من هذه الصور ، يمكن الحصول على الإحداثيات النووية لإشارات الأسماك ويمكن حساب العلاقات المكانية للمناطق الجينومية يتم رسم المسافات بين الأليليات كجزء من نصف قطر النواة.
كانت المجسات الحمراء أقرب إلى بعضها البعض بشكل ملحوظ من المجسات الخضراء في هذه البيانات. كان الفحص المجهري متحد البؤر ، الذي يتطلب إشارات أكثر كثافة ممكنا أيضا. تم استخدام مكدسات الصور للنمذجة ثلاثية الأبعاد لإشارات الأسماك داخل مناطق الكروموسومات الخاصة بها.
هذان المجسان باللونين الأحمر والأبيض قريبان من طرفي كروموسوم الفأر سبعة طلاء كروموسوم كامل باللون الأخضر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية أداء أسماك الحمض النووي من أجل التحقيق في الوضع المكاني لمواقع جينومية معينة في الخلايا المفردة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن جميع العلاجات قد تؤثر على العمارة النووية ومن المهم تضمين اتباع هذا الإجراء المناسب.
يمكن إجراء طرق أخرى مثل الأسماك المناعية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل العلاقات المكانية بين الجينات والبروتينات.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا قويًا لتحليل التركيب النووي باستخدام FISH DNA ثلاثي الأبعاد مع مسبار فلوري مسمى مباشرة. تسمح الطريقة بالتحقيق في التنظيم المكاني للمناطق الجينومية في الخلايا المفردة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم الجينوم
الخلفية
- فهم التنظيم النووي ضروري لتوضيح تفاعلات الجينات.
- FISH DNA ثلاثي الأبعاد هي تقنية قوية لتصور المناطق الجينومية.
- البروتوكول متعدد الاستخدامات ويمكن تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا.
- المسابير المسمى مباشرة تعزز قوة الإشارة لتحسين التصور.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة سريعة وموثوقة لتحليل التركيب النووي.
- تسهيل دراسة التفاعلات الوظيفية بين الجينات.
- توفير بروتوكول يمكن تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا.
الطرق المستخدمة
- توليد مسبار مسمى بالفلورسنت لمناطق جينومية محددة.
- تثبيت الخلية وتخللها للسماح بوصول المسبار.
- تفكيك حراري وتهجين المسبار بين عشية وضحاها.
- التصور باستخدام مجهر الفلورسنت لتقييم الموضع النووي.
النتائج الرئيسية
- ينجح البروتوكول في إبراز مناطق جينومية معينة في الخلايا المفردة.
- يُظهر المتانة وتعدد استخدامات الطريقة عبر أنواع الخلايا.
- تعزز الإشارات الساطعة من المسبار المسمى مباشرة قدرات الكشف.
- يوفر رؤى أساسية حول التنظيم النووي وتفاعلات الجينات.
الخلاصات
- يعد بروتوكول FISH DNA هذا أداة قيمة للباحثين الذين يدرسون التركيب النووي.
- يوفر نهجًا موثوقًا للتحقيق في التنظيم المكاني للجينومية.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى مجالات بحث بيولوجية مختلفة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Robust 3D DNA FISH enables precise spatial mapping of genomic loci in single cells, supporting target validation through direct visualization of chromosomal architecture. This method enhances predictive confidence in early discovery by revealing functional gene interactions and nuclear organization patterns relevant to disease mechanisms. Its versatility across cell types and compatibility with high-throughput imaging positions it as a scalable tool for de-risking therapeutic hypotheses in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing spatial relationships between genes of interest.
- Operational Value: Provides reproducible nuclear positioning data to clarify pathway involvement and functional target engagement.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying loci with disease-relevant spatial configurations that correlate with gene regulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively measurable inter-allelic and inter-locus distances for objective assessment of genomic organization.
- Operational Value: Delivers robust, bright signals from directly labeled probes, enabling reliable automated imaging and reduced background noise.
- Scalability Value: Compatible with high-throughput workflows, allowing screening of multiple genomic regions across diverse cell models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from discovery to preclinical validation by preserving native nuclear architecture in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Reveals spatial alterations in genomic loci that may indicate pathogenic mechanisms, informing target selection.
- Predictive Confidence: Enables assessment of whether candidate therapeutics normalize aberrant nuclear organization, supporting go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification, providing spatial genomic data prior to lead optimization and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing whether gene loci co-localize in the nucleus, indicating potential regulatory interactions.
- Screening: Enables assay-ready, standardized nuclear imaging with quantitative distance metrics for comparing compound or genetic perturbations.
- Analytics: Generates measurable outputs such as inter-allelic distances as a fraction of nuclear radius, enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by maintaining nuclear integrity in primary and stem cell models, supporting biomarker-aligned spatial assessments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for nuclear architecture studies across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, visual evidence of genomic spatial relationships in single cells.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized probe labeling, denaturation, and hybridization steps, minimizing variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking nuclear organization phenotypes to target validity, reducing late-stage biological attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on spatial genome organization data from relevant disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular probe design, nick-translation, and fluorescence microscopy for accurate signal detection.
- Dependent on access to hybridization ovens, fluorescence microscopes, and automated imaging systems for high-throughput application.
- Necessitates cross-team standardization of probe quality control and nuclear segmentation algorithms for consistent data interpretation.
- Adaptation across model systems may require optimization of permeabilization and denaturation conditions based on cell type and nuclear density.
- Practical limitations include probe size constraints for bright signal generation and the need for careful handling to preserve nuclear morphology during freeze-thaw cycles.
