التحول البكتيري: طريقة الصدمة الحرارية
التحول البكتيري هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع حيث يتم إدخال الحمض النووي الغريب في بكتيريا ، والتي يمكنها بعد ذلك تضخيم أو استنساخ الحمض النووي. تسمى الخلايا التي لديها القدرة على امتصاص هذا الحمض النووي بسهولة بالخلايا المختصة. على الرغم من أن التحول يحدث بشكل طبيعي في العديد من أنواع البكتيريا ، فقد وجد العلماء طرقا للحث الاصطناعي على كفاءة الخلية البكتيرية وتعزيزها. في هذا الفيديو سنتحدث عن إحدى هذه الطرق ، تحول الصدمة الحرارية.
قبل أن نتحدث عن تقنية الصدمة الحرارية ، دعنا أولا نناقش نوع الحمض النووي الأكثر استخداما في التحول البكتيري: البلازميد. البلازميد عبارة عن حمض نووي صغير دائري مزدوج الشريطة يمكنه تقليل حجمه عن طريق الالتفاف الفائق ، بحيث يمكنه المرور بسهولة عبر المسام في غشاء الخلية.
يحتوي البلازميد على عدد قليل من المناطق المهمة الجديرة بالذكر. تحتوي البلازميدات المتاحة تجاريا على موقع استنساخ متعدد أو MCS. تحتوي هذه المنطقة على تسلسلات محددة معترف بها بواسطة نوكليازات التقييد أو إنزيمات التقييد ، والتي تشق الحمض النووي. يمكن إدخال شظايا الحمض النووي التي تهم الباحث في موقع الاستنساخ المتعدد عندما يتم قطع البلازميد وجزء الحمض النووي بنفس نوكليازات داخلية.
تحتويالبلازميدات أيضا على أصل النسخ المتماثل ، أو ORI ، الذي يوفر معلومات للخلية حول المكان الذي يجب أن يبدأ فيه تكرار البلازميد.
بالإضافة إلى أصل النسخ المتماثل وموقع الاستنساخ المتعدد ، ستتضمن معظم البلازميدات جينا لمقاومة المضادات الحيوية. يمنح هذا الجين مقاومة للمضادات الحيوية لجميع الخلايا التي تحتوي على البلازميد ، مما يسمح لتلك الخلايا بالبقاء على قيد الحياة في الوسائط المحتوية على المضادات الحيوية.
والآن بعد أن ناقشنا البلازميدات، دعونا نتحدث عن الخلايا التي سيتم إدخالها فيها: الخلايا المختصة. أكثر أنواع البكتيريا استخداما في أبحاث البيولوجيا الجزيئية والتحول هو الإشريكية القولونية ، والتي تصادف أنها تعيش أيضا في الأمعاء السفلية. عادة ما تكون الخلايا مختصة عن طريق التعرض لبيئة غنية بالكالسيوم.
تعمل الشحنات الموجبة لأيونات الكالسيوم على تحييد الشحنات السالبة لكل من البلازميد وجدار الخلية البكتيرية ، مما يؤدي إلى تبديد التنافر الكهروستاتيكي وإضعاف جدار الخلية.
من خلال تعريض الخلايا لارتفاع مفاجئ في درجة الحرارة ، أو صدمة حرارية ، يتم إنشاء فرق ضغط بين خارج الخلية وداخلها ، مما يؤدي إلى تكوين المسام ، والتي من خلالها يمكن أن يدخل الحمض النووي البلازميد فائق الالتفاف. بعد إعادة الخلايا إلى درجة حرارة طبيعية أكثر ، سوف يلتئم جدار الخلية ذاتيا.
بمجرد أن تمتص الخلايا البلازميد ، ستكون قادرة على النمو على ألواح أجار مليئة بالمضادات الحيوية.
قبل البدء في تحويل الصدمة الحرارية ، قم بتنظيف منطقة العمل وتأكد من تعقيم جميع المعدات.
تأكد من أن لديك ما يكفي من الوسائط والأجار المعدة ، والتي توفر التغذية للبكتيريا التي ستجعلها مؤهلة. تأكد أيضا من تعقيم جميع المحاليل عن طريق التعقيم. اترك الوسائط السائلة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام واترك الأجار يبرد إلى 50-55 درجة مئوية ، وهي درجة الحرارة التي يمكن عندها إضافة المضاد الحيوي وسكب الأطباق. اترك الأطباق تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة لتتجمد.
عند العمل مع البكتيريا ، يجب على المرء دائما استخدام تقنية معقمة للحفاظ على العقم. تتضمن تقنية التعقيم عادة استخدام موقد بنسن لتعقيم الأدوات والكواشف وإنشاء تيار حراري - مما يحافظ على الملوثات المحمولة جوا خارج مساحة العمل.
مباشرة قبل تفاعل الصدمة الحرارية ، قم بتسخين الوسائط مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة وألواح LB أجار المحتوية على المضادات الحيوية إلى 37 درجة مئوية. تأكد أيضا من أن حمامك المائي عند 42 درجة مئوية.
بعد ذلك ، قم بإذابة الخلايا المختصة كيميائيا على الجليد.
أضف 1-5 ميكرولتر من 1 نانوغرام / ميكرولتر من البلازميد البارد إلى الخلايا البكتيرية ، واخلطها برفق ، وأعد خليط الخلية والبلازميد إلى الثلج لمدة 30 دقيقة.
عندما يحين الوقت ، صدم الخلية وخليط البلازميد بالحرارة عن طريق وضعه في حمام مائي عند 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
مباشرة بعد إخراج الأنبوب من الحمام المائي ، ضعه على الثلج وأضف 450 ميكرولتر من الوسائط. ضعه في حاضنة اهتزاز لمدة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة عند أكثر من 225 دورة في الدقيقة حتى تتمكن الخلايا من التعافي.
باستخدام تقنية التعقيم المناسبة ، أضف 20-200uL من البكتيريا إلى صفيحة أجار LB وانشر الوسط حولها باستخدام موزع بكتيري. احتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية رأسا على عقب لمنع تعرض البكتيريا للتكثيف.
في اليوم التالي ، تشكل البكتيريا التي أخذت البلازميد مستعمرات.
بعد ذلك ، احسب المستعمرات لحساب كفاءة التحويل ، وهي عدد المحولات الناجحة مقسوما على الكمية الإجمالية للحمض النووي المطلي.
الآن ، يمكن اختيار المستعمرات لمزيد من التجارب.
قبل أن تصبح مختصة ، يتم تخزين البكتيريا المستخدمة في التحول في الثلاجة. يجب إذابتها على الجليد ، ونشرها على طبق أجار - بدون مضادات حيوية ، والسماح لها بالنمو طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
باستخدام تقنية التعقيم ، اختر مستعمرة بكتيرية من صفيحة الأجار وقم بزراعتها في مزرعة كبيرة سعة 500 مل طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز - أداة تمنع ترسيب البكتيريا وحتى تشتت العناصر الغذائية في الوسائط.
أثناء نمو الخلايا ، تصنع 0.1 كلوريد كالسيوم مولار و 0.1 كلوريد كالسيوم مولار بالإضافة إلى 15٪ محاليل الجلسرين والأوتوكلاف واتركها تبرد.
تستخدم قياسات الامتصاص لتحديد ما إذا كانت البكتيريا في منتصف مرحلة نموها أم لا ، مما يعني أنها ستأخذ الحمض النووي بسهولة. بمجرد وصول الخلايا إلى هذه المرحلة ، ضعها على الجليد واحتفظ بها هناك طوال العملية.
بعد ذلك ، افصل الخلايا البكتيرية إلى أنبوبين كبيرين للطرد المركزي وتدور عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية وأعد تعليقها في حوالي 100 مل 0.1 مولار من كلوريد الكالسيوم البارد. ثم احتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة. تتكرر هذه الخطوة مرة أخرى على الأقل. غالبا ما يشار إلى دورات الخلايا الدوارة وإعادة التعليق بغسل خلاياك.
بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخلايا في محلول كلوريد الكالسيوم المولي البارد سعة 50 مل 0.1 مولي بالإضافة إلى محلول الجلسرين 15٪. هذه الخلايا الآن مؤهلة كيميائيا.
قم بتوزيع 50 ميكرولتر من البكتيريا في أنابيب متعددة من الطرد الدقيق وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للصدمة الحرارية.
توجد العديد من التطبيقات والاختلافات في التحول البكتيري.
بالإضافة إلى الصدمة الحرارية ، يعد التضخم الكهربائي تقنية شائعة أخرى للتحول. كما يوحي اسمها ، يتضمن التثقيب الكهربائي استخدام الكهرباء لعمل مسام في غشاء الخلية البكتيرية يمكن أن يمر من خلالها الحمض النووي.
فيما يتعلق بفحص البكتيريا المحولة ، غالبا ما تحتوي البلازميدات على جين يشفر إنزيم بيتا جالاكتوزيداز للمساعدة في الفحص. عندما يتم تضمين ركيزة هذا الإنزيم في ألواح أجار ، فإن البكتيريا التي تم تحويلها باستخدام البلازميدات التي تحتوي على إدراج تنتج مستعمرات بيضاء ، في حين أن تلك التي لا تنتج مستعمرات زرقاء. يشار إلى هذه الطريقة باسم الفحص الأزرق والأبيض.
في معظم تجارب التحول ، يكون الهدف هو الحصول على بكتيريا سريعة الانقسام لإنتاج كميات كبيرة من البلازميد ، والذي يتضمن الجين المستهدف. بعد التحول البكتيري ، تتمثل الخطوة التالية في زراعة كميات كبيرة من البكتيريا في وسط سائل يحتوي على المضادات الحيوية وإجراء تنقية البلازميد ، والتي ، كما يوحي اسمها ، تنطوي على تنقية البلازميدات من البكتيريا. تتوفر العديد من المجموعات التجارية لهذا الغرض.
في بعض الأحيان يكون الهدف من التحول هو جعل البكتيريا تولد كميات كبيرة من البروتين المشفرة بواسطة البلازميد. هنا ترى الخلايا البكتيرية يتم تجانسها وتحللها قبل إجراء تقنية تسمى تنقية التقارب لعزل البروتين المستهدف. بعد تنقية كميات كبيرة من البروتين ، يمكن بعد ذلك تبلورها وتحديد بنية البروتين المعين ذي الأهمية.
لقد شاهدت للتو JoVE مقدمة لتحولات الصدمات الحرارية. في هذا الفيديو قمنا بمراجعة: ما هو تحول الصدمة الحرارية وكيف يعمل ، والمبدأ المدبر وراءه وكيفية تحويل البكتيريا بنجاح. شكرا للمشاهدة!
التحول هو العملية التي تحدث عندما تبتلع الخلية الحمض النووي الغريب من محيطها. يمكن أن يحدث التحول في الطبيعة في أنواع معينة من البكتيريا. في البيولوجي…
التحول البكتيري هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع حيث يتم إدخال الحمض النووي الغريب في بكتيريا ، والتي يمكنها بعد ذلك تضخيم أو استنساخ الحمض النووي. تسمى الخلايا التي لديها القدرة على امتصاص هذا الحمض النووي بسهولة بالخلايا المختصة. على الرغم من أن التحول يحدث بشكل طبيعي في العديد من أنواع البكتيريا ، فقد وجد العلماء طرقا للحث الاصطناعي على كفاءة الخلية البكتيرية وتعزيزها. في هذا الفيديو سنتحدث عن إحدى هذه الطرق ، تحول الصدمة الحرارية.
قبل أن نتحدث عن تقنية الصدمة الحرارية ، دعنا أولا نناقش نوع الحمض النووي الأكثر استخداما في التحول البكتيري: البلازميد. البلازميد عبارة عن حمض نووي صغير دائري مزدوج الشريطة يمكنه تقليل حجمه عن طريق الالتفاف الفائق ، بحيث يمكنه المرور بسهولة عبر المسام في غشاء الخلية.
يحتوي البلازميد على عدد قليل من المناطق المهمة الجديرة بالذكر. تحتوي البلازميدات المتاحة تجاريا على موقع استنساخ متعدد أو MCS. تحتوي هذه المنطقة على تسلسلات محددة معترف بها بواسطة نوكليازات التقييد أو إنزيمات التقييد ، والتي تشق الحمض النووي. يمكن إدخال شظايا الحمض النووي التي تهم الباحث في موقع الاستنساخ المتعدد عندما يتم قطع البلازميد وجزء الحمض النووي بنفس نوكليازات داخلية.
تحتويالبلازميدات أيضا على أصل النسخ المتماثل ، أو ORI ، الذي يوفر معلومات للخلية حول المكان الذي يجب أن يبدأ فيه تكرار البلازميد.
بالإضافة إلى أصل النسخ المتماثل وموقع الاستنساخ المتعدد ، ستتضمن معظم البلازميدات جينا لمقاومة المضادات الحيوية. يمنح هذا الجين مقاومة للمضادات الحيوية لجميع الخلايا التي تحتوي على البلازميد ، مما يسمح لتلك الخلايا بالبقاء على قيد الحياة في الوسائط المحتوية على المضادات الحيوية.
والآن بعد أن ناقشنا البلازميدات، دعونا نتحدث عن الخلايا التي سيتم إدخالها فيها: الخلايا المختصة. أكثر أنواع البكتيريا استخداما في أبحاث البيولوجيا الجزيئية والتحول هو الإشريكية القولونية ، والتي تصادف أنها تعيش أيضا في الأمعاء السفلية. عادة ما تكون الخلايا مختصة عن طريق التعرض لبيئة غنية بالكالسيوم.
تعمل الشحنات الموجبة لأيونات الكالسيوم على تحييد الشحنات السالبة لكل من البلازميد وجدار الخلية البكتيرية ، مما يؤدي إلى تبديد التنافر الكهروستاتيكي وإضعاف جدار الخلية.
من خلال تعريض الخلايا لارتفاع مفاجئ في درجة الحرارة ، أو صدمة حرارية ، يتم إنشاء فرق ضغط بين خارج الخلية وداخلها ، مما يؤدي إلى تكوين المسام ، والتي من خلالها يمكن أن يدخل الحمض النووي البلازميد فائق الالتفاف. بعد إعادة الخلايا إلى درجة حرارة طبيعية أكثر ، سوف يلتئم جدار الخلية ذاتيا.
بمجرد أن تمتص الخلايا البلازميد ، ستكون قادرة على النمو على ألواح أجار مليئة بالمضادات الحيوية.
قبل البدء في تحويل الصدمة الحرارية ، قم بتنظيف منطقة العمل وتأكد من تعقيم جميع المعدات.
تأكد من أن لديك ما يكفي من الوسائط والأجار المعدة ، والتي توفر التغذية للبكتيريا التي ستجعلها مؤهلة. تأكد أيضا من تعقيم جميع المحاليل عن طريق التعقيم. اترك الوسائط السائلة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام واترك الأجار يبرد إلى 50-55 درجة مئوية ، وهي درجة الحرارة التي يمكن عندها إضافة المضاد الحيوي وسكب الأطباق. اترك الأطباق تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة لتتجمد.
عند العمل مع البكتيريا ، يجب على المرء دائما استخدام تقنية معقمة للحفاظ على العقم. تتضمن تقنية التعقيم عادة استخدام موقد بنسن لتعقيم الأدوات والكواشف وإنشاء تيار حراري - مما يحافظ على الملوثات المحمولة جوا خارج مساحة العمل.
مباشرة قبل تفاعل الصدمة الحرارية ، قم بتسخين الوسائط مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة وألواح LB أجار المحتوية على المضادات الحيوية إلى 37 درجة مئوية. تأكد أيضا من أن حمامك المائي عند 42 درجة مئوية.
بعد ذلك ، قم بإذابة الخلايا المختصة كيميائيا على الجليد.
أضف 1-5 ميكرولتر من 1 نانوغرام / ميكرولتر من البلازميد البارد إلى الخلايا البكتيرية ، واخلطها برفق ، وأعد خليط الخلية والبلازميد إلى الثلج لمدة 30 دقيقة.
عندما يحين الوقت ، صدم الخلية وخليط البلازميد بالحرارة عن طريق وضعه في حمام مائي عند 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
مباشرة بعد إخراج الأنبوب من الحمام المائي ، ضعه على الثلج وأضف 450 ميكرولتر من الوسائط. ضعه في حاضنة اهتزاز لمدة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة عند أكثر من 225 دورة في الدقيقة حتى تتمكن الخلايا من التعافي.
باستخدام تقنية التعقيم المناسبة ، أضف 20-200uL من البكتيريا إلى صفيحة أجار LB وانشر الوسط حولها باستخدام موزع بكتيري. احتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية رأسا على عقب لمنع تعرض البكتيريا للتكثيف.
في اليوم التالي ، تشكل البكتيريا التي أخذت البلازميد مستعمرات.
بعد ذلك ، احسب المستعمرات لحساب كفاءة التحويل ، وهي عدد المحولات الناجحة مقسوما على الكمية الإجمالية للحمض النووي المطلي.
الآن ، يمكن اختيار المستعمرات لمزيد من التجارب.
قبل أن تصبح مختصة ، يتم تخزين البكتيريا المستخدمة في التحول في الثلاجة. يجب إذابتها على الجليد ، ونشرها على طبق أجار - بدون مضادات حيوية ، والسماح لها بالنمو طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
باستخدام تقنية التعقيم ، اختر مستعمرة بكتيرية من صفيحة الأجار وقم بزراعتها في مزرعة كبيرة سعة 500 مل طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز - أداة تمنع ترسيب البكتيريا وحتى تشتت العناصر الغذائية في الوسائط.
أثناء نمو الخلايا ، تصنع 0.1 كلوريد كالسيوم مولار و 0.1 كلوريد كالسيوم مولار بالإضافة إلى 15٪ محاليل الجلسرين والأوتوكلاف واتركها تبرد.
تستخدم قياسات الامتصاص لتحديد ما إذا كانت البكتيريا في منتصف مرحلة نموها أم لا ، مما يعني أنها ستأخذ الحمض النووي بسهولة. بمجرد وصول الخلايا إلى هذه المرحلة ، ضعها على الجليد واحتفظ بها هناك طوال العملية.
بعد ذلك ، افصل الخلايا البكتيرية إلى أنبوبين كبيرين للطرد المركزي وتدور عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية وأعد تعليقها في حوالي 100 مل 0.1 مولار من كلوريد الكالسيوم البارد. ثم احتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة. تتكرر هذه الخطوة مرة أخرى على الأقل. غالبا ما يشار إلى دورات الخلايا الدوارة وإعادة التعليق بغسل خلاياك.
بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخلايا في محلول كلوريد الكالسيوم المولي البارد سعة 50 مل 0.1 مولي بالإضافة إلى محلول الجلسرين 15٪. هذه الخلايا الآن مؤهلة كيميائيا.
قم بتوزيع 50 ميكرولتر من البكتيريا في أنابيب متعددة من الطرد الدقيق وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للصدمة الحرارية.
توجد العديد من التطبيقات والاختلافات في التحول البكتيري.
بالإضافة إلى الصدمة الحرارية ، يعد التضخم الكهربائي تقنية شائعة أخرى للتحول. كما يوحي اسمها ، يتضمن التثقيب الكهربائي استخدام الكهرباء لعمل مسام في غشاء الخلية البكتيرية يمكن أن يمر من خلالها الحمض النووي.
فيما يتعلق بفحص البكتيريا المحولة ، غالبا ما تحتوي البلازميدات على جين يشفر إنزيم بيتا جالاكتوزيداز للمساعدة في الفحص. عندما يتم تضمين ركيزة هذا الإنزيم في ألواح أجار ، فإن البكتيريا التي تم تحويلها باستخدام البلازميدات التي تحتوي على إدراج تنتج مستعمرات بيضاء ، في حين أن تلك التي لا تنتج مستعمرات زرقاء. يشار إلى هذه الطريقة باسم الفحص الأزرق والأبيض.
في معظم تجارب التحول ، يكون الهدف هو الحصول على بكتيريا سريعة الانقسام لإنتاج كميات كبيرة من البلازميد ، والذي يتضمن الجين المستهدف. بعد التحول البكتيري ، تتمثل الخطوة التالية في زراعة كميات كبيرة من البكتيريا في وسط سائل يحتوي على المضادات الحيوية وإجراء تنقية البلازميد ، والتي ، كما يوحي اسمها ، تنطوي على تنقية البلازميدات من البكتيريا. تتوفر العديد من المجموعات التجارية لهذا الغرض.
في بعض الأحيان يكون الهدف من التحول هو جعل البكتيريا تولد كميات كبيرة من البروتين المشفرة بواسطة البلازميد. هنا ترى الخلايا البكتيرية يتم تجانسها وتحللها قبل إجراء تقنية تسمى تنقية التقارب لعزل البروتين المستهدف. بعد تنقية كميات كبيرة من البروتين ، يمكن بعد ذلك تبلورها وتحديد بنية البروتين المعين ذي الأهمية.
لقد شاهدت للتو JoVE مقدمة لتحولات الصدمات الحرارية. في هذا الفيديو قمنا بمراجعة: ما هو تحول الصدمة الحرارية وكيف يعمل ، والمبدأ المدبر وراءه وكيفية تحويل البكتيريا بنجاح. شكرا للمشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
التحول البكتيري هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع حيث يتم إدخال الحمض النووي الغريب في بكتيريا ، والتي يمكنها بعد ذلك تضخيم أو استنساخ الحمض النووي. تسمى الخلايا التي لديها القدرة على امتصاص هذا الحمض النووي بسهولة بالخلايا المختصة. على الرغم من أن التحول يحدث بشكل طبيعي في العديد من أنواع البكتيريا ، فقد وجد العلماء طرقا لتحفيز وتعزيز كفاءة الخلية البكتيرية بشكل مصطنع. في هذا الفيديو سنتحدث عن إحدى هذه الطرق ، تحول الصدمة الحرارية.
قبل أن نتحدث عن تقنية الصدمة الحرارية ، دعنا أولا نناقش نوع الحمض النووي الأكثر استخداما في التحول البكتيري: البلازميد. البلازميد عبارة عن حمض نووي صغير دائري مزدوج الشريطة يمكنه تقليل حجمه عن طريق الالتفاف الفائق ، بحيث يمكنه المرور بسهولة عبر المسام في غشاء الخلية.
يحتوي البلازميد على عدد قليل من المناطق المهمة الجديرة بالذكر. تحتوي البلازميدات المتاحة تجاريا على موقع استنساخ متعدد أو MCS. تحتوي هذه المنطقة على تسلسلات محددة معترف بها بواسطة نوكليازات التقييد أو إنزيمات التقييد ، والتي تشق الحمض النووي. يمكن إدخال شظايا الحمض النووي التي تهم الباحث في موقع الاستنساخ المتعدد عندما يتم قطع البلازميد وجزء الحمض النووي بنفس نوكليازات داخلية.
تحتوي البلازميدات أيضا على أصل النسخ المتماثل ، أو ORI ، الذي يوفر معلومات للخلية حول المكان الذي يجب أن يبدأ فيه تكرار البلازميد.
بالإضافة إلى أصل النسخ المتماثل وموقع الاستنساخ المتعدد ، ستتضمن معظم البلازميدات جينا لمقاومة المضادات الحيوية. يمنح هذا الجين مقاومة للمضادات الحيوية لجميع الخلايا التي تحتوي على البلازميد ، مما يسمح لتلك الخلايا بالبقاء على قيد الحياة في الوسائط المحتوية على المضادات الحيوية.
الآن بعد أن ناقشنا البلازميدات ، دعنا نتحدث عن الخلايا التي سيتم إدخالها فيها: الخلايا المختصة. أكثر أنواع البكتيريا استخداما في أبحاث البيولوجيا الجزيئية والتحول هو الإشريكية القولونية ، والتي تصادف أنها تعيش أيضا في الأمعاء السفلية. عادة ما تكون الخلايا مختصة عن طريق التعرض لبيئة غنية بالكالسيوم.
تعمل الشحنات الموجبة لأيونات الكالسيوم على تحييد الشحنات السالبة لكل من البلازميد وجدار الخلية البكتيرية ، مما يؤدي إلى تبديد التنافر الكهروستاتيكي وإضعاف جدار الخلية.
من خلال تعريض الخلايا لارتفاع مفاجئ في درجة الحرارة ، أو صدمة حرارية ، يتم إنشاء فرق ضغط بين خارج الخلية وداخلها ، مما يؤدي إلى تكوين المسام ، والتي من خلالها يمكن أن يدخل الحمض النووي البلازميد فائق الالتفاف. بعد إعادة الخلايا إلى درجة حرارة طبيعية أكثر ، سوف يلتئم جدار الخلية ذاتيا.
بمجرد أن تمتص الخلايا البلازميد ، ستكون قادرة على النمو على ألواح أجار مليئة بالمضادات الحيوية.
قبل البدء في تحويل الصدمة الحرارية ، قم بتنظيف منطقة العمل وتأكد من تعقيم جميع المعدات.
تأكد من أن لديك ما يكفي من الوسائط والأجار المعدة ، والتي توفر التغذية للبكتيريا التي ستجعلها مؤهلة. تأكد أيضا من تعقيم جميع المحاليل عن طريق التعقيم. اترك الوسائط السائلة تبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام واترك الأجار يبرد إلى 50-55؟ C ، درجة الحرارة التي يمكن عندها إضافة المضاد الحيوي وسكب الأطباق. اترك الأطباق تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة لتتجمد.
عند العمل مع البكتيريا ، يجب على المرء دائما استخدام تقنية معقمة للحفاظ على العقم. تتضمن التقنية المعقمة عادة استخدام موقد بنسن لتعقيم الأدوات والكواشف وإنشاء تيار حراري؟ مما يحافظ على الملوثات المحمولة جوا خارج مساحة العمل.
مباشرة قبل تفاعل الصدمة الحرارية ، قم بتسخين الوسائط مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة وألواح LB أجار المحتوية على المضادات الحيوية إلى 37 درجة مئوية. تأكد أيضا من أن حمامك المائي عند 42 درجة مئوية
بعد ذلك ، قم بإذابة الخلايا المختصة كيميائيا على الجليد.
أضف ، 1-5uL من 1ng /؟ ل بلازميد بارد إلى الخلايا البكتيرية ، واخلطه برفق ، وأعد الخلية وخليط البلازميد إلى الجليد لمدة 30 دقيقة.
عندما يحين الوقت ، صدمة حرارية للخلية وخليط البلازميد عن طريق وضعه في حمام مائي عند 42؟ ج لمدة 30 ثانية.
مباشرة بعد إخراج الأنبوب من الحمام المائي ، ضعه على الثلج وأضف 450؟ L من الوسائط. ضعه في حاضنة اهتزاز لمدة 37؟ C لمدة 1 ساعة عند أكثر من 225 دورة في الدقيقة حتى تتمكن الخلايا من التعافي.
باستخدام تقنية التعقيم المناسبة ، أضف 20-200uL من البكتيريا إلى صفيحة أجار LB وانشر الوسط حولها باستخدام موزع بكتيري. احتضان الأطباق بين عشية وضحاها في سن 37؟ C رأسا على عقب لمنع تعرض البكتيريا للتكثيف.
في اليوم التالي ، تشكل البكتيريا التي أخذت البلازميد مستعمرات.
بعد ذلك ، احسب المستعمرات لحساب كفاءة التحويل ، وهي عدد المحولات الناجحة مقسوما على الكمية الإجمالية للحمض النووي المطلي.
الآن ، يمكن اختيار المستعمرات لمزيد من التجارب.
قبل أن تصبح مختصة ، يتم تخزين البكتيريا المستخدمة في التحول في الثلاجة. يجب إذابتها على الجليد ، ونشرها على طبق أجار؟ بدون مضادات حيوية ، ويسمح لها بالنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية
باستخدام تقنية معقمة ، حدد مستعمرة بكتيرية من صفيحة أجار وقم بزراعتها في مزرعة كبيرة سعة 500 مل بين عشية وضحاها في سن 37؟ ج في حاضنة اهتزاز؟ أداة تمنع ترسيب البكتيريا وحتى تشتت العناصر الغذائية في الوسائط.
أثناء نمو الخلايا ، تصنع 0.1 كلوريد كالسيوم مولار و 0.1 كلوريد كالسيوم مولار بالإضافة إلى 15٪ محاليل الجلسرين والأوتوكلاف واتركها تبرد.
تستخدم قياسات الامتصاص لتحديد ما إذا كانت البكتيريا في منتصف مرحلة نموها أم لا ، مما يعني أنها ستأخذ الحمض النووي بسهولة. بمجرد وصول الخلايا إلى هذه المرحلة ، ضعها على الجليد واحتفظ بها هناك طوال العملية.
بعد ذلك ، افصل الخلايا البكتيرية إلى أنبوبين كبيرين للطرد المركزي وتدور عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية وأعد تعليقها في حوالي 100 مل 0.1 مولار من كلوريد الكالسيوم البارد. ثم احتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة. تتكرر هذه الخطوة مرة أخرى على الأقل. غالبا ما يشار إلى دورات الخلايا الدوارة وإعادة التعليق بغسل خلاياك.
بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخلايا في محلول كلوريد الكالسيوم المولي البارد سعة 50 مل 0.1 مولي بالإضافة إلى محلول الجلسرين 15٪. هذه الخلايا الآن مؤهلة كيميائيا.
توزيع 50؟ L من البكتيريا في أنابيب متعددة للميكروفوجيوم وتخزينها عند -80؟ C حتى تصبح جاهزة للصدمة الحرارية.
توجد العديد من التطبيقات والاختلافات في التحول البكتيري.
بالإضافة إلى الصدمة الحرارية ، يعد التضخم الكهربائي تقنية شائعة أخرى للتحول. كما يوحي اسمه ، ينطوي التثقيب الكهربائي على استخدام الكهرباء لعمل مسام في غشاء الخلية البكتيرية التي يمكن أن يمر من خلالها الحمض النووي.
فيما يتعلق بفحص البكتيريا المحولة ، غالبا ما تحتوي البلازميدات على جين يشفر إنزيم بيتا جالاكتوزيداز للمساعدة في الفحص. عندما يتم تضمين ركيزة هذا الإنزيم في ألواح أجار ، فإن البكتيريا التي تم تحويلها باستخدام البلازميدات التي تحتوي على إدراج تنتج مستعمرات بيضاء ، في حين أن تلك التي لا تنتج مستعمرات زرقاء. يشار إلى هذه الطريقة باسم الفحص الأزرق والأبيض.
في معظم تجارب التحول ، يكون الهدف هو الحصول على بكتيريا سريعة الانقسام لإنتاج كميات كبيرة من البلازميد ، والذي يتضمن الجين المستهدف. بعد التحول البكتيري ، تتمثل الخطوة التالية في زراعة كميات كبيرة من البكتيريا في وسط سائل يحتوي على المضادات الحيوية وإجراء تنقية البلازميد ، والتي ، كما يوحي اسمها ، تنطوي على تنقية البلازميدات من البكتيريا. تتوفر العديد من المجموعات التجارية لهذا الغرض.
في بعض الأحيان يكون الهدف من التحول هو جعل البكتيريا تولد كميات كبيرة من البروتين المشفرة بواسطة البلازميد. هنا ترى الخلايا البكتيرية يتم تجانسها وتحللها قبل إجراء تقنية تسمى تنقية التقارب لعزل البروتين المستهدف. بعد تنقية كميات كبيرة من البروتين ، يمكن بعد ذلك تبلورها وتحديد بنية البروتين المعين ذي الأهمية.
لقد شاهدت للتو JoVE مقدمة لتحولات الصدمة الحرارية. في هذا الفيديو قمنا بمراجعة: ما هو تحول الصدمة الحرارية وكيف يعمل ، والمبدأ المدبر وراءه وكيفية تحويل البكتيريا بنجاح. شكرا للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and why is it used in bacterial transformation?
A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA molecule that can reduce its size through supercoiling, allowing it to pass through bacterial cell membrane pores. Plasmids contain a multiple cloning site for inserting DNA fragments, an origin of replication for DNA copying, and an antibiotic resistance gene that lets transformed cells survive in antibiotic-containing media.
Q2: How does calcium chloride make bacterial cells competent?
Calcium chloride creates a calcium-rich environment where positive calcium ions neutralize negative charges on both the plasmid DNA and bacterial cell wall. This neutralization reduces electrostatic repulsion and weakens the cell wall, preparing cells to take up foreign DNA during the heat shock procedure.
Q3: What happens during the heat shock step of bacterial transformation?
A sudden temperature increase to 42°C for 30 seconds creates a pressure difference between the cell's interior and exterior, inducing pore formation in the bacterial membrane. Supercoiled plasmid DNA enters through these pores. After heat shock, cells are immediately cooled on ice, allowing the cell wall to self-heal and stabilize the plasmid inside.
Q4: What is transformation efficiency and how is it calculated?
Transformation efficiency measures the success rate of the transformation procedure. It is calculated by dividing the number of successful transformants (colonies containing the plasmid) by the total amount of DNA plated. This metric helps researchers evaluate how effectively the heat shock method introduced plasmids into bacterial cells.
Q5: How are chemically competent cells prepared before heat shock transformation?
Bacteria are grown to mid-log phase, then centrifuged and washed multiple times with cold calcium chloride solution to remove growth media. After the final wash, cells are resuspended in calcium chloride plus 15% glycerol, distributed into microfuge tubes, and stored at -80°C until needed for transformation.
Q6: Why is aseptic technique important during bacterial transformation?
Aseptic technique maintains sterility throughout the transformation procedure by preventing airborne contaminants from entering the workspace. A Bunsen burner sterilizes instruments and reagents while creating a convection current that keeps contaminants away. This ensures that only the desired transformed bacteria grow on agar plates.
Q7: What happens after transformed bacteria are plated and what is the next step?
Plates are incubated overnight at 37°C upside down to prevent condensation exposure. The next day, colonies containing the plasmid are visible and can be counted to calculate transformation efficiency. Selected colonies can then be grown in antibiotic-containing liquid medium for plasmid purification isolation and purification of plasmid DNA for further experimentation.
الفصول في هذا الفيديو
0:00
Overview
0:50
Basic Principles of Heat Shock Transformation
3:34
The Heat Shock Reaction
6:26
Preparing Competent Cells
8:38
Applications
10:36
Summary