التحول البكتيري: طريقة الصدمة الحرارية
يُعد التحول البكتيري طريقة شائعة الاستخدام يتم من خلالها إدخال DNA غريب إلى البكتيريا، والتي يمكنها بعد ذلك تضخيم هذا الـ DNA أو استنساخه. وتُسمى الخلايا التي لديها القدرة على امتصاص هذا الـ DNA بسهولة بالخلايا المختصة. وبالرغم من أن عملية التحول تحدث بشكل طبيعي في العديد من أنواع البكتيريا، فقد وجد العلماء طرقاً لتحفيز وتعزيز كفاءة الخلية البكتيرية صناعياً. سنتحدث في هذا الفيديو عن إحدى هذه الطرق، وهي التحول بالصدمة الحرارية.
قبل أن نتحدث عن تقنية الصدمة الحرارية، دعونا نناقش أولاً نوع الحمض النووي الأكثر استخداماً في التحول البكتيري: البلازميد. البلازميد هو حمض نووي DNA صغير، دائري، ومزدوج السلسلة يمكنه تقليل حجمه عن طريق الالتفاف الفائق، بحيث يمكنه المرور بسهولة عبر المسام الموجودة في غشاء الخلية.
يحتوي البلازميد على عدة مناطق مهمة تستحق الذكر. تحتوي البلازميدات المتوفرة تجارياً على موقع استنساخ متعدد أو MCS. تحتوي هذه المنطقة على تسلسلات محددة تتعرف عليها إنزيمات القطع الداخلية أو إنزيمات القطع، التي تقوم بشطر الحمض النووي DNA. ويمكن إدخال قطع DNA التي تهم الباحث في موقع الاستنساخ المتعدد عندما يتم قطع البلازميد وقطعة DNA باستخدام نفس إنزيمات القطع الداخلية.
تحتوي البلازميدات أيضاً على أصل التضاعف، أو ORI، والذي يوفر معلومات للخلية حول المكان الذي يجب أن يبدأ منه تضاعف البلازميد.
بالإضافة إلى أصل التضاعف وموقع الاستنساخ المتعدد، تتضمن معظم البلازميدات جيناً لمقاومة المضادات الحيوية. يمنح هذا الجين مقاومة للمضادات الحيوية لجميع الخلايا التي تحتوي على البلازميد، مما يسمح لتلك الخلايا بالبقاء على قيد الحياة في الأوساط التي تحتوي على مضادات حيوية.
الآن بعد أن ناقشنا البلازميدات، دعونا نتحدث عن الخلايا التي سيتم إدخالها فيها: الخلايا المختصة. النوع الأكثر استخداماً من البكتيريا في أبحاث البيولوجيا الجزيئية والتحول هو E. coli، والتي تتواجد أيضاً في أمعائك الغليظة. عادةً ما يتم جعل الخلايا مختصة عن طريق تعريضها لبيئة غنية بالكالسيوم.
تعمل الشحنات الموجبة لأيونات الكالسيوم على تحييد الشحنات السالبة لكل من البلازميد وجدار الخلية البكتيرية، مما يؤدي إلى تبديد التنافر الإلكتروستاتيكي وإضعاف جدار الخلية.
من خلال تعريض الخلايا لزيادة مفاجئة في درجة الحرارة، أو الصدمة الحرارية، ينشأ فرق في الضغط بين الجزء الخارجي والداخلي للخلية، مما يحفز تكوين مسام يمكن من خلالها دخول الحمض النووي DNA للبلازميد الملتف فائقاً. وبعد إعادة الخلايا إلى درجة حرارة طبيعية، يقوم جدار الخلية بمعالجة نفسه تلقائياً.
بمجرد أن تمتص الخلايا البلازميد، ستصبح قادرة على النمو في أطباق الآجار الممزوجة بالمضادات الحيوية.
قبل البدء في عملية التحول بالصدمة الحرارية، قم بتنظيف منطقة العمل وتأكد من تعقيم جميع المعدات.
تأكد من تحضير كمية كافية من الأوساط الغذائية والآجار، والتي توفر التغذية للبكتيريا التي ستجعلها مختصة. كما يجب التأكد من تعقيم جميع المحاليل بواسطة الموصدة (autoclaving). اترك الأوساط السائلة تبرد حتى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام، واترك الآجار يبرد حتى 50-55˚C، وهي درجة الحرارة التي يمكن عندها إضافة المضاد الحيوي وصب الأطباق. اترك الأطباق تبرد حتى درجة حرارة الغرفة لتتصلب.
عند العمل مع البكتيريا، يجب دائمًا استخدام تقنية التعقيم (aseptic technique) للحفاظ على العقامة. تتضمن تقنية التعقيم عادةً استخدام موقد بنزن لتعقيم الأدوات والكواشف وخلق تيار حمل حراري – مما يمنع الملوثات المحمولة في الهواء من الدخول إلى منطقة العمل.
قبل تفاعل الصدمة الحرارية مباشرةً، قم بتدفئة الأوساط الغذائية مسبقًا لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، وأطباق آجار LB المحتوية على المضاد الحيوي إلى 37°C. تأكد أيضًا من أن الحمام المائي عند 42°C.
بعد ذلك، قم بإذابة الخلايا المختصة كيميائيًا على الثلج.
أضف 1-5uL من البلازميد البارد بتركيز 1ng/μL إلى الخلايا البكتيرية، واخلط بلطف، ثم أعد خليط الخلايا والبلازميد إلى الثلج لمدة 30 دقيقة.
عند انتهاء الوقت، قم بإجراء الصدمة الحرارية لخليط الخلايا والبلازميد عن طريق وضعه في حمام مائي عند 42˚C لمدة 30 ثانية.
مباشرة بعد إخراج الأنبوب من الحمام المائي، ضعه على الثلج وأضف 450μL من الوسط الغذائي. ضعه في حاضنة هزازة عند 37°C لمدة ساعة واحدة بسرعة تزيد عن 225 rpm لتمكين الخلايا من التعافي.
باستخدام تقنية التعقيم المناسبة، أضف 20-200uL من البكتيريا إلى طبق آجار LB ووزع الوسط حول الطبق باستخدام ناشر بكتيري. قم بتحضين الأطباق طوال الليل عند 37˚C بشكل مقلوب لمنع تعرض البكتيريا للتكثيف.
في اليوم التالي، تشكل البكتيريا التي استقبلت البلازميد مستعمرات.
بعد ذلك، قم بعدّ المستعمرات لحساب كفاءة التحول، وهي عدد المحولات الناجحة مقسومة على الكمية الإجمالية من DNA التي تم وضعها في الأطباق.
الآن، يمكن اختيار المستعمرات لإجراء مزيد من التجارب.
تُخزن البكتيريا المستخدمة في عملية التحول في المجمد قبل جعلها كفؤة. ويجب إذابتها على الثلج، وفردها على طبق آغار - خالي من المضادات الحيوية، وتركها لتنمو طوال الليل عند 37˚C.
باستخدام تقنية التعقيم، اختر مستعمرة بكتيرية من طبق الآغار وقم بتنميتها في مزرعة كبيرة سعة 500 ml طوال الليل عند 37˚C في حاضنة هزازة - وهي جهاز يمنع ترسب البكتيريا ويضمن توزيع العناصر الغذائية بشكل متساوٍ في الوسط الزرعي.
أثناء نمو الخلايا، قم بتحضير محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar ومحلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar مضافاً إليه 15% glycerol، ثم قم بتعقيمهما باستخدام الأوتوكلاف واتركهما ليبردا.
تُستخدم قياسات الامتصاصية لتحديد ما إذا كانت البكتيريا في مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط (mid-log phase) من عدمه، وهي المرحلة التي تكون فيها الخلايا مستعدة لامتصاص DNA بسهولة. وبمجرد وصول الخلايا إلى هذه المرحلة، ضعها على الثلج وأبقِها هناك طوال فترة الإجراء.
بعد ذلك، افصل الخلايا البكتيرية إلى أنبوبي طرد مركزي كبيرين وقم بدورانهما عند 4°C. اسكب السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في حوالي 100 ml من كلوريد الكالسيوم البارد بتركيز 0.1 molar. ثم حضن الخلايا على الثلج لمدة 30 دقيقة. وتكرر هذه الخطوة مرة واحدة أخرى على الأقل. وغالباً ما يشار إلى دورات الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا باسم غسل الخلايا.
بعد الغسلة النهائية، أعد تعليق الخلايا في 50mL باردة من محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar مضافاً إليه 15% glycerol. وتصبح هذه الخلايا الآن كفؤة كيميائياً.
وزع 50μL من البكتيريا في عدة أنابيب طرد مركزي دقيقة (microfuge tubes) واحفظها عند -80˚C حتى يحين موعد الصدمة الحرارية.
توجد العديد من التطبيقات والمتغيرات لعملية التحول البكتيري.
بالإضافة إلى الصدمة الحرارية، يعد التثقيب الكهربائي تقنية شائعة أخرى للتحول. وكما يوحي اسمه، يتضمن التثقيب الكهربائي استخدام الكهرباء لإحداث ثقوب في غشاء الخلية البكتيرية يمكن من خلالها مرور DNA.
وفيما يتعلق بفحص البكتيريا المتحولة، غالبًا ما تحتوي البلازميدات على جين يشفر لإنزيم beta-galactosidase للمساعدة في عملية الفحص. وعندما يتم تضمين المادة الركيزة لهذا الإنزيم في أطباق الآجار، فإن البكتيريا التي تحولت بواسطة بلازميدات تحتوي على قطعة مدرجة تعطي مستعمرات بيضاء، بينما تعطي البكتيريا التي لا تحتوي عليها مستعمرات زرقاء. وتُعرف هذه الطريقة باسم الفحص الأزرق والأبيض.
في معظم تجارب التحول، يكون الهدف هو الحصول على بكتيريا سريعة الانقسام لإنتاج كميات كبيرة من البلازميد الخاص بك، والذي يتضمن الجين المستهدف. بعد التحول البكتيري، تتمثل الخطوة التالية في تنمية كميات كبيرة من البكتيريا في وسط سائل يحتوي على مضادات حيوية وإجراء تنقية البلازميد، والتي تتضمن، كما يشير اسمها، تنقية البلازميدات من البكتيريا. وتتوفر العديد من المجموعات التجارية المجهزة لهذا الغرض.
أحيانًا يكون الهدف من التحول هو جعل البكتيريا تنتج كميات كبيرة من البروتين الذي يشفره البلازميد. ترى هنا الخلايا البكتيرية يتم تجانسها وتحليلها قبل إجراء تقنية تسمى التنقية بالألفة لعزل البروتين المستهدف. وبعد تنقية كميات كبيرة من البروتين، يمكن بلورته ومن ثم تحديد بنية البروتين المعني.
لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول تحويلات الصدمة الحرارية. لقد استعرضنا في هذا الفيديو: ماهية تحويل الصدمة الحرارية وآلية عمله، والمبدأ الذي يقوم عليه، وكيفية تحويل البكتيريا بنجاح. شكراً للمشاهدة!
التحول هو العملية التي تحدث عندما تمتص الخلية DNA غريباً من محيطها. ويمكن أن يحدث التحول في الطبيعة في أنواع معينة من البكتيريا. وفي البيولوجيا الجزيئ…
يُعد التحول البكتيري طريقة شائعة الاستخدام يتم من خلالها إدخال DNA غريب إلى البكتيريا، والتي يمكنها بعد ذلك تضخيم هذا الـ DNA أو استنساخه. وتُسمى الخلايا التي لديها القدرة على امتصاص هذا الـ DNA بسهولة بالخلايا المختصة. وبالرغم من أن عملية التحول تحدث بشكل طبيعي في العديد من أنواع البكتيريا، فقد وجد العلماء طرقاً لتحفيز وتعزيز كفاءة الخلية البكتيرية صناعياً. سنتحدث في هذا الفيديو عن إحدى هذه الطرق، وهي التحول بالصدمة الحرارية.
قبل أن نتحدث عن تقنية الصدمة الحرارية، دعونا نناقش أولاً نوع الحمض النووي الأكثر استخداماً في التحول البكتيري: البلازميد. البلازميد هو حمض نووي DNA صغير، دائري، ومزدوج السلسلة يمكنه تقليل حجمه عن طريق الالتفاف الفائق، بحيث يمكنه المرور بسهولة عبر المسام الموجودة في غشاء الخلية.
يحتوي البلازميد على عدة مناطق مهمة تستحق الذكر. تحتوي البلازميدات المتوفرة تجارياً على موقع استنساخ متعدد أو MCS. تحتوي هذه المنطقة على تسلسلات محددة تتعرف عليها إنزيمات القطع الداخلية أو إنزيمات القطع، التي تقوم بشطر الحمض النووي DNA. ويمكن إدخال قطع DNA التي تهم الباحث في موقع الاستنساخ المتعدد عندما يتم قطع البلازميد وقطعة DNA باستخدام نفس إنزيمات القطع الداخلية.
تحتوي البلازميدات أيضاً على أصل التضاعف، أو ORI، والذي يوفر معلومات للخلية حول المكان الذي يجب أن يبدأ منه تضاعف البلازميد.
بالإضافة إلى أصل التضاعف وموقع الاستنساخ المتعدد، تتضمن معظم البلازميدات جيناً لمقاومة المضادات الحيوية. يمنح هذا الجين مقاومة للمضادات الحيوية لجميع الخلايا التي تحتوي على البلازميد، مما يسمح لتلك الخلايا بالبقاء على قيد الحياة في الأوساط التي تحتوي على مضادات حيوية.
الآن بعد أن ناقشنا البلازميدات، دعونا نتحدث عن الخلايا التي سيتم إدخالها فيها: الخلايا المختصة. النوع الأكثر استخداماً من البكتيريا في أبحاث البيولوجيا الجزيئية والتحول هو E. coli، والتي تتواجد أيضاً في أمعائك الغليظة. عادةً ما يتم جعل الخلايا مختصة عن طريق تعريضها لبيئة غنية بالكالسيوم.
تعمل الشحنات الموجبة لأيونات الكالسيوم على تحييد الشحنات السالبة لكل من البلازميد وجدار الخلية البكتيرية، مما يؤدي إلى تبديد التنافر الإلكتروستاتيكي وإضعاف جدار الخلية.
من خلال تعريض الخلايا لزيادة مفاجئة في درجة الحرارة، أو الصدمة الحرارية، ينشأ فرق في الضغط بين الجزء الخارجي والداخلي للخلية، مما يحفز تكوين مسام يمكن من خلالها دخول الحمض النووي DNA للبلازميد الملتف فائقاً. وبعد إعادة الخلايا إلى درجة حرارة طبيعية، يقوم جدار الخلية بمعالجة نفسه تلقائياً.
بمجرد أن تمتص الخلايا البلازميد، ستصبح قادرة على النمو في أطباق الآجار الممزوجة بالمضادات الحيوية.
قبل البدء في عملية التحول بالصدمة الحرارية، قم بتنظيف منطقة العمل وتأكد من تعقيم جميع المعدات.
تأكد من تحضير كمية كافية من الأوساط الغذائية والآجار، والتي توفر التغذية للبكتيريا التي ستجعلها مختصة. كما يجب التأكد من تعقيم جميع المحاليل بواسطة الموصدة (autoclaving). اترك الأوساط السائلة تبرد حتى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام، واترك الآجار يبرد حتى 50-55˚C، وهي درجة الحرارة التي يمكن عندها إضافة المضاد الحيوي وصب الأطباق. اترك الأطباق تبرد حتى درجة حرارة الغرفة لتتصلب.
عند العمل مع البكتيريا، يجب دائمًا استخدام تقنية التعقيم (aseptic technique) للحفاظ على العقامة. تتضمن تقنية التعقيم عادةً استخدام موقد بنزن لتعقيم الأدوات والكواشف وخلق تيار حمل حراري – مما يمنع الملوثات المحمولة في الهواء من الدخول إلى منطقة العمل.
قبل تفاعل الصدمة الحرارية مباشرةً، قم بتدفئة الأوساط الغذائية مسبقًا لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، وأطباق آجار LB المحتوية على المضاد الحيوي إلى 37°C. تأكد أيضًا من أن الحمام المائي عند 42°C.
بعد ذلك، قم بإذابة الخلايا المختصة كيميائيًا على الثلج.
أضف 1-5uL من البلازميد البارد بتركيز 1ng/μL إلى الخلايا البكتيرية، واخلط بلطف، ثم أعد خليط الخلايا والبلازميد إلى الثلج لمدة 30 دقيقة.
عند انتهاء الوقت، قم بإجراء الصدمة الحرارية لخليط الخلايا والبلازميد عن طريق وضعه في حمام مائي عند 42˚C لمدة 30 ثانية.
مباشرة بعد إخراج الأنبوب من الحمام المائي، ضعه على الثلج وأضف 450μL من الوسط الغذائي. ضعه في حاضنة هزازة عند 37°C لمدة ساعة واحدة بسرعة تزيد عن 225 rpm لتمكين الخلايا من التعافي.
باستخدام تقنية التعقيم المناسبة، أضف 20-200uL من البكتيريا إلى طبق آجار LB ووزع الوسط حول الطبق باستخدام ناشر بكتيري. قم بتحضين الأطباق طوال الليل عند 37˚C بشكل مقلوب لمنع تعرض البكتيريا للتكثيف.
في اليوم التالي، تشكل البكتيريا التي استقبلت البلازميد مستعمرات.
بعد ذلك، قم بعدّ المستعمرات لحساب كفاءة التحول، وهي عدد المحولات الناجحة مقسومة على الكمية الإجمالية من DNA التي تم وضعها في الأطباق.
الآن، يمكن اختيار المستعمرات لإجراء مزيد من التجارب.
تُخزن البكتيريا المستخدمة في عملية التحول في المجمد قبل جعلها كفؤة. ويجب إذابتها على الثلج، وفردها على طبق آغار - خالي من المضادات الحيوية، وتركها لتنمو طوال الليل عند 37˚C.
باستخدام تقنية التعقيم، اختر مستعمرة بكتيرية من طبق الآغار وقم بتنميتها في مزرعة كبيرة سعة 500 ml طوال الليل عند 37˚C في حاضنة هزازة - وهي جهاز يمنع ترسب البكتيريا ويضمن توزيع العناصر الغذائية بشكل متساوٍ في الوسط الزرعي.
أثناء نمو الخلايا، قم بتحضير محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar ومحلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar مضافاً إليه 15% glycerol، ثم قم بتعقيمهما باستخدام الأوتوكلاف واتركهما ليبردا.
تُستخدم قياسات الامتصاصية لتحديد ما إذا كانت البكتيريا في مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط (mid-log phase) من عدمه، وهي المرحلة التي تكون فيها الخلايا مستعدة لامتصاص DNA بسهولة. وبمجرد وصول الخلايا إلى هذه المرحلة، ضعها على الثلج وأبقِها هناك طوال فترة الإجراء.
بعد ذلك، افصل الخلايا البكتيرية إلى أنبوبي طرد مركزي كبيرين وقم بدورانهما عند 4°C. اسكب السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في حوالي 100 ml من كلوريد الكالسيوم البارد بتركيز 0.1 molar. ثم حضن الخلايا على الثلج لمدة 30 دقيقة. وتكرر هذه الخطوة مرة واحدة أخرى على الأقل. وغالباً ما يشار إلى دورات الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا باسم غسل الخلايا.
بعد الغسلة النهائية، أعد تعليق الخلايا في 50mL باردة من محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar مضافاً إليه 15% glycerol. وتصبح هذه الخلايا الآن كفؤة كيميائياً.
وزع 50μL من البكتيريا في عدة أنابيب طرد مركزي دقيقة (microfuge tubes) واحفظها عند -80˚C حتى يحين موعد الصدمة الحرارية.
توجد العديد من التطبيقات والمتغيرات لعملية التحول البكتيري.
بالإضافة إلى الصدمة الحرارية، يعد التثقيب الكهربائي تقنية شائعة أخرى للتحول. وكما يوحي اسمه، يتضمن التثقيب الكهربائي استخدام الكهرباء لإحداث ثقوب في غشاء الخلية البكتيرية يمكن من خلالها مرور DNA.
وفيما يتعلق بفحص البكتيريا المتحولة، غالبًا ما تحتوي البلازميدات على جين يشفر لإنزيم beta-galactosidase للمساعدة في عملية الفحص. وعندما يتم تضمين المادة الركيزة لهذا الإنزيم في أطباق الآجار، فإن البكتيريا التي تحولت بواسطة بلازميدات تحتوي على قطعة مدرجة تعطي مستعمرات بيضاء، بينما تعطي البكتيريا التي لا تحتوي عليها مستعمرات زرقاء. وتُعرف هذه الطريقة باسم الفحص الأزرق والأبيض.
في معظم تجارب التحول، يكون الهدف هو الحصول على بكتيريا سريعة الانقسام لإنتاج كميات كبيرة من البلازميد الخاص بك، والذي يتضمن الجين المستهدف. بعد التحول البكتيري، تتمثل الخطوة التالية في تنمية كميات كبيرة من البكتيريا في وسط سائل يحتوي على مضادات حيوية وإجراء تنقية البلازميد، والتي تتضمن، كما يشير اسمها، تنقية البلازميدات من البكتيريا. وتتوفر العديد من المجموعات التجارية المجهزة لهذا الغرض.
أحيانًا يكون الهدف من التحول هو جعل البكتيريا تنتج كميات كبيرة من البروتين الذي يشفره البلازميد. ترى هنا الخلايا البكتيرية يتم تجانسها وتحليلها قبل إجراء تقنية تسمى التنقية بالألفة لعزل البروتين المستهدف. وبعد تنقية كميات كبيرة من البروتين، يمكن بلورته ومن ثم تحديد بنية البروتين المعني.
لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول تحويلات الصدمة الحرارية. لقد استعرضنا في هذا الفيديو: ماهية تحويل الصدمة الحرارية وآلية عمله، والمبدأ الذي يقوم عليه، وكيفية تحويل البكتيريا بنجاح. شكراً للمشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
يُعد التحول البكتيري طريقة شائعة الاستخدام يتم من خلالها إدخال DNA غريب إلى البكتيريا، والتي يمكنها بعد ذلك تضخيم هذا الـ DNA أو استنساخه. وتُسمى الخلايا التي لديها القدرة على امتصاص هذا الـ DNA بسهولة بالخلايا المختصة. وبالرغم من أن عملية التحول تحدث بشكل طبيعي في العديد من أنواع البكتيريا، فقد وجد العلماء طرقاً لتحفيز وتعزيز كفاءة الخلية البكتيرية صناعياً. سنتحدث في هذا الفيديو عن إحدى هذه الطرق، وهي التحول بالصدمة الحرارية.
قبل أن نتحدث عن تقنية الصدمة الحرارية، دعونا نناقش أولاً نوع الحمض النووي الأكثر استخداماً في التحول البكتيري: البلازميد. البلازميد هو حمض نووي DNA صغير، دائري، ومزدوج السلسلة يمكنه تقليل حجمه عن طريق الالتفاف الفائق، بحيث يمكنه المرور بسهولة عبر المسام الموجودة في غشاء الخلية.
يحتوي البلازميد على عدة مناطق مهمة تستحق الذكر. تحتوي البلازميدات المتوفرة تجارياً على موقع استنساخ متعدد أو MCS. تحتوي هذه المنطقة على تسلسلات محددة تتعرف عليها إنزيمات القطع الداخلية أو إنزيمات القطع، التي تقوم بشطر الحمض النووي DNA. ويمكن إدخال قطع DNA التي تهم الباحث في موقع الاستنساخ المتعدد عندما يتم قطع البلازميد وقطعة DNA باستخدام نفس إنزيمات القطع الداخلية.
تحتوي البلازميدات أيضاً على أصل التضاعف، أو ORI، والذي يوفر معلومات للخلية حول المكان الذي يجب أن يبدأ منه تضاعف البلازميد.
بالإضافة إلى أصل التضاعف وموقع الاستنساخ المتعدد، تتضمن معظم البلازميدات جيناً لمقاومة المضادات الحيوية. يمنح هذا الجين مقاومة للمضادات الحيوية لجميع الخلايا التي تحتوي على البلازميد، مما يسمح لتلك الخلايا بالبقاء على قيد الحياة في الأوساط التي تحتوي على مضادات حيوية.
الآن بعد أن ناقشنا البلازميدات، دعونا نتحدث عن الخلايا التي سيتم إدخالها فيها: الخلايا المختصة. النوع الأكثر استخداماً من البكتيريا في أبحاث البيولوجيا الجزيئية والتحول هو E. coli، والتي تتواجد أيضاً في أمعائك الغليظة. عادةً ما يتم جعل الخلايا مختصة عن طريق تعريضها لبيئة غنية بالكالسيوم.
تعمل الشحنات الموجبة لأيونات الكالسيوم على تحييد الشحنات السالبة لكل من البلازميد وجدار الخلية البكتيرية، مما يؤدي إلى تبديد التنافر الإلكتروستاتيكي وإضعاف جدار الخلية.
من خلال تعريض الخلايا لزيادة مفاجئة في درجة الحرارة، أو الصدمة الحرارية، ينشأ فرق في الضغط بين الجزء الخارجي والداخلي للخلية، مما يحفز تكوين مسام يمكن من خلالها دخول الحمض النووي DNA للبلازميد الملتف فائقاً. وبعد إعادة الخلايا إلى درجة حرارة طبيعية، يقوم جدار الخلية بمعالجة نفسه تلقائياً.
بمجرد أن تمتص الخلايا البلازميد، ستصبح قادرة على النمو في أطباق الآجار الممزوجة بالمضادات الحيوية.
قبل البدء في عملية التحول بالصدمة الحرارية، قم بتنظيف منطقة العمل وتأكد من تعقيم جميع المعدات.
تأكد من تحضير كمية كافية من الأوساط الغذائية والآجار، والتي توفر التغذية للبكتيريا التي ستجعلها مختصة. كما يجب التأكد من تعقيم جميع المحاليل بواسطة الموصدة (autoclaving). اترك الأوساط السائلة تبرد حتى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام، واترك الآجار يبرد حتى 50-55˚C، وهي درجة الحرارة التي يمكن عندها إضافة المضاد الحيوي وصب الأطباق. اترك الأطباق تبرد حتى درجة حرارة الغرفة لتتصلب.
عند العمل مع البكتيريا، يجب دائمًا استخدام تقنية التعقيم (aseptic technique) للحفاظ على العقامة. تتضمن تقنية التعقيم عادةً استخدام موقد بنزن لتعقيم الأدوات والكواشف وخلق تيار حمل حراري – مما يمنع الملوثات المحمولة في الهواء من الدخول إلى منطقة العمل.
قبل تفاعل الصدمة الحرارية مباشرةً، قم بتدفئة الأوساط الغذائية مسبقًا لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، وأطباق آجار LB المحتوية على المضاد الحيوي إلى 37°C. تأكد أيضًا من أن الحمام المائي عند 42°C.
بعد ذلك، قم بإذابة الخلايا المختصة كيميائيًا على الثلج.
أضف 1-5uL من البلازميد البارد بتركيز 1ng/μL إلى الخلايا البكتيرية، واخلط بلطف، ثم أعد خليط الخلايا والبلازميد إلى الثلج لمدة 30 دقيقة.
عند انتهاء الوقت، قم بإجراء الصدمة الحرارية لخليط الخلايا والبلازميد عن طريق وضعه في حمام مائي عند 42˚C لمدة 30 ثانية.
مباشرة بعد إخراج الأنبوب من الحمام المائي، ضعه على الثلج وأضف 450μL من الوسط الغذائي. ضعه في حاضنة هزازة عند 37°C لمدة ساعة واحدة بسرعة تزيد عن 225 rpm لتمكين الخلايا من التعافي.
باستخدام تقنية التعقيم المناسبة، أضف 20-200uL من البكتيريا إلى طبق آجار LB ووزع الوسط حول الطبق باستخدام ناشر بكتيري. قم بتحضين الأطباق طوال الليل عند 37˚C بشكل مقلوب لمنع تعرض البكتيريا للتكثيف.
في اليوم التالي، تشكل البكتيريا التي استقبلت البلازميد مستعمرات.
بعد ذلك، قم بعدّ المستعمرات لحساب كفاءة التحول، وهي عدد المحولات الناجحة مقسومة على الكمية الإجمالية من DNA التي تم وضعها في الأطباق.
الآن، يمكن اختيار المستعمرات لإجراء مزيد من التجارب.
تُخزن البكتيريا المستخدمة في عملية التحول في المجمد قبل جعلها كفؤة. ويجب إذابتها على الثلج، وفردها على طبق آغار - خالي من المضادات الحيوية، وتركها لتنمو طوال الليل عند 37˚C.
باستخدام تقنية التعقيم، اختر مستعمرة بكتيرية من طبق الآغار وقم بتنميتها في مزرعة كبيرة سعة 500 ml طوال الليل عند 37˚C في حاضنة هزازة - وهي جهاز يمنع ترسب البكتيريا ويضمن توزيع العناصر الغذائية بشكل متساوٍ في الوسط الزرعي.
أثناء نمو الخلايا، قم بتحضير محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar ومحلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar مضافاً إليه 15% glycerol، ثم قم بتعقيمهما باستخدام الأوتوكلاف واتركهما ليبردا.
تُستخدم قياسات الامتصاصية لتحديد ما إذا كانت البكتيريا في مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط (mid-log phase) من عدمه، وهي المرحلة التي تكون فيها الخلايا مستعدة لامتصاص DNA بسهولة. وبمجرد وصول الخلايا إلى هذه المرحلة، ضعها على الثلج وأبقِها هناك طوال فترة الإجراء.
بعد ذلك، افصل الخلايا البكتيرية إلى أنبوبي طرد مركزي كبيرين وقم بدورانهما عند 4°C. اسكب السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في حوالي 100 ml من كلوريد الكالسيوم البارد بتركيز 0.1 molar. ثم حضن الخلايا على الثلج لمدة 30 دقيقة. وتكرر هذه الخطوة مرة واحدة أخرى على الأقل. وغالباً ما يشار إلى دورات الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا باسم غسل الخلايا.
بعد الغسلة النهائية، أعد تعليق الخلايا في 50mL باردة من محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar مضافاً إليه 15% glycerol. وتصبح هذه الخلايا الآن كفؤة كيميائياً.
وزع 50μL من البكتيريا في عدة أنابيب طرد مركزي دقيقة (microfuge tubes) واحفظها عند -80˚C حتى يحين موعد الصدمة الحرارية.
توجد العديد من التطبيقات والمتغيرات لعملية التحول البكتيري.
بالإضافة إلى الصدمة الحرارية، يعد التثقيب الكهربائي تقنية شائعة أخرى للتحول. وكما يوحي اسمه، يتضمن التثقيب الكهربائي استخدام الكهرباء لإحداث ثقوب في غشاء الخلية البكتيرية يمكن من خلالها مرور DNA.
وفيما يتعلق بفحص البكتيريا المتحولة، غالبًا ما تحتوي البلازميدات على جين يشفر لإنزيم beta-galactosidase للمساعدة في عملية الفحص. وعندما يتم تضمين المادة الركيزة لهذا الإنزيم في أطباق الآجار، فإن البكتيريا التي تحولت بواسطة بلازميدات تحتوي على قطعة مدرجة تعطي مستعمرات بيضاء، بينما تعطي البكتيريا التي لا تحتوي عليها مستعمرات زرقاء. وتُعرف هذه الطريقة باسم الفحص الأزرق والأبيض.
في معظم تجارب التحول، يكون الهدف هو الحصول على بكتيريا سريعة الانقسام لإنتاج كميات كبيرة من البلازميد الخاص بك، والذي يتضمن الجين المستهدف. بعد التحول البكتيري، تتمثل الخطوة التالية في تنمية كميات كبيرة من البكتيريا في وسط سائل يحتوي على مضادات حيوية وإجراء تنقية البلازميد، والتي تتضمن، كما يشير اسمها، تنقية البلازميدات من البكتيريا. وتتوفر العديد من المجموعات التجارية المجهزة لهذا الغرض.
أحيانًا يكون الهدف من التحول هو جعل البكتيريا تنتج كميات كبيرة من البروتين الذي يشفره البلازميد. ترى هنا الخلايا البكتيرية يتم تجانسها وتحليلها قبل إجراء تقنية تسمى التنقية بالألفة لعزل البروتين المستهدف. وبعد تنقية كميات كبيرة من البروتين، يمكن بلورته ومن ثم تحديد بنية البروتين المعني.
لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول تحويلات الصدمة الحرارية. لقد استعرضنا في هذا الفيديو: ماهية تحويل الصدمة الحرارية وآلية عمله، والمبدأ الذي يقوم عليه، وكيفية تحويل البكتيريا بنجاح. شكراً للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and why is it used in bacterial transformation?
A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA molecule that can reduce its size through supercoiling, allowing it to pass through bacterial cell membrane pores. Plasmids contain a multiple cloning site for inserting DNA fragments, an origin of replication for DNA copying, and an antibiotic resistance gene that lets transformed cells survive in antibiotic-containing media.
Q2: How does calcium chloride make bacterial cells competent?
Calcium chloride creates a calcium-rich environment where positive calcium ions neutralize negative charges on both the plasmid DNA and bacterial cell wall. This neutralization reduces electrostatic repulsion and weakens the cell wall, preparing cells to take up foreign DNA during the heat shock procedure.
Q3: What happens during the heat shock step of bacterial transformation?
A sudden temperature increase to 42°C for 30 seconds creates a pressure difference between the cell's interior and exterior, inducing pore formation in the bacterial membrane. Supercoiled plasmid DNA enters through these pores. After heat shock, cells are immediately cooled on ice, allowing the cell wall to self-heal and stabilize the plasmid inside.
Q4: What is transformation efficiency and how is it calculated?
Transformation efficiency measures the success rate of the transformation procedure. It is calculated by dividing the number of successful transformants (colonies containing the plasmid) by the total amount of DNA plated. This metric helps researchers evaluate how effectively the heat shock method introduced plasmids into bacterial cells.
Q5: How are chemically competent cells prepared before heat shock transformation?
Bacteria are grown to mid-log phase, then centrifuged and washed multiple times with cold calcium chloride solution to remove growth media. After the final wash, cells are resuspended in calcium chloride plus 15% glycerol, distributed into microfuge tubes, and stored at -80°C until needed for transformation.
Q6: Why is aseptic technique important during bacterial transformation?
Aseptic technique maintains sterility throughout the transformation procedure by preventing airborne contaminants from entering the workspace. A Bunsen burner sterilizes instruments and reagents while creating a convection current that keeps contaminants away. This ensures that only the desired transformed bacteria grow on agar plates.
Q7: What happens after transformed bacteria are plated and what is the next step?
Plates are incubated overnight at 37°C upside down to prevent condensation exposure. The next day, colonies containing the plasmid are visible and can be counted to calculate transformation efficiency. Selected colonies can then be grown in antibiotic-containing liquid medium for plasmid purification isolation and purification of plasmid DNA for further experimentation.
Browse More Videos
الفصول في هذا الفيديو
0:00
Overview
0:50
Basic Principles of Heat Shock Transformation
3:34
The Heat Shock Reaction
6:26
Preparing Competent Cells
8:38
Applications
10:36
Summary